자동 세포 분할을 이용한 1차 인간 기도 상피 배양에서의 형광 기반 칼슘 영상

요약

칼슘 신호의 생세포 영상은 단일층에서 배양된 안정적인 세포주에서 칼슘 동원을 연구하는 데 광범위하게 활용됩니다. 이 프로토콜은 복잡한 1차 조직에서 생세포 염료를 이용한 칼슘 신호전달의 생세포 형광 영상을 설명하며, 기계 학습 소프트웨어를 활용해 수천 개의 개별 세포의 형광 강도를 동시에 정량화하여 분석을 간소화합니다.

초록

칼슘 신호 전달은 다양한 생물학적 과정에서 매우 중요하며, 원발 조직에서 칼슘 플럭스를 연구하는 방법을 개발할 필요성을 강화합니다. 복잡한 1차 상피 배양에서 단일 세포 해상도로 칼슘 신호 전달을 연구하는 것은 도전적이며, 따라서 연구가 부족한 상태입니다. 본 연구는 일차 기도 상피 배양에서 실시간 칼슘 신호 전달을 모니터링하기 위한 방법과 기계 학습 기반 분석을 위한 새로운 접근법을 제시합니다. 환자 유래 1차 기도 상피 배양을 ALI(공기-액체 인터페이스)에서 분화하고 외부 형광 지시 염료를 주입하여, 칼슘 이동을 단일 세포 해상도로 후반형광현미경으로 측정하였다. 우리는 머신러닝 기반 세포 분할을 활용해 시간이 지남에 따라 각 세포에 형광 강도를 할당하는 새로운 소프트웨어를 개발했습니다. 전반적으로, 적응된 영상 장비와 소프트웨어는 1차 상피 배양 내 단일 세포를 빠르고 편향 없이 분석할 수 있게 합니다. 여기서 제시하는 단계별 프로토콜은 향후 개별 세포와 1차 상피 배양을 구성하는 세포 유형 내 칼슘 연구를 가능하게 할 것입니다.

서론

세포 내 칼슘 동원 변화는 유전자 발현 변화와 선천 면역 반응 조절 등 다양한 세포 과정을 결정합니다 ^1,2. 세포 내 칼슘 수치는 소포체와 미토콘드리아 ^1,2,3과 같은 세포 내 칼슘 저장고에서 방출됨을 통해 변화할 수 있습니다. 세포 내 공간으로의 세포외 칼슘 유입은 수동적 및 능동적 운반을 통해 세포질 칼슘을 변화시킬 수 있습니다^. 칼슘 이동의 생세포 영상은 주로 세포 내 염료 또는 유전적으로 암호화된 염료인 GCaMP(녹색 칼슘 활성화 다중체/^단백질)4에 의해 분석됩니다. 문헌에서 흔히 사용되는 것은 AM(아세톡시메틸) 공액 염료로, 염료가 원형질막 5,6,7,8을 통해 침투할 수 있게 합니다. 세포에 들어가면 AM 모이에티는 내인성 세포 내 에스테라제에 의해 절단되고, 염료는 음전하를 얻어 세포질^{공간 9}에 갇히게 됩니다. 이 전하가 증가함에 따라 염료는 원형질막에 상주하는 유기 음이온 채널을 통해 배출될 수 있습니다. 따라서 유기 음이온 배출체 억제제인 프로브네시드가 염료의 세포 유출을 방지하고 최적의 세포질 신호를 유지하기 위해 첨가된다^10,11. 연구에서는 일반적으로 비율 염료인 Fura-2 AM과 강도계 염료인 Fluo-4AM을 사용하여 단일층 배양된 안정 세포주에서 칼슘 신호를 분석합니다. 이 연구는 최근 개발된 강도계 칼슘 염료인 Cal-520 AM을 사용하여 공기-액체 계면에서 배양된 다층 배양물의 후반형광 영상 프로토콜을 적용하는데, 이 염료는 Fluo-4 AM에 비해 감도가 향상되었습니다. 따라서 복잡한 1차 상피 배양에서 단일 세포 해상도로 미묘한 신호를 강력하게 시각화하는 데 적합합니다. 현재 문헌은 안정적인 세포주에서 벌크 반응을 실시간으로 담은 칼슘 영상이 풍부합니다. 그러나 현재는 생체 내에서 조직이 다양한 세포 구조를 구성하며, 조직 항상성 유지에 있어 다양한 세포 유형별 역할을 지지한다는 것이 널리 알려져 있습니다.^{12, 13, 14, 15}. 이러한 공통된 지식에도 불구하고, 서로 다른 세포 유형들이 칼슘 신호를 조정하고 칼슘 이온 항상성을 조절하는 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 따라서 여기서 제시된 방법들은 단일 세포 칼슘 신호 검출을 가능하게 하고, 원발 기도 조직에서 하위 분석 처리량을 향상시킬 것입니다.

우리는 이전에 발표되고 엄격히 검증된 인간 비강 상피 1차 배양 모델을 활용하여 생물학적으로 더 적합한 생세포 및 세포질 칼슘 이미지를 구현하는 도구로 활용하고 있습니다^{16, 17, 18}. 간단히 말해, 상피세포는 환자의 비강 브러시에서 분리되어 반투과성 막 위에서 배양되며, 트랜스웰은 배양 웰 내에 현탁되어 공기-액체 인터페이스(ALI)를 유지합니다. 이 인터페이스는 특수 배지와 결합되어 서로 다른 세포 유형 16,17,18의 존재를 위해 직교 기법을 사용해 엄격히 검증되었습니다. 더불어, 현재의 방법들은 1차 비강 배양과 유사한 방식으로 배양되는 1차 기관지 배양에도 적용 가능하다는 것이 밝혀졌습니다¹⁹.

이 글에서는 이러한 1차 기도 상피 배양에서 단일 세포 해상도로 생생 칼슘 신호를 측정하고 분석할 수 있는 적응된 방법을 소개합니다. 이러한 다층 배양은 현미경으로는 시각화하기 어렵습니다; 하지만 현재 구조는 다층 배양 내 단일 층에 신뢰성 있게 집중할 수 있게 해주어, 이 특정 층에서 칼슘 이동을 감지할 수 있습니다. 이 방식은 관류 시스템이 필요하지 않다는 점에서 여러 가지 장점이 있는데, 관류 시스템은 비용이 많이 들고 특수 현미경을 사용하지 않으면 적응이 어렵습니다. 공초점 영상에 비해 시간 해상도가 향상된 에피형광 현미경이 사용되었습니다. 발광 다이오드(LED)의 사용은 레이저 기반 공초점 시스템에 비해 광독성을 최소화합니다. 여기 제시된 프로토콜에서는 외부 강도 염료가 사용되는데, 이는 전체 세포 집단에서 칼슘의 빠르고 상대적인 변화를 가능하게 하며 대부분의 형광 현미경 장비와 호환됩니다. 이는 많은 현미경에서 제공되지 않는 깊은 자외선(UV) 여기가 필요한 일반적인 비율 염료보다 유리합니다. 더불어, GCaMP는 트랜스펙션 또는 트랜스듀션이 필요하므로, 특정 세포 유형에서 보다 표적화된 칼슘 이미징을 위한 기술을 강화합니다. 1차 상피 배양에서 전도 및 형질전환 효율이 낮기 때문에, 이 기법은 전체 세포 집단을 모니터링하는 데 적합하지 않습니다.

또한, 이 연구는 생체 핵 염색을 기반으로 단일 세포 분할을 가능하게 하는 새롭고 특화된 머신러닝 기반 소프트웨어를 개발했습니다. 소프트웨어는 각 세포의 형광 강도 값을 시간에 따라 기록할 수 있습니다. 초기 방법은 안정된 상피세포주(Calu-3)를 사용했습니다. 그 후 이 방법들은 1차 상피 배양에서 단일 세포 칼슘 이동화 연구를 위해 전환되었습니다. 칼슘 염료와 프로브네시드의 농도, 인큐베이션 단계 타이밍, 영상 설정 등 변수들이 최적화되었습니다. 여기서 칼슘 신호는 0.2 fps(초당 프레임)의 프레임 속도로 기록되며, 이는 칼슘 신호 모니터링에 적합합니다. 더 빠른 칼슘 과도성을 측정하기 위해 프레임 속도를 높일 수^{있습니다.} 최적 변수들은 더 복잡한 1차 비강 배양에서 적용되고 추가로 최적화되었습니다.

프로토콜

시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 칼루-3 세포 유지 및 배양

1. Calu-3 세포를 EMEM 배양 배지 내 T-25 플라스크에 유지하며, 20% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충합니다. 배지를 예열하고 격일로 교체하세요(플라스크당 5mL).
2. 플라스크 내 세포가 70% 수렴하면 플라스크 내 배지를 흡인합니다.
3. 플라스크를 5mL 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 세척하세요.
4. 37°C, 5%_CO2에서 10-15분 동안 1mL TrypLE를 세포에 직접 첨가합니다. 모든 세포가 플라스크 바닥에서 분리되어 단일 세포 현탁액으로 분리되었는지 확인하세요.
5. 4mL의 신선한 배양 배지로 반응을 중화시키고(1.1단계), 세포를 혈청학적 피펫으로 잘 혼합하여 균일한 씨앗을 확보합니다.
6. 셀을 90%-100% 합류(약 40,000 셀/웰) 플레팅 시 96웰 플레이트에 부착합니다.
   1. 씨앗 웰을 만들기 위해서는 웰당 200 μL의 잘 혼합된 세포 현탁액을 추가합니다.
   2. 세포가 96웰 플레이트에 밤새 달라붙도록 하세요.
7. 실험 준비가 될 때까지 매일 매개체(200 μL/웰)로 매개체를 교체하세요.
8. 우물 내 합류 후 2-5일 동안 실험을 시작한 후 분별을 위해 실험을 시작하세요.

2. Calu-3 세포에 Cal 520 AM 또는 Fluo-4 AM을 장착하는 프로토콜

주의: 플루오-4 AM과 Cal-520 AM은 DMSO에 용해되어 위험하다고 간주됩니다. 프로베네시드는 급성 위험으로 분류됩니다. 화학물질을 다룰 때는 피부 접촉을 피하기 위해 장갑과 실험복을 착용해 주시기 바랍니다. 모든 화학물질은 지정된 화학 폐기통에 버리세요.

1. 실험 당일, 웰에서 배지를 피펫팅하여 세포를 두 번(200 μL/웰) 세척 후 예열된 칼슘 버퍼(140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂ 2 mM CaCl₂ , 10 mM Hepes, pH 7.38 (NaOH) 291 mOsm에 조정하여 죽은 세포를 제거합니다.
2. 3 μM Cal-520 AM, 2.5 mM 프로브네시드, 1:5000 호에스트 핵 염색제를 칼슘 완충제(단계 2.1)에 넣은 200 μL 혼합물로 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 세포를 인큐베이터에서 인큐베이터로 인큐베이션합니다.
   1. Fluo-4 AM 실험을 위해, 3 μM Fluo-4 AM, 2.5 mM 프로브네시드, 1:5000 호에스트 핵 염색액을 칼슘 완충제에 넣어 200 μL/웰 양의 세포를 37 °C, 5%_CO2에서 1시간 동안 인큐베이션합니다.
      참고: 염료 튜브는 알루미늄 호일로 덮어 어두운 곳에 두세요.
3. 배양 중에는 칼슘 완충제에 타프시가르긴을 준비하세요(2.1단계). 중간 토재 농도를 조정하여 유정 내 적절한 최종 농도를 확보하세요.
   참고: 여기서는 기존 칼슘 완충제 100 μL에 50 μL의 약물을 첨가합니다. 따라서 6 μM 중간 스톡 3개를 준비했습니다.
4. 1시간 후에는 피펫으로 염료를 흡입한 후 칼슘 완충제(단계 2.1)로 세포외 염료를 두 번(200 μL/웰) 세척합니다.
5. 세척 후에는 칼슘 버퍼에 희석된 2.5 mM 프로브네시드 100 μL/웰(단계 2.1)을 추가하여 세포질 공간에 염료를 유지합니다.
6. 접시를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 보호하세요. 세포들은 이제 영상 촬영 준비가 완료되었습니다.

3. Calu-3 안정 세포주를 위한 현미경 설정

1. SuperFluor 대물렌즈, 안정적인 고체 광원, CMOS 형광 카메라(6.5 μm 픽셀 크기)가 장착된 에피형광 현미경을 사용했습니다. 조명 강도는 500 mW로 설정되어 있습니다.
2. 96웰 플레이트 어댑터를 사용해 셀 플레이트를 스테이지 위에 올려놓으세요. 브라이트필드를 사용하면, 저배율로 셀 층에 초점을 맞추어 셀의 단일층을 찾으세요(5-10배 공기 대물렌즈 사용).
   참고: 이 단계는 선택 사항이지만, 세포층에 초기부터 집중하는 데 도움이 됩니다.
3. 셀 층이 확인되면 브라이트필드를 사용해 더 높은 배율(20배 대물렌즈)으로 전환한 후 셀 층에 다시 초점을 맞추세요.
   참고: 브라이트필드를 사용할 때 단일층에 적절한 초점을 맞추세요; 셀 경계는 명확해야 합니다.
4. GFP(475nm LED)를 사용해 칼슘 염료 신호를 식별합니다. 광표백을 방지하기 위해 LED 출력이 5%-10% 사이로 떨어지도록 하고, 노출 시간은 신호가 과포화되지 않고 기준 녹색 신호를 시각화할 수 있는 적절한(보통 300-500ms 사이)이어야 합니다.
   참고: 재현성과 염료 적재를 고르게 하기 위해 세포층을 정성적으로 분석하라; 대부분의 셀은 같은 밝기를 보여야 합니다. 자극제가 첨가되기 전에 죽은 세포가 강하게 빛나는 제한된 시야에 집중하세요. 상대적 기준선 형광 강도는 피지(단계 7.9)를 사용하여 측정할 수 있습니다. 염료가 고르게 적재된 경우(단계 7.9) 세포 간 기준 형광 변동은 약 10%-15%에 가까워야 합니다.
5. DAPI(405nm) LED를 사용해 호에스트(Hoechst) 핵 염색을 식별합니다. LED 출력은 2%-5% 사이여야 하며, 노출 시간은 50-100ms 사이여야 합니다.
   참고: 세포가 초점이 맞으면 핵은 선명한 윤곽으로 나타납니다. 핵 신호가 포화되지 않도록 주의하세요. 핵이 녹색 채널에 간섭할 수 있기 때문입니다.

4. 라이브 칼슘 비디오 획득

1. 5초마다 1프레임(0.2fps) 간격으로 10분 동안 라이브 비디오를 시작합니다.
   참고: 각 프레임에서 각 형광 채널(DAPI 405nm, GFP 475nm)을 캡처하세요.
2. 영상이 시작되면 작용제를 추가하기 전에 5분간 기준 측정을 허용하세요.
3. P200 피펫을 사용하여, 3배 중간 스톡에 50 μL 타프시가르긴을 칼슘 버퍼 내 2.5 mM 프로브네시드 100 μL 유닛이 든 웰에 첨가합니다(단계 2.1). 우물 안에서 1-2번 부드럽게 재현탁하여 약물이 고르게 분산되도록 하세요. 타프시가르긴을 추가한 후 5분간 계속 읽어주세요.
   참고: 약물 첨가 단계는 매우 중요합니다; 피펫 팁이 플레이트에 닿아 초점면을 이동시키면 안 됩니다. 대신 피펫 팁을 웰 내 버퍼에만 닿도록 부유하게 떠 있게 하세요. 약물이 너무 강하게 혼합되면 세포가 플레이트에서 떨어져 나가 신호에 방해가 될 수 있습니다.
   참고: 후속 분석을 위해 약물이 첨가되는 프레임을 반드시 기록하세요.
4. 실험 전에 찍은 영상과 스냅샷을 저장하세요. 데이터 분석으로 넘어가세요.

5. Cal 520 AM 또는 Fluo-4 AM으로 1차 기도 세포를 장전하는 프로토콜

1. 실험 당일에는 트랜스 웰에서 기저외측 배지를 제거하고, 750 μL 기저외측 및 300 μL 칼슘 완충제를 사용해 삽입물의 꼭대기와 기저외측 측면을 두 번 세척합니다(단계 2.1).
2. 세포를 600 μL 기저측측 염료와 200 μL 꼭대기 염료로 37 °C와 5%_CO2에서 1시간 배양합니다. 염료는 Calu-3 세포와 마찬가지로 Cal-520 AM, 3 μM Cal-520 AM, 2.5 mM 프로브네시드, 1:5000 호에스트를 칼슘 버퍼에서 준비합니다(단계 2.1). 동일한 칼슘 완충액에서 Fluo-4 AM, 3 μM Fluo-4 AM, 2.5 mM 프로브네시드, 1:5000 Hoechst에 대해
3. 인큐베이션 기간 동안, 3× 중간 스톡에서 최종 농도인 2 μM(6 μM 중간 스톡)의 타프시가르긴을 준비합니다.
4. 그 후 염료를 흡인하고 칼슘이 포함된 300 μL 꼭두막과 750 μL 기저외측 완충제로 세포를 두 번 세척합니다(단계 2.1).
5. 세척 후에는 2.5 mM 프로브네시드 100 μL 첨단 및 500 μL 기저측 칼슘 완충제에 첨가합니다(단계 2.1).
6. 변속기를 플레이트 안에 잘 넣고, 플레이트를 호일로 감싸세요. 세포들은 이제 영상 촬영 준비가 완료되었습니다.

6. 1차 비강 삽입물을 위한 현미경 설정

1. 영상 촬영에 적합한 유리 바닥 페트리 접시, 핀셋, 얇은 마스킹 테이프를 구입하세요. 페트리 접시를 70% 에탄올로 빠르게 닦고 완전히 건조시키면 깨끗한지 확인하세요.
2. 유리 바닥 페트리 접시를 에피형광 현미경용 작은 원형 어댑터 안에 넣습니다.
3. 핀셋을 사용해 조심스럽게 인서트를 유리 바닥 접시 중앙에 놓으세요.
   참고: 인서트의 꼭대기 구획에 위치한 버퍼를 흘리지 않도록 주의하세요.
4. 약물 첨가 시 인서트가 움직이지 않도록 마스킹 테이프를 사용해 플라스틱 상단을 유리 바닥 접시 옆면에 고정하세요.
5. 인서트가 부착된 어댑터를 현미경 스테이지에 놓고 10배 공기 밝은 시야 대물렌즈를 사용해 세포에 초점을 맞추기 시작하세요.
6. GFP(475nm LED)를 사용해 칼슘 염료 신호를 식별합니다. 광표백을 방지하기 위해 LED 출력이 5%-10% 사이로 떨어지도록 하고, 노출 시간은 보통 300-500ms 사이로 기준 녹색 신호를 과포화 없이 시각화할 수 있도록 적절해야 합니다.
   참고: 적절한 칼슘 염료 적재를 위해 3.4단계 주의사항을 참고하시기 바랍니다.
7. DAPI(405nm) LED를 사용해 호에스트(Hoechst) 핵 염색을 식별합니다. LED 출력은 2%-5% 사이여야 하며, 노출 시간은 50-100ms 사이여야 합니다.
   참고: 세포가 초점이 맞으면 핵은 명확하고 뚜렷한 윤곽선으로 나타날 것입니다. 가장 끝부분의 세포층에 집중하세요. 현미경의 z축을 조정하여 세포가 선명하게 초점을 유지하는 가장 높은 초점면을 식별합니다. 핵 신호가 녹색 채널에 간섭할 수 있으므로 핵이 포화되지 않도록 주의해야 합니다.
8. 라이브 칼슘 영상을 얻으려면 5.1-5.4단계를 따라 하세요. 약물 첨가 단계에서 인서트 중앙에 첨가하고 P200 피펫을 사용해 천천히 재현탁합니다.
   참고: 후속 분석을 위해 약물이 첨가되는 프레임을 반드시 기록하세요.

7. 피지 소프트웨어를 이용한 분석

1. 피지 애플리케이션을 열고 파일 \ 열기를 선택한 후 동영상 파일을 업로드하고, 결과로 나오는 팝업 창에서 모든 기본 설정을 유지하세요.
2. 원한다면 이미지 \ 조정 \ 밝기/대비 항목에서 각 형광 채널의 밝기와 대비를 조절하여 세포를 가장 최적의 시야로 볼 수 있도록 하세요.
3. 셀 추적을 쉽게 하려면 이미지 \ 컬러 \ 머지먼트 채널 을 사용해 핵 염색 또는 밝은필드 채널을 병합하고, 팝업에서 각 채널별로 적절한 파일을 선택하세요.
4. 세포 경계와 핵 염색을 기반으로 특정 세포를 추적하려면 Analyze \ Tools \ ROI Manager 를 사용하고, 팝업에서 모두 표시와 라벨을 모두 체크하세요.
5. 프리핸드 선택 도구로 셀을 조심스럽게 따라 그리고, t를 눌러 셀을 추가하세요.
   참고: 영상의 4개 모서리와 중앙 모두에 셀이 트레이싱되도록 하세요.
6. 모든 셀이 정확히 추적되면, 모든 ROI가 표시된 열린 탭에서 More \ Multi Measure를 클릭한 후 팝업에서 확인 버튼을 누르세요.
7. 결과물인 '결과 '라는 팝업에 있는 전체 시트를 엑셀 파일로 복사하세요.
   참고: 결과 시트에는 각 ROI마다 6개의 소제목(Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1)이 붙으며, 각 항목 뒤에는 추적된 셀에 해당하는 수치가 붙습니다. 하위 분석에서 중요한 값은 각 ROI의 평균입니다.
8. 형광 강도 간 변동을 모니터링하기 위해 각 세포의 기준선 평균 형광을 계산하고 백분율 분산을 계산합니다. 실험은 일반적으로 20%에서 30% 사이의 분산을 가집니다.
   
9. 각 추적 셀의 기준선 첫 번째 측정값으로 평균 강도 값을 나누어 모든 측정값을 정규화합니다.
10. 초 단위의 시간을 추가로 표시하는 열을 만들고, 첫 프레임은 프레임 0에 해당하고, 이후 시간점은 0.2 fps 간격에 해당하는 5만큼 증가합니다.
11. 데이터를 분석 및 그래프 소프트웨어에 복사하여 기준선 대비 형광 변화 곡선을 생성하세요.
    참고: 단일 셀 최대 플롯을 생성하려면 엑셀의 =MAX() 함수를 사용하여 각 셀에서 최대 형광 강도에 도달하는 프레임을 찾고 GraphPad Prism을 사용해 그래프를 작성하세요.

8. 칼슘 스위트를 이용한 분석

1. 피지를 사용해 영상 파일을 열고 8.1과 8.2 단계를 따라 하세요.
2. 핵 채널과 녹색 채널이 최적화되면, 이미지 \ 복제 버튼을 클릭하여 영상의 한 프레임을 복제하세요. 결과적으로 팝업에서 Duplicate Hyper stack을 선택 해제하세요. 같은 팝업 내에서 채널 아래에 1을 입력하세요. PNG 이미지 파일로 저장하세요.
3. 9.2단계와 채널 아래에 2유형을 반복하세요.
   8.3단계를 따라 두 이미지를 병합하세요. 이미지를 Cell-Pose GUI(그래픽 사용자 인터페이스)에 업로드하여 셀 마스크를 생성합니다.
4. 이미지를 세포 자세 GUI에 업로드하고, Cyto3 모델을 선택하여 핵 염색(채널 1)과 세포질 염색(채널 2)을 사용해 분할하세요.
5. 이미지를 PNG 파일로 저장한 후, 피지에서 PNG 파일을 열고 TIFF 파일로 변환하세요.
   참고: 셀 포즈 GUI는 흑백 PNG 파일을 생성합니다.
6. 칼슘 스위트에서 마스크 파일과 비디오 파일을 드래그 앤 드롭으로 열고, 분석 데이터를 클릭하면 다운로드 가능한 그래프와 소프트웨어가 세한 모든 셀에 대해 정규화 및 원시 강도 값이 담긴 다운로드 가능한 .csv 파일을 생성합니다.

결과

생세포에서 칼슘 이동성을 측정하기 위해 Calu-3 세포 또는 분화된 1차 비강 배양물을 세포 내 염료와 함께 배양합니다. 칼슘 의존 신호의 상대적 변화는 세포 내 칼슘 저장 또는 세포 외 공간에서 세포질 내 칼슘 이동량의 증가로 측정됩니다. 세포질에 지속적으로 칼슘이 증가하는 것은 ER 거주 SERCA(Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) 단백질의 잘 알려진 가역적 억제제인 thapsigargin이 추가된 후 형광 증가로 나타난다²¹. 여기서 칼슘 분석법이 Calu-3 안정 세포주와 1차 기도 비강 배양 모두에서 견고하게 작동함을 보여준다.

현미경 기반 검사를 사용하면 개별 세포의 반응에 집중할 수 있습니다. 세포질의 형광 칼슘 염료를 기반으로 수작업으로 세포를 추적했으며, Hoechst 생체 핵 염색의 존재로 확인되었습니다(

토론

이 글에서는 생백신 1차 비강 및 기관지 배양과 안정적인 상피 세포주에서 단일 세포 칼슘 신호 전달을 분석하는 방법을 제시하였습니다. Cal-520 AM과 Fluo-4 AM 칼슘 리포터는 두 장비 모두에서 유용한 칼슘 지표입니다. Cal-520 AM은 Fluo-4 AM의 0.16에 비해 양자 수율이 0.75로 더 높고 칼슘에 대한 친화도가 약간 더 높아 더 민감합니다(Cal-520 AM의 Kd는 320 nM, Fluo-4 AM은 345 nM입니다). 더불어, Cal-520 AM은 Fluo-4 AM²²에 비해 세포 저류율이 향상된 것으로 보고되었습니다. 그러나 두 염료 모두 타프시가르진 매개 칼슘 방출에 대한 현재 연구에서는 좋은 성과를 보였다^22,23.

이 생물학적 모델은 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 플레이트 & nbsp;	Thermofisher와 nbsp;	142475
24웰 트랜스웰 인서트와 nbsp;	코닝	CLS3470-48EA
96웰 평평한 투명 바닥 검은색 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트	코닝	3603
Cal-520 AM	AAT 바이오퀘스트	21130	-20° 위치에 분리 및 저장; C, DMSO에 녹아
칼슘 스위트 소프트웨어	코드는 저희 연구실에 연락하여 요청할 수 있습니다
EMEM, 1x.	Wisent	320-005-CL	저장 온도는 4도; 참고;
태아 소 혈청	Wisent	080-450	-20° 위치에 분리 및 저장; C
플루오-4 AM	AAT 바이오퀘스트	20550	-20° 위치에 분리 및 저장; C, DMSO에 녹아
젠장	바이오샵	HEP001.5	상온에서 보관
Hoechst	Thermofisher와 nbsp;	H3570	저장 온도는 4도; 참고;
인간 상피 대장항생암 세포 계통	ATCC	HTB-55
염화마그네슘	시그마	7786-30-3	상온에서 보관
마이크로 디쉬 35mm, 낮은 유리 바닥	이비디	80137	상온에 보관 중이며;
페니실린-스트렙토마이신 용액	Wisent	450-200-EL	저장 온도는 4도; C
인산염 완충 식염수(PBS)	Wisent	3111-010-CL	상온에 보관 중이며;
염화칼륨	시그마	7447-40-7	상온에 보관 중이며;
프로베네시드	서모피셔	P36400	-20° 위치에 분리 및 저장; C, 수용성
염화나트륨	바이오샵과 nbsp;	SOD004	상온에 보관 중이며;
탑시가르긴과 nbsp;	서모피셔	T7458	-20° 위치에 분리 및 저장; C 용해된 DMSO
TripLE 익스프레스 효소(1X), 페놀 레드 & nbsp;	서모피셔	12605010	저장 온도는 4도; C