방법 논문

디지털 액상 PCR(ddPCR)을 이용한 토양 내 미생물 바이오매스 측정

DOI:

10.3791/69467

⸱

2026년 4월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 토양 미생물 생체량과 균류-박테리아 비율을 빠르게 정량화하는 ddPCR 방법을 제시합니다. ddPCR 유래 미생물 생체량 탄소는 클로로포름 훈증 추정치와 약한 상관관계만 보이지만, 이 방법은 추가 토양 샘플링이나 강경 도구 없이 민감하고 확장 가능한 분자 접근법을 제공합니다.

초록

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토양은 육상 유기 탄소 저장 규모가 가장 크지만, 지난 200년간 토양에서 133 Gt 이상의 탄소가 손실되었습니다. 토양 미생물 바이오매스, 특히 탄소와 영양분 순환을 주도하는 주요 분해자인 곰팡이와 박테리아의 정확한 정량화는 토양 생태계 기능과 건강을 이해하는 데 필수적입니다. 클로로포름 훈증 추출과 PLFA 분석 등 기존 접근법은 높은 샘플 요구량과 생화학적 표지자를 미생물 바이오매스 추정치로 변환하는 데 따른 불확실성 때문에 제한됩니다. 여기서는 16S 및 18S rRNA 유전자를 표적으로 하는 디지털 드롭렛 PCR(ddPCR)을 이용해 토양 내 박테리아 및 곰팡이 풍부도를 정량화하는 최적화된 워크플로우를 제시합니다. 이 방법은 미생물 유전자 복사본의 절대적 정량화, 유전자 복제수 보정 인자를 이용한 세포 수로의 변환, 그리고 미생물 생체량 탄소의 후속 추정을 가능하게 합니다. 우리는 토양 질감, 토지 이용, 유기물 함량이 다른 다섯 개의 전 세계에 분포된 농업 시스템의 토양에 이 프로토콜을 적용하였다. ddPCR 유도 추정치를 기존의 클로로포름 훈증 추정치와 비교하였다. ddPCR은 미생물 풍부도를 고해상도로 정량화했으며, 전체 유전체 시퀀싱보다 토양 유형 전반에 걸쳐 더 광범위하고 민감한 F:B 비율 추정치를 제공했다. ddPCR 유도 MBC는 클로로포름 훈증 값과의 상관관계가 약했지만, 이 방법은 미생물 바이오매스 및 F:B 비율과 같은 생태학적 지표를 평가하는 데 효과적인 분자적 접근법을 제공한다. 이 프로토콜은 미생물 풍부도 측정과 조성 분석을 통합하여 토양 건강 평가를 발전시키는 재현 가능하고 확장 가능한 전략을 제공한다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

토양은 가장 큰 육상 유기 탄소 저장 풀로, 식생과 대기 탄소를 합친 것보다 더 많은 탄소를 보유하고 있습니다1. 지난 200년간 토양에서 133기가톤(Gt) 이상의 탄소가 손실되었으며, 토양 탄소 저장량 복원과 유지를 위한 지속적인 노력은 전 세계 토양 건강에 매우 중요합니다2. 토양의 막대한 탄소 저장 용량을 고려할 때, 이 탄소 저장의 주요 기여자를 정확히 파악하는 것은 근본적으로 중요합니다3. 미생물은 토양 내 영양 순환에 근본적인 역할을 하며, 미생물 바이오매스는 토양 유기탄소(SOC)의 중요한 구성 요소입니다3. 균류와 박테리아는 토양 환경에서 주요 분해자이며, 이 생태계의 생지화학적 순환에 필수적이다 4,5. 박테리아 우세한 토양에서는 유기물 분해와 영양분 광화가 곰팡이 우세한 토양보다 훨씬 빠르다5. 곰팡이-박테리아(F:B) 비율은 토양 건강의 지표로 점점 더 많이 사용되고 있다 6,7; 따라서 균류와 박테리아 모두에 대한 정확한 평가가 매우 중요하다.

토양 내 미생물 바이오매스 추정은 종종 클로로포름 훈증과 같은 파괴적 화학적 처리에 의존합니다. 다른 접근법으로는 기질 유도 호흡이나 인지질 지방산(PLFA) 분석과 같은 기법을 통해 활성 미생물 군집을 선택적으로 표적으로 삼습니다. PLFA 분석은 미생물 군집 구성을 평가하고 F:B 비율을 추정하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 그러나 균류 및 박테리아 종에 따라 세포 크기가 크게 변하기 때문에 PLFA 농도를 바이오매스 또는 집단 기반 F:B 비율로 변환할 때 불확실성이 발생하여 이러한 추정은 신뢰성이 떨어질 수있습니다. 유동 세포분석과 같은 다른 방법들은 토양 내 박테리아 풍부도를 결정하기 위한 샘플 처리량을 높이는 데 사용할 수 있습니다; 그러나 비미생물 입자가 미생물과 크기, 형태, 자가형광 특성을 유사하기 때문에 정확도가 떨어질 수 있다11. 클로로포름 훈증은 미생물 생체량을 추정하기 위해 비교적 많은 양의 토양(>10g)이 필요하지만, 상업용 키트를 이용한 추출 시 DNA 기반 방법으로 500mg 샘플 크기면 충분하다. DNA 기반 방법과 클로로포름 훈증 방법 간의 이전 비교에서는 두 방법 모두 미생물 생체량을 추정할 수 있었지만, 함께 사용할 경우 토양 미생물 생물량을 더 신뢰성 있게 평가할 수 있음이 나타났다12.

미생물 군집 평가는 토양 건강을 측정하고 이해하는 방식을 혁신할 잠재력을 가진 토양 건강의 저활용 지표입니다13. 메타바코딩 기법은 전통적으로 토양 미생물 군집을 결정하는 데 사용되며, 상대적인 박테리아 개체 수는 16S rRNA 유전자의 증폭 영역을 통해 평가하고, 균류 분류군은 18S rRNA 유전자 또는 내부 전사 간격자(ITS) 영역14를 사용하여 표적화합니다. 균류에 대한 메타바코딩 접근법은 서로 다른 유전체 표적 영역에 의존할 수 있으며, 이는 확인된 균류 종의 다양성과 풍부도에 영향을 미칩니다. 균류 종 간 ITS 길이가 고르지 않아 우선 증폭과 시퀀싱을 촉진하여 개체수 추정이 잘못되어 균류 군집에 대한 잘못된 평가로 이어질 수 있습니다15. Fungiquant 프라이머는 18S rRNA 유전자 내 특정 변이 영역을 표적으로 삼기 위해 개발되었으며, 이 영역은 다른 진핵생물과 비교할 때 다양한 균류와 특이성을 포괄적으로 보인다16.

대부분의 박테리아와 균류는 표적 유전자를 여러 개 가지고 있어 세포 수 추정이 편향됩니다. 더불어, 균류는 세포당 핵 수가 다양한 다핵 세포를 가진 경우가많습니다. 분류군 내외에서 rRNA 유전자 복제본 수가 상당히 다양하며, 원핵생물에서는 보통 15개 미만이고, 균류17은 28개에서 511개 사이로 추정됩니다. 이러한 변이로 인해 미생물 군집 구조를 분석하는 분자 기법은 반정량적으로 간주되며,이는 군집 내 종의 상대적 풍부도 추정을 왜곡할 수 있습니다. 측정된 유전자 복제 수(GCN)는 관심 분류군18, 19, 20의 추정 평균 GCN을 사용하여 세포 개체수로 일상적으로 변환됩니다.

일부 연구에서는 메타게놈 접근법을 사용했는데, 이는 증폭 편향 제거와 전체 미생물 군집을 포괄적으로 검사할 수 있는 능력 등 메타바코딩에 비해 여러 장점을 제공하기 때문입니다21. 또한 균류 및 박테리아 조성과 이들 간의 관계를 동시에 비교할 수 있게 합니다22. 일반적으로 RT qPCR은 미생물 함량과 기능을 검출하는 데 흔히 사용됩니다23. qPCR은 억제제에 대한 민감성 때문에 디지털 드롭렛 PCR(ddPCR)과 비교할 때 외부 표준24가 필요하다는 한계가 있습니다.

ddPCR은 개별 증폭 반응을 개별 액자로 나누는 획기적인 기술입니다. 템플릿은 이후 각 개별 물방울에서 별도의 반응으로 PCR로 증폭됩니다. ddPCR은 효소 억제제에 대한 민감도가 낮고, qPCR25보다 더 높은 정밀도, 반복성, 감도, 박테리아 및 곰팡이 정량 시 안정성을 가지고 있습니다. 더불어, 토양 내 박테리아와 균류의 절대 정량화에 사용할 수 있는 방법입니다. ddPCR은 미생물 조성 변화를 평가하는 데 사용되는 동일한 추출 DNA를 사용하기 때문에, ddPCR의 풍부도 데이터는 군집 조성 데이터와 직접 연계하여 토양 미생물 생체량을 정량하는 데 사용할 수 있습니다.

본 연구는 디지털 액자 PCR(ddPCR)을 이용해 토양 내 균류와 박테리아를 정량화하는 방법론을 제공합니다. 이 최적화된 방법은 다섯 개의 서로 다른 전 세계 위치와 토지 이용의 토양에 적용되었습니다. 샘플 위치는 토양 특성, 환경 조건 및 관리 관행의 광범위한 스펙트럼을 포괄하도록 선정되어, 다양한 환경에서 우리의 접근법의 견고성과 일반성을 평가할 수 있었습니다. 이 데이터는 토양 생태학적 품질의 분자 생물지표로서 F:B 비율을 결정하는 데 기여했습니다. 마지막으로, 미생물 ddPCR 데이터와 기존 클로로포름 훈증 방법 간의 추정된 미생물 생체량을 비교하였습니다.

프로토콜

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이 프로토콜들의 전체 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. 시약과 사용되는 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 토양 샘플링

  1. 5개의 전 세계 위치에서 0–20cm 크기의 복합 표토 샘플을 수집하며, 각 위치에서 25m 범위 내 무작위로 선정된 지점에서 3개를 샘플로 채취합니다.
    참고: 모든 샘플은 해당 지역의 토지 이용을 대표하는 농업 시스템에서 수집되었습니다. 토양 질감은 레이저 회절을 사용하여 특성화되었으며, 레이저 회절 입자 크기 분석기로 측정되었습니다(표 1). 샘플은 상온에서 운송되어 추가 분석이 있을 때까지 4 °C에서 보관되었습니다.

2. DNA 추출

참고: 제조사의 지침에 따라 토양 DNA 추출 키트를 사용해 DNA 추출을 수행하십시오. 모든 단계의 실온은 20°C였습니다.

  1. 2mL 비드 두드리는 튜브를 잠시 돌려 비즈가 바닥에 가라앉도록 합니다. 토양 100mg과 용액 CD1 800 μL를 추가합니다. 혼합하기 위해 잠시 와류를 만듭니다.
  2. 시료는 6m s−1 깊이에서 40초 용해하여 비드 밀 균질기를 사용하여 시료를 철저히 균질화합니다.
  3. 기계적 세포 용해를 위해 15,000 x g에서 실온에서 1분간 원심분리기를 사용하세요.
  4. 상원액을 깨끗한 2mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
    참고: 상액에는 여전히 토양 입자가 포함될 수 있습니다.
  5. 용액 CD2 200 μL를 추가하고 5초간 소용돌이로 돌리세요.
  6. 15,000 x g 에서 실온에서 1분간 원심분리합니다.
  7. 펠릿을 피하고 최대 700 μL의 상원액을 깨끗한 2mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 펠릿은 보이도록 해야 합니다.
  8. 600 μL 용액 CD3를 추가하고 5초간 소용돌이로 보입니다.
  9. 650 μL의 용해물을 스핀 컬럼에 실온에서 15,000 x g 의 원심분리기에서 1분간 적재합니다.
  10. 플로우 스루를 버리고 2.9단계를 반복하여 모든 용해액이 스핀 컬럼을 통과했는지 확인합니다.
  11. 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집관에 넣으세요.
  12. 스핀 컬럼에 용액 EA 500 μL을 추가합니다. 15,000 x g 원심분리기에서 실온에서 1분간 가열합니다.
  13. 플로우 스루를 버리고 스핀 컬럼을 같은 2 mL 수집관에 다시 넣습니다.
  14. 스핀 컬럼에 500 μL 용액 C5를 추가합니다. 실온에서 15,000 x g 원심분리기에서 1분간 사용하세요.
  15. 플로우 스루를 버리고 스핀 컬럼을 새로운 2mL 수집관에 넣습니다.
  16. 실온에서 최대 16,000 x g 에서 2분간 원심분리합니다.
  17. 스핀 컬럼을 새로운 1.5mL 용출관에 넣으세요.
  18. 흰색 필터 막 중앙에 50–100 μL 용액 C6를 첨가합니다.
  19. 15,000 x g 에서 실온에서 1분간 원심분리기. 스핀 컬럼은 버리고 유출물을 -20 °C에서 보관하세요.

3. 정제 DNA의 정량

참고: 정제된 DNA는 제조업체의 지침에 따라 형광광도계와 이중 가닥(dsDNA) 광범위(BR) 검사 키트를 사용하여 정량되었습니다.

  1. 버퍼와 시약 비율 199:1로 작동하는 용액을 준비합니다.
  2. 각 DNA 표준액 10 μL을 작업 용액 190 μL에 추가합니다.
  3. 정제 DNA 1–20 μL을 작업 용액 180–199 μL에 첨가합니다. 최종 부피는 200 μL이어야 합니다. 보텍스(Vortex)와 표준 및 DNA 샘플을 상온에서 2분간 배양합니다.
  4. 화면 안내를 사용해 DNA 샘플 전에 표준 검사를 분석하세요.

4. 프라이머 선택

  1. 토양 미생물 분석의 경우, 관련 참고문헌을 바탕으로 특정 프라이머를 선택하라. 박테리아에는16S rRNA 프라이머가 사용되었고, 균류에는 18S rRNA 프라이머가사용되었다.
  2. DNA 결합 염료 기반 실시간 PCR(qPCR) 마스터 믹스와 열 사이클러를 사용하여 증폭을 수행합니다. 프라이머 서열은 표 2에 제공되어 있습니다.

5. ddPCR을 이용한 미생물 정량

  1. 해동하고 소용돌이 시약은 모두 얼음 위에 올려놓았다.
  2. ddPCR 반응을 다음과 같이 설정하세요: 0.1 μL (10 μM) 순방향 및 0.1 μL (10 μM) 역방향 16S 또는 18S 프라이머, 10 μL ddPCR 에바그린 슈퍼믹스, 0.5 ng 템플릿 DNA X μL, 뉴클레아제 프리 워터(NFW)를 사용하여 최종 반응 부피를 22 μL로 조정합니다. 각 컬럼에 템플릿 대신 NFW를 추가하여 음의 대조군을 만듭니다.
  3. DG8을 카트리지 홀더에 넣으세요.
  4. 총 20μL의 반응 혼합물을 카트리지 내 샘플 웰에 넣습니다.
  5. 에바그린용 방울 생성 오일 70 μL을 '오일'이라고 표기된 카트리지에 추가하세요.
  6. 카트리지를 드롭렛 제너레이터에 넣고 가스켓으로 덮으세요.
  7. 생성된 방울 40 μL을 96웰(반스커트) 플레이트에 전달하여 PCR 증폭을 수행합니다.
  8. 96웰 플레이트를 플레이트 실러로 밀봉하세요(온도, 180 °C, 5초).
  9. 다음 사이클링 조건을 105°C에 가열한 뚜껑을 사용하세요.
    참고: (a) 박테리아: 98 °C에서 5분, 40 사이클; 94 °C 30초, 61°C 60초, 4 °C 5분, 98 °C 10분. (b) 곰팡이: 95 °C 5분, 40 사이클; 95 °C 30초, 55 °C 1분, 72 °C 30초, 4 °C 5분, 90 °C 5분.
  10. 96웰 플레이트를 플레이트 리더기로 옮기세요.
  11. QuantaSoft 버전 1.2를 사용하여 각 우정의 복사 농도를 평가합니다. 음수와 양의 방울을 구분하도록 진폭 임계값을 조정합니다.
  12. 반응 내 DNA ng당 유전자 복사본 수를 계산하는데, 복제본/μL에 최종 반응 부피(20 μL)를 곱한 후 전체 템플릿 DNA 입력량으로 나누어 다음과 같이 계산합니다: (복사본 μL-1 × 반응 부피) / 총 DNA 입력량.
  13. 추출한 DNA 1.ng당 총 유전자 복사본을 추출된 총 DNA 곱하여 다음과 같이 계산합니다: (ng당 유전자 복사본 수 x 총 추출된 DNA 값).
  14. 추출한 DNA 1ng당 총 유전자 복사본을 추출 과정에서 처리된 토양의 건조 중량(g)으로 나누어 그램당 유전자 복사본을 계산합니다:
    유전자 복제본당 유전자 복제수 = (추출된 DNA ng당 총 유전자 복제본수 / 추출 과정에서 처리된 토양의 건조 중량(GDW)).
  15. 평균 유전자 복사 수(GCN)를 사용하여 gdw당 세포 수를 계산하세요. 이 방정식은 다음과 같습니다:
    세포 수 = 1g당 유전자 복사본 수 / 평균 유전자 복제 세포-1).
  16. 다음 식을 사용하여 세포 번호를 미생물 바이오매스 탄소(MBC)로 변환합니다:
    16S (mg C g-1 토양) = 세포 gdw-1 × (100 fg cell-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28
    18S (mg C g-1 토양) = 세포 gdw-1 × (6 fg cell-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    전체 과정은 그림 2에 설명되어 있습니다.
    참고: 46개 박테리아 문20 의 평균 16S rRNA 유전자 복사본(평균 ± SD)을 계산하여 박테리아의 보정 계수로 사용했으며, 최종 값은 2.48이었습니다. 균류의 경우, 유전자 복사 수는 Lofgren 등에 따라 보정 계수 113으로 계산되었습니다. 미생물 생체량 탄소(MBC)는 ddPCR 유래 세포 수에서 추정되었으며, 박테리아 세포당 100 fg, 균류 세포당 6 pg(29)로 추정하였습니다.

6. 전체 유전체 시퀀싱을 통한 토양 분자 분석

  1. Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) (재료 표 참조)를 사용하여 Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114 프로토콜에 따라 시퀀싱 라이브러리를 준비하세요. 각 샘플마다 키트에 포함된 바코드를 하나 사용하세요.
  2. Oxford Nanopore Technologies R10.4.1 플로우셀을 사용하여 준비된 라이브러리를 시퀀싱합니다.
  3. 시퀀싱 실행 중 MinKnow에서 슈퍼 정확도(SUP) 모델을 선택하고 바코드 트리밍 "ON"을 선택하여 베이스콜링을 수행합니다. 도라도 버전: 0.7.2+9ac85c6.
  4. 분류학 분류기 Kraken2 (v2.1.3)30 을 사용하여 NCBI 비중복 단백질(nr) 데이터베이스를 사용하여 DNA 서열 독독을 분류 분류하며, 신뢰도 0.05.
  5. Kraken2 보고서 파일을 확인하여 전체 박테리아 및 곰팡이 독독 분류를 확인하세요.
  6. 각 샘플에 대해 박테리아와 곰팡이의 상대적 개체수를 계산하세요.

7. 클로로포름 훈연을 통한 토양 미생물 생물량 탄소 추정

  1. 신선한 토양 샘플을 미리 무게 측정한 팬에 무게를 재고 105°C에서 오븐에 24시간 건조하세요.
  2. 신토 무게에서 건조 토양 무게를 빼고 그 차이를 신토 무게로 나누어 토양 수분 함량을 계산합니다.
    수분 함량(%) = ((W, 습 윤 –서, 건조) / W,건조 × 100
  3. 수분 함량을 이용해 토양의 건조량을 계산하세요.
    건물질(%) = 100 – 수분 함량(%)
  4. 5g의 흙을 두 개의 개별 50mL 원심분리관에 넣고, 무연화되고 훈증된 라벨이 붙어 있습니다.
  5. 멸균되지 않은 표지된 튜브에 0.5 M K2SO4 총 25mL를 추가합니다.
  6. 연증되지 않은 샘플을 궤도 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 흔듭니다.
  7. 에탄올 프리 클로로포름 2mL를 훈증된 튜브에 직접 토양에 첨가하세요. 뚜껑을 닫고 파라필름으로 고정한 후, 실온에서 24시간 어두운 환경에서 배양하세요.
  8. 연미가 되지 않은 샘플을 실온에서 2,500 x g 에서 10분간 원심분리합니다.
  9. 훈증되지 않은 샘플에서 상청액을 디캔트하고, 0.45 μm 셀룰로오스 필터를 통해 걸러내어 -20 °C에서 보관합니다.
  10. 훈증된 샘플에서 뚜껑을 떼어내고 훈기 후드에서 2시간 배출한 후 K2SO4 추출(5-9단계 반복)을 수행하고 -20°C에서 보관합니다.
  11. '훈증' 및 '무훈증' 샘플의 탄소 농도를 총 유기 탄소 분석기를 사용하여 측정합니다.
  12. 다음 식으로 미생물 바이오매스 탄소(MBC)를 계산합니다: MBC = (훈증된 C 함량-무훈증 탄소 함량) /0.45. 토양 1g당 건조 중량에 대해 정규화합니다.

8. 토양 유기물 함량 추정

  1. 도자기 도가니를 105°C의 대류 오븐에서 30분간 건조한 후, 20°C(WC)로 식힌 후 무게를 재세요.
  2. 말린 도가니에 최대 2g의 흙을 넣고 다시 무게를 재세요.
  3. 토양 샘플을 채운 도가니에서 105°C의 대류 오븐에서 24시간 건조합니다.
  4. 밀폐된 건조기에 넣어 식힌 후 다시 무게를 재세요(WS).
  5. 머플 퍼니스를 550 °C로 예열한 후, 토양이 담긴 도가니를 4시간 동안 용광로에 넣습니다.
  6. 도가니와 흙을 난로에서 꺼내 건조기에 넣어 식히세요.
  7. 도가니와 흙(WA)을 재보세요.
  8. 550 °C에서 인큐베이션 전후 토양 건조 중량 차이를 계산하여 SOM 비율을 측정합니다.
    솜로이 = [(WS – W A)/(WS – WC)] × 100

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

토양 샘플은 다섯 곳에서 채취되었으며, 토양 유기물 함량은 점화 손실(ros-on-ignition)으로 측정되었습니다. 연구에 사용된 각 토양에서 토양 유기물 함량은 3.38%에서 10.34% 사이였습니다(표 1). 각 토양 샘플에 대해 세 배로 DNA 추출이 이루어졌으며, 결과 DNA 수량은 건조 토양 1그램당 32 ng에서 4,590 ng 사이였습니다(그림 3A).

유기물 함량이 다양한 토양 간 DNA 농도는 유의미하게 달랐다(일원 ANOVA p < 0.0001, R2=0.97). 유기물 함량이 가장 낮은 토양인 토양 A는 가장 낮은 DNA 농도를 보이지 않았다. 그러나 유기물 함량이 가장 높은 토양 E는 다른 모든 토양에서 유의미하게 더 높은 DNA 농도를 보였으며(A–D, p < 0.0001), 토양 B는 가장 낮아 A와 D와 크게 달랐다(p < 0.05). ddPCR 프로토콜은 16S 및 18S rRNA 유전자 프라이머를 사용해 각 토양 샘플에서 정제한 DNA에 대해 수행되었다. 16S(그림 3B)와 18S rRNA(그림 3C) 유전자 각각에 대해 토양 건조 중량당 1그램당 유전자 복제본 수는 ddPCR을 사용해 측정되었다. 모든 토양 샘플을 통틀어 18S rRNA 유전자의 복사본 수가 16S rRNA 유전자보다 적었다. Tukey의 사후 검사 결과, 토양 B는 건조 토양 그램당 평균 8.8 x 107 과 4.6 x 106 유전자 복제본으로 16S와 18S rRNA 유전자 복사본이 가장 적은 것으로 나타났다. 토양 E는 다른 모든 토양과 크게 달랐으며, 건조한 토양 그램당 각각 4.4 x 109 및 2.5 x 109 유전자 복사본을 가진 16S와 18S rRNA 유전자 복사본이 가장 많았습니다. 토양 A–D의 균류 복제본은 서로 유의미한 차이가 없었으나, 토양 D의 박테리아 복제본은 토양 B와 E와 유의미하게 달랐습니다.

각 토양 샘플에서 정제한 DNA에 대해 전체 게놈 샷건(WGS) 시퀀싱이 적용되었고, NCBI nr 데이터베이스에 대해 Kraken2를 사용해 분류학적 분류가 수행되었다. 박테리아 및 곰팡이에 대해 분류된 DNA 서열 전체 수를 사용하여 각 토양의 균류:박테리아 비율(F:B)을 계산하고, ddPCR로 추정한 유전자 복제 수에서 계산된 균류:박테리아 비율과 비교했다(보충 그림 1). ddPCR로 얻은 F:B 비율은 모든 토양 샘플에서 0.022에서 0.66 사이였으며, 전체 유전체 시퀀싱보다 높았다. 가장 높은 평균 F:B는 토양 E에서 관찰되었으며, ddPCR은 0.56, WGS 방법은 0.038이었다. 더욱이, ddPCR을 사용한 토양 샘플에서 WGS보다 더 넓은 범위의 F:B 값이 확인되었습니다. 또한, ddPCR 방법으로 결정된 F:B 비율과 WGS 데이터 사이에는 양의 상관관계가 관찰되었으며(r = 0.59, R2 = 0.35, p = 0.019), 보 충 그림 1에 나타났습니다.

박테리아와 곰팡이의 평균 유전자 복사본 수를 사용하여 계산된 유전자 복사본을 원시 샘플 내 박테리아 및 곰팡이 세포 수로 변환했다(보충 그림 2). 이 데이터는 토양 내 미생물 세포 총 수를 추정하기 위해 결합되었으며(그림 3D), 토양 간 유의미한 차이가 있었다(단방향 ANOVA p < 0.0001). Tukey의 쌍별 비교 분석에서는 토양 E에서 가장 높은 미생물 함량이 관찰되었고, 토양 B에서 채취된 샘플에서 가장 낮은 미생물 함량이 발견되었으며, 이는 A, D, E와 유의미하게 차이가 나타났다.

각 토양 샘플에 대해 3회 산화 처리를 수행하여 각 샘플의 총 미생물 생체량 탄소(MBC)를 추정하였다(그림 4A). 사용된 토양 전반에 걸쳐 건조 토양당 3.6에서 9.6mg 사이의 탄소가 확인되었으며, 각 샘플 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았다(일방향 ANOVA p = 0.266). 박테리아 및 곰팡이 세포의 평균 탄소 함량을 사용하여 ddPCR로 추정된 미생물 세포 수를 추정된 총 미생물 생체량 탄소로 변환하였다. 이 ddPCR 추정치는 클로로포름 훈증 방법(그림 4B)과 비교되었다. 클로로포름 연증으로 측정된 MBC와 ddPCR 방법 간의 관계를 평가하기 위해 피어슨 상관관계(n = 15)를 수행하였다. 두 방법 사이에는 양의 상관관계가 발견되었다(r = 0.43, R2 = 0.18, p-값 = 0.05). 유기물 함량이 가장 높은 토양 E에서 나온 이상치가 이 미지하게 유의미한 결과에 불균형적으로 기여했을 가능성이 있다(그림 4B).

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그림 1: 토양 샘플 처리 개요. 그림은 미생물 정량을 위한 토양 DNA를 이용한 분자 방법과 미생물 바이오매스 탄소 및 토양 유기물 측정의 기존 방법을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-2
그림 2: 16S와 18S의 ddPCR 복사본부터 최종 미생물 생체량 탄소 추정까지의 세포 계수 과정의 흐름도로, 프로토콜의 5.11–5.16단계를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

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그림 3: 토양의 미생물 정량. (A) 각 토양 샘플에서 정제된 평균 DNA 농도. (B) ddPCR을 사용한 토양 건조 중량당 16S rRNA 유전자 복사본 평균 총수. (C) ddPCR을 사용한 토양 건조 중량당 18S rRNA 유전자 복사본 평균 총수. (D) 토양 샘플 전반에 걸쳐 건조 중량당 평균 미생물 세포 총 수. 모든 오차 바는 평균의 표준오를 표시합니다. 쌍별 비교를 위한 일원 ANOVA와 이후 Tukey's Post-hoc 검정이 수행되었으며, 유의한 차이는 컴팩트 문자 표시기(유의성 임계값 = 0.05)를 사용해 보여줍니다. 샘플은 OM%가 낮은 순으로 정렬되어 있습니다. 토양 기원(OM%) A: 네덜란드(3.38), B: 이라크(5.14), C: 중국(6.41), D: 영국(8.19), E: 영국(10.34). 이 수치의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

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그림 4: 클로로포름 훈증 추출과 유전자 기반 세포 추정으로 측정된 미생물 바이오매스 탄소. (A) 클로로포름 훈증으로 추출한 MBC - 유기물 함량이 낮은 것부터 높은 것까지 배열됨. 오차 바는 평균의 표준오차를 표시한다. 쌍별 비교를 위한 일원 ANOVA와 이후 Tukey's 사후 검정이 수행되었으며, 유의미한 차이는 컴팩트 문자 표시(유의치 = 0.05)를 사용해 나타났다. (B) ddPCR 유전자 복사 번호에서 유도된 MBC(세포 gdw -1)에서 추정한 MBC(생체량 탄소로 변환)를 동일 샘플의 총 유기물과 대비하여 플롯됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 보시기 바란다.

샘플토양 기원pH수분 함량 %유기물%질감토지 이용
A텍셀, 네덜란드7.1619.043.38모래 양토원예
B나자프, 이라크7.588.335.14실트 양토쌀
C중국 장시성4.118.456.41실트 양토참깨/레이프시드
D영국 케임브리지6.8121.88.19실트 양토밀
E엑서터, 영국5.4420.2710.34실트 양토초원

표 1: 미생물 바이오매스 측정을 위한 다섯 개 토양 샘플(A–E)의 생화학적 특성 및 토지 이용 특성.

목표BP앞으로.뒷면참고문헌
16S rRNA1805′- ACTCCTACGGAGGAGGCAGG5′- 공격(Le Geay 등, 2024; Ovreås 등, 1997)
18S rRNA3515′-그그라악카카그카그5′-GSWCTATCCCCAKCCAGGA(Liu 외, 2012)

표 2: ddPCR을 사용하여 16S 및 18S rRNA 유전자를 표적으로 하기 위해 선정된 프라이머 쌍.

보충 그림 1: ddPCR 방법으로 결정된 모든 토양 샘플의 F:B 비율과 WGS 간의 상관관계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보충 그림 2: ddPCR 방법으로 측정한 다양한 토양 샘플의 세포 수가 (A) 박테리아; (B) 균류를 표적으로 삼았습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

토양 미생물은 육상 생태계에서 주요 분해자이며, 영양 순환과 토양 내 탄소 저장에 필수적인 역할을 합니다. 토양 미생물의 중요성에도 불구하고, 유전자 복사 기반 방법으로 절대 풍부도를 정량화하는 것은 어렵습니다. 이는 종마다 표적 유전자 수가 다양하다는 등 여러 요인 때문입니다. 본 연구는 ddPCR을 사용하여 원핵생물과 진핵생물을 표적으로 표적으로 16S 및 18S rRNA 유전자 코딩 영역을 통해 토양 미생물 생체량을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 토양 E에서 가장 높은 F:B 비율이 관찰되었으며, 이 샘플은 유기물 비율도 가장 높았습니다. 두 번째로 높은 F:B 비율은 샘플 C에서 관찰되었으며, 이는 이 토양들의 높은 산도와 상관관계가 있었습니다. 이는 pH31이 낮아질수록 곰팡이 성장이 증가하기 때문에 샘플 C와 E에서 예상된 결과입니다. 전체 유전체 시퀀싱은 ddPCR 방법에 사용된 동일한 DNA 추출물에 대해 수행되었다. WGS와 ddPCR 간의 F:B 비율이 비교되었다. WGS 데이터에서 계산된 F:B 비율은 ddPCR 데이터에서 계산된 F:B 비율에 비해 분석된 모든 샘플에서 낮았다. 그러나 샘플 간 F:B 비율의 전체 추세는 각 방법 간에 시각적으로 유사했다. 이로 인해 토양 샘플에서 전체 유전체 시퀀싱보다 F:B 비율이 더 높았고, 토양 유형에 따라 F:B 비율 변동성이 더 컸다. WGS 데이터에서 관찰된 낮은 F:B 비율은 균류와 박테리아 간 게놈 크기 차이 때문일 가능성이 높으며, 증도 농축 없이는 균류 서열이 과소 대표될 수 있다32. 더불어, 토양 A가 유기물 함량이 가장 낮음에도 불구하고 미생물 복제본과 미생물 바이오매스 탄소 수가 가장 적지 않아, 유기물 함량이 항상 미생물 바이오매스와 직접적으로 상관관계가 없다는 점을 강조합니다. 특히, 기원 DNA 농도(그림 3A)와 전체 미생물 세포(그림 3D) 간의 경향이 시각적으로 유사하여 DNA 농도가 미생물 바이오매스를 잘 대변하는 지표임을 시사합니다.

ddPCR은 토양 샘플 내 유전자 복제 수를 정확히 정량화할 수 있게 하며, 이 방법은 전체 미생물 세포를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 하지만 고려해야 할 한계가 있습니다. 16S 및 18S rRNA 유전자 복사본의 수는 미생물분류군 23 간에 크게 다릅니다. 따라서 유전자 복제 수에 단일 보정 인자를 사용하면 샘플33에서 미생물 풍부도를 과대평가하거나 과소평가할 수 있습니다. 이 한계는 미생물 군집에 대한 사전 지식을 반영하고, 전체 유전체 시퀀싱 데이터를 활용하며, 특정 토양 미생물군을 대표하는 적절한 유전자 복제수 보정을 적용함으로써 해결할 수 있습니다. 분자 방법은 여전히 정확한 수보다는 추정치를 제공하지만, 미생물 풍부도를 더 정확하게 예측할 수 있습니다. 군집 구성 데이터와 결합하면 상대적 풍부도를 넘어선 해석이 가능하다19,34.

클로로포름 훈증을 이용해 추정한 미생물 바이오매스 탄소(MBC)는 분석된 샘플 간에 유의미한 차이가 없었으나, 샘플 A–D 사이에서는 MBC의 큰 변동이 관찰되었습니다. 반면, ddPCR 방법으로 측정한 총 미생물 세포 수에서는 유의미한 차이가 관찰되어 이 분자 접근법이 기존 기법보다 더 높은 해상도를 제공할 수 있음을 시사합니다. 그러나 미생물 세포 수로부터 미생물 바이오매스 탄소를 계산하는 데는 자체적인 한계가 있습니다. 세포 크기의 변동성은 세포 수의 바이오매스 전환에 영향을 미칠 수 있습니다. 유전자 복제 번호에 단일 전환 인자를 사용하는 것과 마찬가지로, 박테리아 및 곰팡이 탄소 함량에 대해 단일 전환 인자를 사용하면 미생물 바이오매스 탄소의 과대평가가 발생할 수 있습니다.

더불어, DNA 기반 방법은 박테리아와 곰팡이 간 우성도 차이가 큰 토양과 비교할 때 특히 문제가 될 수 있다. DNA 추출 방법과 프라이머 설계 선택에 따라 DNA 수율과 GCN 모두 영향을 받을 수 있어 실험실 간 비교가 어렵다37. 또한 GCN과 DNA 수율 방법 모두 이른바 '유물 DNA', 즉 죽은 생물체나 점토에 결합된 DNA로 인해 과대평가될 위험이 있다14,38. ddPCR 방법이 더 나은 정밀도와 반복성을 보여주었음에도 불구하고, 복잡한 공정, 높은 비용, 그리고 Evagreen 화학5를 사용할 때 불특이적 DNA 염료 사용이 단점이 있습니다. 이로 인해 약한 위양성이 발생해 양성 방울과 음성 방울을 구분하기 어려울 수 있으며, 약간의 임계값 오조정이 유전자 복사본이 낮은14 시 F:B 비율에 영향을 줄 수 있습니다. 이 ddPCR 방법으로 처리할 샘플 수를 늘리기 위해, 액체 취급 로봇 자동화를 통해 DNA 추출과 반응 셋업39를 사용할 수 있습니다. 또한 새로운 ddPCR 시스템은 더 큰 다중화를 가능하게 하여 96개 샘플의 방적을 동시에 생성할 수 있습니다.

모든 미생물 바이오매스 측정값은 추정치이며,37 숫자를 산출하기 위해 일반화된 변환 계수를 포함한다는 점을 유의해야 합니다. 따라서 방법 간 비교는 어떤 방법이 가장 정확한지 알 수 없으므로 신중해야 합니다. 그럼에도 불구하고, 지난 수십 년간 클로로포름 증기를 이용해 토양을 훈증하는 클로로포름 훈증 추출 방법이 널리 사용되어 왔습니다. 이는 인간과 환경에 대한 독성뿐만 아니라 토양 미생물 세포를 용해하는 효과로 인해 많은 우려를 불러일으켰습니다40. 또한 클로로포름 훈증은 식물 잔류물과 같은 비생물 물질에서 생성된 MBC를 과대평가할 수 있습니다41. 마지막으로, 이 방법은 매우 적은 양의 토양(<500 mg)을 필요로 하는 다른 분자 방법에 비해 상대적으로 많은 양의 토양을 사용합니다.

이 연구는 ddPCR 기반 토양 미생물 바이오매스 측정 방법이 견고하며 다양한 토양 유형과 잠재적 억제제에 의해 영향을 받지 않는다는 증거를 제공합니다. 이 방법의 성공은 원시 DNA 샘플에 의해 좌우되므로, 샘플에서 효과적인 DNA 정제를 보장하는 것이 매우 중요합니다. 이 방법은 다양한 토양 유형과 질감에서 미생물 검출 및 정량에 가능성을 보여주며, 기존의 미생물 바이오매스 추정 방법을 보완하고, 지역 또는 글로벌 마이크로바이옴 감시를 위한 토양 건강 및 확장성 모니터링에 대한 미래 가치 있는 응용을 가능하게 합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

니나 린드스트롬-프리겐스 박사, 리즈 크레시 박사, 조안나 사라고사-카스텔스 박사, 안젤라 엘리엇, 키스 얀 반 그로니겐 박사, 이안 하틀리 교수님께 감사드립니다. 또한 이 연구를 위해 토양을 제공해 주신 토지 소유주분들께도 감사드립니다. 이 연구는 셸 리서치 Ltd(CW648947-PT34767)의 지원을 받았습니다. 현재 연구 중 생성된 데이터셋은 NCBI 시퀀스 리드 아카이브 저장소 PRJNA1305539에서 확인할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
베터사이즈 S3 플러스 베터사이즈, 중국BT-803
원심분리기열과학 및 nbsp;SL16 
클로로포름  열과학L14759. AU 
ddPCR 96-웰 플레이트바이오-래드, 왓포드, 영국12001925
ddPCR 드롭렛 리더 오일  바이오-래드, 왓포드, 영국1863004
데시케이터 데이비실
DG8 카트리지 홀더바이오-래드, 왓포드, 영국1863051
QX200/QX100 드롭렛 제너레이터용 DG8 카트리지바이오-래드, 왓포드, 영국1864008
QX200/QX100 액자 발생기용 DG8 가스켓바이오-래드, 왓포드, 영국Q33265
DNeasy Power Soil 프로 키트  치아겐, 독일47017
이중 가닥(dsDNA) 광범위(BR) 분석 키트인비트로젠, 독일Q33230
FastPrep-24 5G  영국 의원 생의학116005500
그리드온 옥스퍼드 나노포어 테크놀로지스, 영국GRD-MK1CAPX
K2SO4머크, 영국7778-80-5
마그네그틱 바인드 자기 비즈오메가 바이오텍, 미국M1378-01
MinION 플로우 셀옥스퍼드 나노포어 테크놀로지스, 영국플로-민114
묵직한 용광로탄산화물  AAF1100
네이티브 바코드 키트 24옥스퍼드 나노포어 테크놀로지스, 영국SQK-NBD114.24
PCR 플레이트 히트 씰, 호일, 피어서블  바이오-래드, 왓포드, 영국1814040
PX1 PCR 플레이트 실러바이오-래드, 왓포드, 영국1814000
큐비트 형광도계인비트로젠, 독일Q33226
QX200 액적 디지털 PCR 시스템바이오-래드, 왓포드, 영국1864001
QX200 ddPCR 에바그린 슈퍼믹스바이오-래드, 왓포드, 영국186-4033
QX200 방울 생성 오일(EvaGreen  );바이오-래드, 왓포드, 영국1864005
QXDx 액적 발생기 바이오-래드, 왓포드, 영국12001049
센소퀘스트 LABCYCLER Geneflow, 독일1120280125

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