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방법 논문

유기 용매 기반 추출 및 침전법을 이용한 대 장균 에서 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)의 효율적 정제

2.2K 조회수

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DOI:

10.3791/69465

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2026년 1월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 대장균에서 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)를 정제하기 위한 빠르고 재현 가능한 유기 용매 기반 추출 및 침전 방법을 설명 하며, 기존 ELP 정제 방법에 대한 확장 가능한 대안을 제공합니다.

초록

엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)는 포유류 트로포엘라스틴에서 발견되는 모티프를 모방하는 반복적인 펜타펩타이드 서열로 구성된 인공 생체고분자입니다. 이들의 독특한 특성 덕분에 약물 및 유전자 전달부터 조직 공학, 표적 분자 영상에 이르기까지 다양한 생의학 응용 분야에 이상적인 후보가 됩니다. 대 장균 (E. coli) 발현에서 기존의 정제 방법은 포함체가 형성되기 때문에 ELP에 효과가 없을 수 있습니다. 역전이 사이클링(ITC)과 같은 다른 방법은 ELP의 낮은 임계 용액 온도(LCST) 특성을 이용해 지지다당류(LPS)와 같은 오염물질로부터 분리하지만, 일반적으로 여러 차례의 가열 및 냉각 단계를 거쳐 시간이 많이 소요되고 ELP 구성체의 서열, 농도, 분자량에 따라 회수율이 낮을 수 있습니다. 이러한 도전을 해결하기 위해, 우리는 ELP의 내재적 소수성을 활용한 유기용 용매 기반 추출-침전 워크플로우를 개발하여 대장균 세포 펠릿에서 직접 빠르고 견고하며 광범위하게 정제할 수 있게 했습니다. 이 방법은 극성 유기 용매를 사용하여 세포 파괴를 돕고 ELP를 한 단계로 선택적으로 용해시킵니다. 이후 침전 단계에서는 잔류 유기 용매, 저분자량 불순물, 내독소를 효과적으로 제거하여, 3시간 이내에 LPS 농도가 1 EU/mL 이하인 고순도 ELP를 생성합니다. 원자력현미경 데이터는 이러한 방식으로 정제된 ELP-융합 단백질이 융합 단백질 기능을 유지하는 역방향 미셀 유사 구조로 자기 조립할 수 있음을 시사합니다. 이 빠른 정제 방법은 연구자들에게 ELP를 정제하는 직관적이고 확장 가능한 방법을 제공하며, ELP와 그 융합 단백질을 재료 및 생의학 응용 분야의 유연한 구성 요소로 활용할 새로운 가능성을 창출합니다.

서론

엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)는 반복되는 (VPGXG)n 모티프 1,2,2,3,4,5,6,7,8,9로 구성된 생체고분체입니다. 펜타펩타이드 단위의 게스트 잔기 X는 프로린을 제외한 모든 아미노산일 수 있습니다. X의 변형은 ELP 구성체의 소수성, 열 전이 거동 및 기능적 특성을 조정하여 모듈형 생체 적합성 재료를 만드는 데 사용될 수 있으며, 이는 다양한 생의학 응용 분야에서 널리 탐구되고 있습니다10, 11, 12.

화학 합성은 짧은 펩타이드를 생산하는 데 사용될 수 있지만, 고분자량 ELP나 융합 단백질의 기능 유지에는 적합하지 않습니다13,14. 이러한 이유로 ELP는 일반적으로 대장균에서 재조합 방식으로 발현되어 대량 서열 정의 생산이 가능합니다. 하지만 이러한 접근법은 도전 과제도 가져올 수 있습니다. 대장균에서 발현되는 동안 ELP는 종종 밀집된 포함체에 축적되어, 기능성 단백질을 추출하기 위한 효율적인 회복 전략이필요합니다. 더불어, 박테리아 발현은 숙주 세포 단백질, 핵산, 지다당류(내독소)와 같은 원치 않는 생체분자를 유입하여 정제 과정에서 ELP에서 분리해야 합니다. 세제(예: 도데실 황산나트륨(SDS) 또는 Triton X-100)나 요소와 같은 카오트로픽 작용제를 이용한 전통적인 용해 전략은 ELP 융합 서열에서 제한적인 성공을 거두었습니다. 우리의 경험에 따르면, 트리톤과 요소는 펠릿상에서 ELP를 추출하지 못했고, SDS는 부분 용해를 가능하게 했으나 하위 친화성 정제에 방해가 되었고, 소수성 ELP 서열에서 완전히 제거하기 어려웠습니다.

현재까지 역전이 사이클링(ITC)은 ELP에서 가장 널리 사용되는 정제 방법으로 남아 있습니다. 이 기술은 ELP의 LCST 거동을 이용해 온도 및 염분 구배를 따라 선택적으로 침전하고 재용해합니다16. 그러나 분자량이 낮은 단백질의 경우 ITC는 시간이 많이 소요되는 다단계 과정으로, 포함체에 갇힌 ELP에는 적합하지 않으며, 여러 번의 ITC 사이클이 필요해 각 단계마다 단백질 손실이 발생할 수 있습니다 7,16.

이러한 한계를 극복하기 위해 유기 용매 기반 추출 및 침전 워크플로우를 채택했습니다. Yakhnin 등은 1998년에 에탄올과 염 구배를 이용한 GFP 정제를 위한 소수성 기반 분할 전략을 처음입증했으나, 우리가 개발한 새로운 방법은 유기 용매 혼합물을 이용해 대장균 세포에서 ELP 융합 단백질을 직접 추출하는 것입니다7. Sweet 등과 Darji 등은 이 접근법을 ELP 융합에 적용하여, 유기 용매 추출이 구조적 무결성과 생활성을 유지하면서 기능성 ELP의 신속한 회복을 가능하게 함을 보였다 8,9. 이 방법은 초음파 검사와 유기 용매를 이용해 박테리아 세포를 용해하고 ELP를 한 번에 추출하며, 대부분의 숙주 단백질과 핵산을 침전시킵니다. ELP가 풍부한 유기상을 회수한 후 용매와 용해성 불순물로부터 ELP를 분리하기 위해 급속히 침전하면 매우 순도가 높은 ELP가 생성됩니다. 이 방법은 또한 내독소 수치가 1 EU/mL 미만인 대장균 펠릿에서 순수 ELP를 3시간 이내에 얻을 수 있습니다 7,8.

지금까지의 연구에 따르면, 이 방법은 여러 개의 ITC 사이클이나 용해화 단계 없이도 분자량과 등전점이 다양한 ELP 구성체와 ELP 융합 단백질을 정제할 수 있음이 입증되었습니다(그림 1). 원자력 현미경(AFM)과 투과전자현미경(TEM) 영상은 이러한 방식으로 정제된 ELP 융합 단백질이 역미셀 유사 구조를 형성하여 유기 용매 추출 시 ELP 융합 도메인의 구조와 기능을 보존하는 데 도움을 준다고 시사합니다(그림 2). 이러한 간소화된 워크플로우는 다양한 생의학 응용 분야에서 더 빠르고 신뢰할 수 있는 ELP 정제를 가능하게 합니다 7,8. 특히 Aayush 등은 이 방법으로 정제된 ELP 구조물이 표피 성장인자 수용체 결합 기능18을 유지한다고 보고했으며, 이 방법이 순수 ELP 물질을 생성할 뿐만 아니라 융합 단백질 도메인의 활성도 유지한다는 점을 강조했습니다.

ELP-효소 융합 분리에 이 방법의 유용성을 추가로 입증하기 위해, ELP-인테인-코리메이트 뮤타제 2(ELP-I-Cm2) 구성체를 정제하는 상세한 유기 용매 기반 방법을 설명합니다(그림 3). 이 방법은 약물 전달 및 나노재료 응용을 위한 다른 ELP의 신속 정제에 유용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 재료 준비

  1. 박테리아 균주: 대 장균 BL21(DE3) 화학적으로 적합한 세포를 발현 숙주로 사용하세요.
    참고: 이들은 높은 형질전환 효율과 재조합 단백질 생산에 적합하다는 점에서 선정되었습니다.
  2. 발현 플라스미드: 암피실린 저항성을 가진 ELP-I-Cm2 융합 단백질을 암호화하는 pET21(+) 벡터 사용. AddGene에서 플라스미드 벡터를 구매하세요. 인테인 끝에 있는 BsrG I 부위를 사용하여 Cm2 유전자를 삽입합니다.
    참고: 이 단백질의 플라스미드 DNA 서열은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.
  3. 성장 배지: 1200 mL 배지용 Terrific Broth(TB) 배지 준비
    1. 트립톤 16g, 효모 추출물 32g, 프로린 16g, 글리세롤 6.8mL, 초순수 1100mL를 첨가하여 배지를 준비합니다. 모든 성분을 녹이도록 충분히 섞으세요. 최종 부피를 초순수수로 1200mL로 조절하세요.
    2. 2부를 위해 23.1g KH2PO4 와 125.4g K2HPO4를 혼합하여 인산칼륨 완충제(Part 2)를 준비한 후, 초순수한 물로 부피를 1L까지 만듭니다.
    3. 부품(1부와 2부)은 따로 오토클레이브하세요. 오토클레이빙 후에는 결핵 염기를 네 개의 300 mL 알리코트로 나누어 배지를 조립합니다. 멸균 조건에서 각 알리코트에 33mL의 인산염 완충제를 첨가합니다.
  4. 발현을 위한 첨가제
    1. IPTG: 최종 농도는 1.2 mM(예: 330 mL 배양에 1M IPTG 396 μL 첨가)에서 IPTG를 이용해 유도 시술을 수행합니다.
    2. 항생제: 플라스미드 선택을 보장하기 위해 최종 농도인 100 μg/mL에 암피실린을 첨가합니다.
  5. 용해 완충제(pH 8.5): 용해 완충액을 10 mM 삼염기와 22 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)으로 준비합니다. 필요에 따라 HCl 또는 NaOH를 사용해 pH를 8.5로 조절하세요.
  6. 추출용 유기 용매
    1. 포함체에서 ELP-I-Cm2 융합 단백질을 추출하기 위해 다양한 유기 용매(표 1)를 사용한다. 이 용매들을 개별적으로 또는 이진 조합(1:1 볼륨: 볼륨)으로 테스트하여 효율과 ELP 순도를 평가합니다.
      참고: 사용된 모든 용매는 HPLC 등급이었으나, 아세토니트릴(Optima 등급), 에탄올(USP 등급), 1-부타놀(99% 순도)은 제외되었습니다.
      주의: 위에 나열된 모든 용매는 휘발성 및 가연성입니다. 이들은 화학 연기 후드 안에서 적절한 PPE(실험복, 니트릴 장갑, 안구 보호구)를 착용해 다뤄야 합니다. 많은 종류의 플라스틱 제품이 유기 용매와 호환되지 않습니다. 폴리프로필렌 플라스틱 제품은 유기 용매를 이용한 추출-침전 실험에 강력히 권장됩니다; 그렇지 않으면 사용할 플라스틱 제품을 귀중한 샘플 없이 검사하여 적합한지 확인해야 합니다. 용매 폐기물 처리는 관련 기관 유해 폐기물 정책에 명시된 절차를 따라야 합니다.

2. 세포 용해 및 준비 (그림 4A)

  1. 재현탁: 세포 펠릿 1g을 무게를 재고 신선하게 준비한 용해 완충제 4mL에 재현탁합니다. 펠릿이 완전히 분산되어 버퍼와 섞일 때까지 부드럽게 소용돌이를 돌리세요.
  2. 효소 용해: 세포벽 소화를 돕기 위해 ~5mg의 라이소자임을 첨가합니다. 현탁액을 4°C에서 1시간 동안 부양시킵니다. 이로 인해 부분 효소 소화가 촉진되어 세포 용해를 촉진합니다.
  3. 초음파 검사: 배양 후 샘플을 초음파 검사하여 세포 용해를 완료하고 유전체 DNA를 절단합니다. 과열을 방지하기 위해 350W 장치, 전력 레벨 3의 마이크로팁 프로브 소닉네이션을 짧게 연속으로 사용하세요(예: 5초 켜기/10초 꺼짐, 필요에 따라 반복). 샘플을 얼음 위에서 초음파 검사하고 초음파 에너지를 가해 보통 5-8분 동안 가시성 입자가 없는 균일한 용해액을 얻을 때까지 가합니다.
    참고: 초음파 검사가 완료된 후에는 추출 및 침전 단계 전후의 정제 진행 상황을 모니터링하기 위해 ELP 발현 분석을 위해 샘플(또는 용해액)의 100 μL 알리코트를 저장하십시오.
  4. 원심분리 및 발현 분석.
    1. 용해액을 10,000g에서 20°C에서 10분간 원 심분리하여 정액한 후, 상원액(용해성 분획)과 펠릿(불용성/포함체체 분획)을 조심스럽게 분리합니다.
    2. SDS-PAGE로 두 분획의 ELP 발현을 평가합니다: 상청액의 10-20 μL(예: 10-20 μL)를 추출하고 동등한 펠릿 질량을 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 같은 부피로 재현탁; 각 완충제를 4x Laemmli 버퍼와 혼합하여 최종 1x로 만들고, 95°C에서 5분간 가열한 후 동일한 양을 투여하여 직접 비교할 수 있게 합니다.
    3. 목표 ELP가 주로 용해성인 경우, 정액화된 상정액을 이용한 유기-용매 추출을 진행하세요. 대부분 불용성(포함체)일 경우, 상원액을 버리고 유기 용매 추출로 펠릿을 처리하여 포함체-체의 작업 흐름(세척/용해화, 추출)을 계속하세요.
  5. 펠릿 세척 및 건조(포함체 내 ELP에만 한정): 원심분리관을 뒤집어 잔류 용해 완충제를 중력 보조 배수로 배출할 수 있게 합니다. 눈에 보이는 액체가 빠지면(~1-2분) 펠릿을 실온에서 5-10분간 자연 건조시키고, 과도한 수분이 없도록 한 후 유기농 추출을 진행합니다.

3. 유기 추출 (그림 4B)

참고: 각 ELP는 고순도 추출을 위한 선호 용매 조건이 다릅니다(예: 그림 1의 AC 성능). 따라서 28종의 유기 용매와 그 조합에 대한 초기 스크리닝을 수행하고, PAGE가 분석하여 관심 구조물에 대한 최적의 용해화 효율 조건을 파악해야 합니다.

  1. 용매 선별. 1.6단계에서 보여준 개별 용매와 1:1(v/v) 이진 용매 혼합물을 스크리닝합니다. 추가 혼합물(예: 1:2, 2:1, 4:1)을 평가하여 과정의 효과를 높이세요.
    참고: 현재 가장 효과적인 용매나 조합을 합리적으로 선택할 수 있는 지침이 없으므로, 이전에 소수성 단백질 응집체를 용해시키는 데 성공한 용매에서 선별하기 위한 스크리닝 캠페인이 필요합니다. 정제에 사용할 유기 용매 추출제의 최종 선정은 이 스크리닝에서 얻은 분리물에 대한 SDS-PAGE 분석을 기반으로 해야 합니다.
  2. 추출 절차
    1. 용매 첨가: 용해 후 얻은 공기 건조 펠릿/상액에 유기 용매 또는 용매 혼합물 4mL를 첨가합니다. 혼합 조합의 경우, 정확한 체피 비율을 확인하세요(예: 1:1 조합의 경우 각각 2mL).
    2. 소용돌이 현상: 현탁액을 1분간 격렬하게 돌려 용매가 펠릿에 완전히 혼합되고 침투하도록 합니다.
    3. 배양 기간(보존 시간): 현탁물을 20°C에서 5분간 배양하여, ELP가 유기상에서 용해되는 동안 세포외 단백질이 응집하고 침전될 충분한 상호작용 시간을 확보합니다.
    4. 원심분리: 혼합물을 13,000 × g 에서 20 °C에서 10분간 원심분리하여 용해성 단백질과 잔류 불용성 이물질을 분리합니다.
    5. 상청액 수집: 펠릿을 흐트러뜨리지 않고 조심스럽게 상청액을 수집하세요. 상청액에는 용해된 ELP가 포함되어 있고, 펠릿에는 숙주 세포 단백질, 핵산, 지질이 포함되어 있습니다.
    6. 부피 측정: 회수된 상정액의 부피를 정확히 기록하세요. 상환액에 펠릿 입자가 없도록 주의해야 합니다. 이 측정은 하류 강수 단계에서 매우 중요합니다.

4. 단백질 침전

  1. 용매 첨가: 유기 상원액에 아세톤 또는 아세토니트릴을 상액 부피의 2.33배에 첨가합니다.
  2. 인큐베이션: 혼합물을 20°C에서 5-7분간 배양합니다.
  3. 원심분리: 10,000g 원심분리기를 20°C에서 10분간 유지합니다.
  4. 펠릿 취급: 원심분리 후에는 상청액을 조심스럽게 버리고 튜브를 뚜껑 없이 부드러운 질소 가스 흐름 아래 10-15분간 자연 건조시키거나, 뚜껑이 없는 원심분리관을 보풀 없는 물티슈 위에 거꾸로 올려 20°C에서 1시간 동안 배양합니다(열은 가하지 않음).

5. 단백질 펠릿 취급 및 재현탁

  1. 재현탁: 침전 후 자연 건조 후 단백질 펠릿을 인산염 완충 생리식염수(PBS) 50 μL에 재현탁합니다. 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 펠릿이 완전히 녹았는지 확인하세요.
  2. 보관: 재현탁된 단백질을 -20°C에 보관하여 단기에서 중기 용도로 보관합니다. 단백질의 기능적 완전성을 유지하기 위해 반복적인 냉동-해동 과정을 피하세요.

6. SDS-PAGE를 통한 검증

  1. 샘플 준비: 정제된 단백질을 4× SDS-PAGE 로딩 버퍼와 3:1 비율로 혼합한 후 잠시 소용돌이를 사용해 균질성을 보장합니다.
  2. 전기영동 조건: ELP-I-Cm2 15% SDS-PAGE 겔에 주입하여 추적 염료가 바닥에 도달할 때까지 100-120 V로 작동시킵니다.
    참고: 겔 내 가교 비율은 관심 있는 ELP 구조체의 크기를 기준으로 해야 합니다
  3. 염색 및 시각화: 인스턴트 블루 쿠매시 염색 또는 적절한 염색제를 20°C에서 2시간 동안 젤에 염색하세요. 탈이온수로 세척하여 투명한 배경을 얻을 때까지 탈색합니다. 활성 분석법에서 분리된 단백질을 검사하여 유기 용매 추출-침전 정제 작업 흐름 이후 활성 유지가 이루어졌는지 검증합니다.

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결과

프로토콜의 마지막 단계를 거친 후, 다음 단계는 SDS-PAGE 분석과 쿠매시 블루 염색을 통해 추출-침전 결과를 시각화하는 것입니다. 유기 추출 전에 용해 단계가 있을 때는 뚜렷한 ELP 밴드가 나타나야 합니다. ELP-I-Cm2의 경우, 이 밴드는 100 kDa에서 나타납니다(그림 3A).

다양한 유기 용매 조합의 스크리닝 결과, 추출 효율이 다양하게 나타나며(그림 3B), 각 조합은 서로 다른 농도와 순도를 만들어냈다. 우리는 융합 단백질의 순도와 기능 분석에 기반해 추출-침전의 최적의 조합을 선택하여 해당 구성물의 대규모 ELP 정제에 사용할 것입니다. AG(이소프로판올:아세토니트릴)와 BG(부탄올:아세토니트릴) 1:1 혼합물은 ELP-I-Cm2의 경우 다른 조합들에 비해 가장 높은 단백질 회수율(2.2-2.6 g/L)를 기록했습니다.

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토론

ITC는 이전에 ELP19의 비크로마토그래피 정제에 사용된 바 있습니다; 하지만 시간이 많이 걸리고 수확률이 낮을 수 있습니다. 위에서 설명한 방법에서는 ELP-I-Cm2 융합 단백질의 신속 정제 방법을 설명하며, 유기 용매 기반 추출-침전 방법이 다양한 ELP 및 ELP 융합의 정제에 효과적으로 활용될 수 있음을 보여줍니다. 유기 용매 프로토콜은 ITC보다 빠를 뿐만 아니라, ITC 방법에 도전할 수 있는 짧은 ELP 서열에 훨씬 더 효과적입니다. 산업 응용 분야에서는 ITC보다 더 확장 가능한 대안이 될 수도 있습니다. 이 방법은 각 단계에서 핵산, LPS, 대사산물, 숙주 세포 단백질 등 불순물을 효율적으로 제거합니다. 우리 연구실의 이전 연구들은 이 방법이 서열 길이나 등전선점에 관계없이 광범위한 ELP 구성체에서 효과적임을 보여주었으며(그림 1), ITC

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구를 지원해 주신 퍼듀 대학교 암 연구소와 NIH CCSG 프로그램(CA23168)에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-머캅토에탄올바이오-래드161-0710SDS-PAGE 컴포넌트
30% 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드TCIA3218SDS-PAGE 컴포넌트
아세톤피셔 사이언티브A949유기 용매
아세토니트릴피셔 사이언티브A996유기 용매
암피칠린골드 바이오 - 골드 바이오테크놀로지A-301-25항생제
APS (과황산암모늄)바이오-래드1610700SDS-PAGE 컴포넌트
부타놀피셔 사이언티브L13171유기 용매
EDTA피셔 바이오리에이전트BP118-500용해 완충 구성 요소
에탄올디콘 랩스UN1170유기 용매
에틸 아세테이트피셔 사이언티브E195유기 용매
글리세롤리서치 프로덕츠 인터내셔널G22020-0.5훌륭한 육수(TB) 미디어 구성 요소
염산피셔 사이언티브A144SI-212용해 완충 구성 요소
즉시 쿠마시 스테인앱캠AB119211SDS-PAGE 컴포넌트
IPTG골드 바이오 - 골드 바이오테크놀로지12481C25단백질 발현 구성 요소
이소프로파놀피셔 사이언티브A451-1유기 용매
K2HPO4 (인산칼륨 단염기성)워즈 과학470302-2462부 버퍼 컴포넌트
KH2PO4 (포타슘 인산염 이염기성)워즈 과학470302-2542부 버퍼 컴포넌트
L-프롤린리서치 프로덕츠 인터내셔널P5200-500.0훌륭한 육수(TB) 미디어 구성 요소
라이소자임골드 바이오 - 골드 바이오테크놀로지L-040-1용해 완충 구성 요소
메탄올피셔 사이언티브A452유기 용매
네이티브 샘플 버퍼바이오-래드161-0738SDS-PAGE 컴포넌트
단백질 사다리골드 바이오 - 골드 바이오테크놀로지P008-500SDS-PAGE 컴포넌트
젤 버퍼 분해바이오-래드1610798SDS-PAGE 컴포넌트
소딤 도데실 설페이트 (SDS)써모 사이언티픽J18220-36SDS-PAGE 컴포넌트
수산화나트륨피셔 사이언티브S318-500용해 완충 구성 요소
스태킹 젤 버퍼바이오-래드1610799SDS-PAGE 컴포넌트
테메드바이오-래드1610801SDS-PAGE 컴포넌트
트리스 베이스피셔 바이오리에이전트BP-152용해 완충 구성 요소
트립톤리서치 프로덕츠 인터내셔널T60065-1000.0훌륭한 육수(TB) 미디어 구성 요소
효모 추출물리서치 프로덕츠 인터내셔널Y20025-1000.0훌륭한 육수(TB) 미디어 구성 요소

참고문헌

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