Method Article

유기 용매 기반 추출 및 침전법을 이용한 대 장균 에서 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)의 효율적 정제

DOI:

10.3791/69465

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January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 대장균에서 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)를 정제하기 위한 빠르고 재현 가능한 유기 용매 기반 추출 및 침전 방법을 설명 하며, 기존 ELP 정제 방법에 대한 확장 가능한 대안을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)는 포유류 트로포엘라스틴에서 발견되는 모티프를 모방하는 반복적인 펜타펩타이드 서열로 구성된 인공 생체고분자입니다. 이들의 독특한 특성 덕분에 약물 및 유전자 전달부터 조직 공학, 표적 분자 영상에 이르기까지 다양한 생의학 응용 분야에 이상적인 후보가 됩니다. 대 장균 (E. coli) 발현에서 기존의 정제 방법은 포함체가 형성되기 때문에 ELP에 효과가 없을 수 있습니다. 역전이 사이클링(ITC)과 같은 다른 방법은 ELP의 낮은 임계 용액 온도(LCST) 특성을 이용해 지지다당류(LPS)와 같은 오염물질로부터 분리하지만, 일반적으로 여러 차례의 가열 및 냉각 단계를 거쳐 시간이 많이 소요되고 ELP 구성체의 서열, 농도, 분자량에 따라 회수율이 낮을 수 있습니다. 이러한 도전을 해결하기 위해, 우리는 ELP의 내재적 소수성을 활용한 유기용 용매 기반 추출-침전 워크플로우를 개발하여 대장균 세포 펠릿에서 직접 빠르고 견고하며 광범위하게 정제할 수 있게 했습니다. 이 방법은 극성 유기 용매를 사용하여 세포 파괴를 돕고 ELP를 한 단계로 선택적으로 용해시킵니다. 이후 침전 단계에서는 잔류 유기 용매, 저분자량 불순물, 내독소를 효과적으로 제거하여, 3시간 이내에 LPS 농도가 1 EU/mL 이하인 고순도 ELP를 생성합니다. 원자력현미경 데이터는 이러한 방식으로 정제된 ELP-융합 단백질이 융합 단백질 기능을 유지하는 역방향 미셀 유사 구조로 자기 조립할 수 있음을 시사합니다. 이 빠른 정제 방법은 연구자들에게 ELP를 정제하는 직관적이고 확장 가능한 방법을 제공하며, ELP와 그 융합 단백질을 재료 및 생의학 응용 분야의 유연한 구성 요소로 활용할 새로운 가능성을 창출합니다.

Introduction

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엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)는 반복되는 (VPGXG)n 모티프 1,2,2,3,4,5,6,7,8,9로 구성된 생체고분체입니다. 펜타펩타이드 단위의 게스트 잔기 X는 프로린을 제외한 모든 아미노산일 수 있습니다. X의 변형은 ELP 구성체의 소수성, 열 전이 거동 및 기능적 특성을 조정하여 모듈형 생체 적합성 재료를 만드는 데 사용될 수 있으며, 이는 다양한 생의학 응용 분야에서 널리 탐구되고 있습니다10, 11, 12.

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Protocol

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1. 재료 준비

  1. 박테리아 균주: 대 장균 BL21(DE3) 화학적으로 적합한 세포를 발현 숙주로 사용하세요.
    참고: 이들은 높은 형질전환 효율과 재조합 단백질 생산에 적합하다는 점에서 선정되었습니다.
  2. 발현 플라스미드: 암피실린 저항성을 가진 ELP-I-Cm2 융합 단백질을 암호화하는 pET21(+) 벡터 사용. AddGene에서 플라스미드 벡터를 구매하세요. 인테인 끝에 있는 BsrG I 부위를 사용하여 Cm2 유전자를 삽입합니다.
    참고: 이 단백질의 플라스미드 DNA 서열은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.
  3. 성장 배지: 1200 mL 배지용 Terrific Broth(TB) 배지 준비
    1. 트립톤 16g, 효모 추출물 32g, 프로린 16g, 글리세롤 6.8mL, 초순수 1100mL를 첨가하여 배지를 준비합니다. 모든 성분을 녹이도록 충분히 섞으세요. 최종 부피를 초순수수로 1200mL로 조절하세요.
    2. 2부를 위해 23.1g KH2PO4 와 125.4g K2

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Results

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프로토콜의 마지막 단계를 거친 후, 다음 단계는 SDS-PAGE 분석과 쿠매시 블루 염색을 통해 추출-침전 결과를 시각화하는 것입니다. 유기 추출 전에 용해 단계가 있을 때는 뚜렷한 ELP 밴드가 나타나야 합니다. ELP-I-Cm2의 경우, 이 밴드는 100 kDa에서 나타납니다(그림 3A).

다양한 유기 용매 조합의 스크리닝 결과, 추출 효율이 다양하게 나타나며(그림 3B), 각 조합은 서로 다른 농도와 순도를 만들어냈다. 우리는 융합 단백질의 순도와 기능 분석에 기반해 추출-침전의 최적의 조합을 선택하여 해당 구성물의 대규모 ELP 정제에 사용할 것입니다. AG(이소프로판올:아세토니트릴)와 BG(부탄올:아세토니트릴) 1:1 혼합물은 ELP-I-Cm2의 경우 다른 조합들에 비해 가장 높은 단백질 회수율(2.2-2.......

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Discussion

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ITC는 이전에 ELP19의 비크로마토그래피 정제에 사용된 바 있습니다; 하지만 시간이 많이 걸리고 수확률이 낮을 수 있습니다. 위에서 설명한 방법에서는 ELP-I-Cm2 융합 단백질의 신속 정제 방법을 설명하며, 유기 용매 기반 추출-침전 방법이 다양한 ELP 및 ELP 융합의 정제에 효과적으로 활용될 수 있음을 보여줍니다. 유기 용매 프로토콜은 ITC보다 빠를 뿐만 아니라, ITC 방법에 도전할 수 있는 짧은 ELP 서열에 훨씬 더 효과적입니다. 산업 응용 분야에서는 ITC보다 더 확장 가능한 대안이 될 수도 있습니다. 이 방법은 각 단계에서 핵산, LPS, 대사산물, 숙주 세포 단백질 등 불순물을 효율적으로 제거합니다. 우리 연구실의 이전 연구들은 이 방법이 서열 길이나 등전선점에 관계없이 광범위한 ELP 구성체에서 효과적임을 보여주었으며(그림 1), ITC

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Disclosures

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저자들은 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구를 지원해 주신 퍼듀 대학교 암 연구소와 NIH CCSG 프로그램(CA23168)에 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-머캅토에탄올바이오-래드161-0710SDS-PAGE 컴포넌트
30% 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드TCIA3218SDS-PAGE 컴포넌트
아세톤피셔 사이언티브A949유기 용매
아세토니트릴피셔 사이언티브A996유기 용매
암피칠린골드 바이오 - 골드 바이오테크놀로지A-301-25항생제
APS (과황산암모늄)바이오-래드1610700SDS-PAGE 컴포넌트
부타놀피셔 사이언티브L13171유기 용매
EDTA피셔 바이오리에이전트BP118-500용해 완충 구성 요소
에탄올디콘 랩스UN1170유기 용매
에틸 아세테이트피셔 사이언티브E195유기 용매
글리세롤리서치 프로덕츠 인터내셔널G22020-0.5훌륭한 육수(TB) 미디어 구성 요소
염산피셔 사이언티브A144SI-212용해 완충 구성 요소
즉시 쿠마시 스테인앱캠AB119211SDS-PAGE 컴포넌트
IPTG골드 바이오 - 골드 바이오테크놀로지12481C25단백질 발현 구성 요소
이소프로파놀피셔 사이언티브A451-1유기 용매
K2HPO4 (인산칼륨 단염기성)워즈 과학470302-2462부 버퍼 컴포넌트
KH2PO4 (포타슘 인산염 이염기성)워즈 과학470302-2542부 버퍼 컴포넌트
L-프롤린리서치 프로덕츠 인터내셔널P5200-500.0훌륭한 육수(TB) 미디어 구성 요소
라이소자임골드 바이오 - 골드 바이오테크놀로지L-040-1용해 완충 구성 요소
메탄올피셔 사이언티브A452유기 용매
네이티브 샘플 버퍼바이오-래드161-0738SDS-PAGE 컴포넌트
단백질 사다리골드 바이오 - 골드 바이오테크놀로지P008-500SDS-PAGE 컴포넌트
젤 버퍼 분해바이오-래드1610798SDS-PAGE 컴포넌트
소딤 도데실 설페이트 (SDS)써모 사이언티픽J18220-36SDS-PAGE 컴포넌트
수산화나트륨피셔 사이언티브S318-500용해 완충 구성 요소
스태킹 젤 버퍼바이오-래드1610799SDS-PAGE 컴포넌트
테메드바이오-래드1610801SDS-PAGE 컴포넌트
트리스 베이스피셔 바이오리에이전트BP-152용해 완충 구성 요소
트립톤리서치 프로덕츠 인터내셔널T60065-1000.0훌륭한 육수(TB) 미디어 구성 요소
효모 추출물리서치 프로덕츠 인터내셔널Y20025-1000.0훌륭한 육수(TB) 미디어 구성 요소

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....

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