이 프로토콜은 신생아 마우스에게 소아 암세포를 정맥 주사로 전달하는 측두정맥 주입을 시연하여, 암에 대한 초기 면역 반응의 정밀하고 재현 가능한 모델링을 가능하게 합니다. 이 방법은 신생아 기간 동안 면역조절이나 치료와 같은 중재가 적용될 때 미치는 영향을 평가할 수 있게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
소아암의 절반 이상이 자궁에서 시작되며, 신생아 기리기까지 명백한 질환으로의 진행이 계속됩니다. 면역치료가 이제 많은 암 아동에게 새로운 치료 옵션을 제공하지만, 초기 면역이 암 진행과 치료 반응에 어떤 영향을 미치는지는 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 격차를 해소하려면 신생아 시기의 치료 개입을 평가해야 하는데, 이 시기의 면역 반응은 아동기 및 성인기와는 근본적으로 다릅니다.
여기서는 생물발광 생체 영상과 통합된 신생아 이식 모델을 설명하여 조기 면역 조절이 소아암에 미치는 영향을 조사합니다.
자궁에서 시작된 두 개의 암에서 유래한 루시페라제 표지 세포의 측두정맥 주입은 1–2일 생후 공동 수혜자에서 재현 가능한 종양 착립을 달성했으며, 시술 관련 사망률은 없고 생물발광 영상으로 높은 시술 성공률을 보였습니다. 감염 유발 면역 조절을 실험 변수로 사용하여, 이식 후 5일 후 쥐 거대세포바이러스에 의한 복막내 감염은 급성 림프구성 백혈병(ALL) 부담을 현저히 감소시키지만, 신경모세포종(NB)은 감소하지 않음을 보여준다. 이 플랫폼은 초기 면역 조절에 대한 암 특이적 반응 차이를 연구할 수 있게 하며, 초기 생애에서 면역-암 상호작용을 모델링할 때 종양 맥락의 중요성을 강조합니다.
이 방법론은 종합적으로 암 면역감시, 감염 기반 면역 조절, 치료 개입과 관련된 신생아 면역 기전을 탐구할 수 있는 다재다능하고 재현성이 높은 플랫폼을 제공합니다. ALL과 NB를 넘어, 이 접근법은 추가 소아 악성 종양 및 면역조절 전략에 적용되어 기전적 연구와 초기 암 중재의 전임상 평가를 지원할 수 있습니다.
서론
최근 면역치료의 발전은 특정 암 환자들의 치료 결과를 크게 향상시켰지만, 어린 아이들에게 최적의 적용을 위해서는 발달 중인 면역 체계가 암세포를 식별하고 제거하는 방식을 철저히 이해해야 합니다. 소아암의 약 50%가 자궁에서 발생하며, B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL)과 NB도 포함된다. 그러나 출생 후 사건이 질병 진행과 임상 결과에 결정적인 영향을 미친다는 증거가 늘어나고 있다.
신생아 면역 반응은 성인과 양적, 질적으로 다르다. 완전히 발달한 적응 면역이 없는 상황에서는 신생아 보호가 모체 항체와 선천 면역 세포에 크게 의존합니다. 그러나 이러한 선천적 효과체는 세포 내재적 저반응성과 면역억제 경로의 활성화 증가로 인해 성체 효과기보다 기능적으로 덜 효율적이며, 신생아가 특히 감염에 취약합니다 4,5,6. 그러나 이러한 특성들이 미성숙 면역체계가 효과적인 항암 반응을 일으키는 능력에 미치는 영향은 아직 잘 이해되지 않았습니다.
초기 생애에서 항암 면역을 모델링하려면 면역 기능이 제한된 짧은 출생 후 기간 동안 암세포와 면역 조절자 또는 병원체를 정확하고 재현 가능하게 전달해야 합니다. 측두정맥 주입은 이러한 요구사항을 가장 잘 충족하는 신생아 정맥 주사(IV) 투여 방법으로, 높은 시술 성공률, 낮은 사망률, 최소한의 취급 부담, 그리고 감염 도전 또는 치료 투여와 같은 순차적 개입과의 호환성을 제공합니다. 7,8,9,10.
본 연구에서는 이전에 검증된 신생아 정맥 분사 기술과 생체 내 생물발광 영상의 다양성을 바탕으로 이식 모델을 설명하여, 소아 암세포 진행에 대한 초기 감염의 영향을 연구하였습니다. 이 방법은 루시퍼라제 표지된 B-ALL 또는 NB 세포를 1–2일 된 새끼에게 정맥 주사로 전달하고, 출생 후 7일째(P7)에 마우스 거대세포바이러스(mCMV)를 복막 내 투여(iP)로 면역 조절할 수 있게 합니다. 암 진행은 감염 후 10일 후에 평가되었습니다(P17).
측두정맥 접근은 출생 후 제한된 창(P0–P3)으로 제한되지만, 이 방법론은 재현성과 실험적 통제를 향상시켜 초기 면역 기전이 암 면역감시, 감염-암 상호작용, 면역치료 반응에 미치는 영향을 조사할 수 있는 다재다능한 플랫폼을 제공합니다. 또한 이 접근법은 이식된 세포의 효율적인 귀환을 지원하여, 기전적 연구를 위한 질병 모델을 재현 가능하게 합니다.
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프로토콜
모든 절차(그림 1)는 캐나다 동물 관리 위원회 지침에 따라 수행되었으며, 브리티시컬럼비아 대학교 동물 관리 위원회(프로토콜 A23-0169)의 승인을 받았습니다.
1. 루시퍼레이스 표지 백혈병 세포의 생성
- 백혈병 Eμ-Ret 마우스에서 백혈병 세포 분리
- 1L 유도 챔버에서 5% 이소플루란과 1 L·min-1 산소를 투여하여 깊은 수술면(정상 반사 상실과 느리고 규칙적인 호흡 감소)을 달성할 때까지 마취합니다.
- 심마취가 확인되면 이소플루란을 중단하고, 동물을 다른 챔버로 옮기지 않고 높은 유량(표준 점진적 변위율의 3–4배, 예: 10L 챔버의 경우 6-8 L·min)으로 이산화탄소(CO₂)를 투여합니다. 호흡이 멈춘 후 최소 5분간 CO₂ 노출을 유지하여 사망을 보장하세요.
- 챔버를 열기 전에 폐가스를 배출하고 청소하세요.
- 심장 박동과 호흡 부재로 사망을 확인한 후, 기관에 따라 경추 탈구를 2차 신체적 방법으로 시행합니다.
- 시체를 생물안전 캐비닛으로 옮기고, 사망 여부를 재확인하며, 성별과 체중을 기록한 후 외부에 70% 에탄올을 뿌리세요.
- 복부 중앙 절개를 하고 피부와 복막벽을 반사한 뒤, 5mL 멸균 PBS로 비장을 절제합니다.
- 양쪽 다리의 경골과 대퇴골을 절리하여 과도한 조직을 제거하고, 무균 상태에서 비장을 절제합니다. 즉시 비장을 5mL 멸균 얼음 냉각 인산염 완충식염수(PBS) 용액으로 옮겨 세포 생존력을 유지하세요.
- 비장을 처리하세요.
- 비장 조직을 1× 적혈구(RBC) 용해 완충제 1mL에 균질화하세요(비장은 2 mL > 200 mg). 상온에서 2–3분간 배양하세요.
- 용염은 10 mL PBS + 2% 태아 소 혈청(FBS)(FACS 완충제)을 첨가하여 40 μm 체로 여과한 후 350 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
- 비장 펠릿을 5 mL FACS 완충액에 재현탁합니다.
- 골수를 처리하세요.
- 두 가지 골단을 모두 절제하고, 1mL 주사기와 29게이지 바늘을 장착해 15mL 튜브에 1mL FACS 완충제를 사용해 각 뼈를 세척합니다.
- 세포 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 버린 후 세포를 1× 적혈구 용해 완충액 1mL에 재현탁한 후 RT에서 2분간 배양하고, 10 mL FACS 완충액을 추가하여 소환 용해를 하고, 40 μm 체액으로 여과한 후 350 × g 온도에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
- 상원액은 버리고 1 mL FACS 버퍼에 피펫팅하여 재현탁합니다.
- 부드럽게 와류를 일으키고 필요하면 40 μm 체로 걸으세요.
- 200 μL 세포 배양 배지(예: Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 0.5 × 10^6 백혈병 세포를 재현탁하고, 20% FBS와 인터루킨-7(IL-7; 250 pg·mL-1)을 보충합니다.
일시정지: 세포 현탁액을 얼음 위에 최대 2시간 동안 보관한 후 염색하세요.
- 백혈병 세포의 렌티바이럴 전도:
- 종자 쥐 골수 유래 기질 세포를 24웰 플레이트에서 24시간 전에 웰당 1× 10^5 세포로 배치하여 부착을 허용하고 70–80% 합류도를 달성합니다.
- 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트에서 백혈병 세포(최종 부피 200 μL에 10^6 세포 0.5× 10^6개)를 배지합니다.
- 자기불활성화(SIN) 렌티바이러스 벡터를 추가하여, 클릭딱정벌레(CBR) 루시페라제와 증강 녹색 형광 단백질(eGFP)으로 구성된 이중 융합 리포터를 암호화하며, 감염 중수도(MOI)는 10–20, 바이러스 역가는 ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (전도단위/밀리리터)을 최종 전도부피 200 μL 내에 추가하고, 함께 polybren(8 μg·mL-1)을 함께 투여합니다. 시그마, H9268-5G).
주의: 폴리브렌은 고농도에서 세포독성이 있습니다. 8 μg·mL-1을 초과하지 마십시오. 렌티바이러스를 생물안전 수준 2(BSL-2) 격리 하에 처리하세요. - 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 1,200 × g 에서 실온(RT)에서 20분간 원심분리기를 보관합니다.
- 스피노큘레이션 후, 형질적 백혈병 세포를 기질 단층에 옮기고 37°C, DMEM 5% CO₂ + 20% FBS + IL-7(250 pg·mL-1)에서 24시간 배양하여 세포 생존과 리포터 발현을 지원합니다.
참고: 필요 시 24시간 후에 항생제를 추가할 수 있으나, 바이러스 전달 중에는 피해야 합니다. - 24시간 후에는 비부착 백혈병 세포를 채취하여 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS) 350 × g 4°C에서 20 분간 20분간 세척하여 잔류 바이러스와 폴리브렌을 제거합니다.
- 이식을 위해 멸균 PBS 내 세포를 1× 10^7 세포·mL-1 로 재현탁합니다.
일시 중지: 세척 후 이식 전 최대 48시간까지 세포를 동일한 배양 상태로 유지할 수 있습니다.
- 성체 NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스로의 이식
- 4주에서 6주 된 NSG 마우스를 수혜자로 사용하세요.
- 웜 패드나 열 램프를 사용해 꼬리 정맥을 확장시키기 위해 쥐를 5분간 따뜻하게 하세요.
- 아크릴 고정제로 마우스를 제압하세요.
- 29게이지 인슐린 주사기를 이용해 측면 꼬리정맥을 통해 100 μL 멸균 PBS에 100 μL × 10^6 세포를 주입합니다. 마취는 필요 없습니다(기관 지침에 의한 경우는 제외)
- 출혈을 막기 위해 주사 부위에 부드럽게 압박하세요.
주의: 누출을 피하세요. 정맥 주사에 성공하면 눈에 띄는 부종이 없습니다. - 쥐는 질병 발생 여부를 주 2회 모니터링하세요.
- GFP+ 백혈병 세포 분류
- 질병이 발병하면 백혈병 국가 중계 생쥐로부터 대변이나 비장을 채취하세요.
- 위에서 설명한 단일 셀 현탁액을 준비합니다.
- 생존 염료(7-AAD)를 사용한 염색 세포.
- GFP+ 백혈병 세포를 분류하기 위해 형광활성화세포 분류(FACS)를 사용하세요.
- 분류에는 고속 세포 분류기를 사용하고, 전방산란(FSC) 대 측면산란(SSC) 게이팅 전략을 따르→ 이물질 배제, FSC-A 대 FSC-H → 특정 싱글렛, 생존성 염료 음성→ 선택된 생세포, GFP+ 게이트→ 보고자 양성 백혈병 세포를 분리합니다.
- 분류된 세포를 DMEM + 20% FBS가 포함된 튜브에 수집합니다. 선별 후 순도: ≥ 95% GFP+ 세포.
일시정지: 분류된 세포는 냉동 보존 전 최대 2시간까지 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
- 분류된 세포의 냉동 보존
- 분리된 세포를 5× 10^6 세포/mL로 90% FBS와 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함한 냉동 배지에 재현탁합니다.
- 크라이오비아당 1mL를 분리하여 바이알을 이소프로판올 기반 냉동 용기에 넣고 −80°C에서 하룻밤(12–18시간) 보관합니다.
- 장기 보관을 위해 바이알을 액체 질소(LN₂)로 옮깁니다.
주의: DMSO는 독성이 있으며 피부를 통해 쉽게 흡수됩니다. 장갑을 끼고 빠르게 처리하세요.
일시정지: 세포는 신생아 이식 실험에 사용될 때까지 액체 질소에 장기간 보관될 수 있습니다.
2. 루시퍼레이스 표지 NB 세포의 생성
참고: TH-MYCN 형질전환 마우스는 자연적으로 NB 종양이 발생하며, 승인된 기관 동물 관리 프로토콜 하에 유지되었습니다. 사용되는 렌티바이러스 벡터는 1.2절에 설명된 것과 동일합니다.
- 종양 채취와 조직 해리
- 승인된 동물 관리 지침에 따라 종양 보유 TH-MYCN 마우스를 안락사시킴.
- 멸균 환경에서 피하 또는 복부 NB 종양을 채취합니다.
- 멸균 가위로 종양 조직을 무게 측정하고 ~1–2mm 조각으로 다지세요.
- 조직을 15mL 원뿔관 내 종양 조직 0.5g당 약 5mL 소화 완충제로 옮기며, DMEM, 디옥시리보뉴클레아제 I(DNase I; 50–100 U·mL-1), 콜라겐제 기반 효소 혼합물(최종 농도 10 μg·mL-1 )으로 구성됩니다.
- 37°C에서 150rpm의 흔들리는 인큐베이터에서 30분간 배양하세요.
주의: 효소 소화 시약은 피부와 눈 자극을 일으킬 수 있습니다. 장갑과 안구 보호구를 착용하세요. - 소화 후에는 부드럽게 피펫을 위아래로 움직여 조직을 더 해리시킵니다. 70 μm 셀 스트레이너를 통해 필터 현탁물을 신선한 튜브로 옮깁니다.
- 300 × g 에서 실온(20–22 °C)에서 5분간 원심분리기.
- 상정액을 버리고 10% FBS를 보조한 후 DMEM에 재현탁합니다.
- 1.1절에서 설명한 대로 RBS 용해 버퍼를 사용하여 적혈구 용해를 수행합니다.
- 300 × g 에서 5분간 원심분리한 후 10 mL 고포도당 DMEM에 펠릿을 재현탁하고, 10% FBS와 50 μM 2-머캅토에탄올을 보충합니다.
주의: 2-머캅토에탄올은 독성이 있고 휘발성이 큽니다. 화학 훈제 후드에서 취급을 하세요.
정지 시점: 세포는 전개 전 최대 1시간간 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
- 렌티바이러스 전도
- 펠릿 2를 300 × g에서 10^6 NB 세포× 5분간 투여하고 상원액을 완전히 제거합니다.
- 세포 펠릿을 14 μL 농축 렌티바이러스 벡터에 직접 재현탁합니다(1.2절에 설명된 벡터와 동일하며; 바이러스 역가≥ 1 × 10^8 TU·mL-1, 대략 MOI: 10–20).
- 세포-바이러스 혼합물을 37°C에서 5분간 가습 인큐베이터(% CO₂)에서 배양합니다.
- 200 μL 고포도당 DMEM + 10% FBS를 추가하고 37°C, 5% CO₂에서 2시간 동안 배양을 계속합니다.
주의: 렌티바이럴 벡터는 반드시 BSL 2 조건 하에서 취급해야 합니다. - 잔류 바이러스를 제거하기 위해 고포도당 DMEM으로 형질전환된 세포를 네 번 세척합니다.
- 트리판 블루 배제법을 사용해 생존 가능한 세포를 세어보세요.
중요: 기질 준비물을 조기 겔화를 방지하기 위해 항상 얼음 위에 보관하세요.
- NSG 마우스에 피하 이식
- 세포를 100 μL당 5× 10^6 세포로 냉각 기저막 기질 준비(성장인자 환원된 세포외기질 기질)에서 재현탁합니다.
- 6–8주 된 NSG 마우스(1.1절 참조)는 산소 내 2–3% 흡입 이소플루란을 사용해 마취합니다.
- 로드셀-매트릭스 혼합물을 27게이지 바늘이 장착된 사전 냉각된 1mL 주사기에 넣습니다.
- 100 μL 총 부피× 10^6 세포 5개를 옆구리 부위에 피하 주입합니다.
- 마취에서 완전히 회복할 때까지 쥐를 관찰하세요.
참고: 주사기 내부에서 굳어버리지 않도록 매트릭스와 혼합한 직후 주입하세요. - 종양이 지름 ~1cm까지 자랄 수 있도록 허용하세요.
- 셀 정렬
- 종양을 채취하고 2.1–2.2절에 설명된 단세포 현탁액을 생성합니다.
- GFP 발현을 기반으로 FACS로 루시퍼라제 표지 세포를 풍부하게 하며, 이는 1.4절에서 설명한 게이팅 전략에 따른 것입니다.
- 95% GFP 양 순도를 달성하기 위해 두 차례 순차적으로 분류≥ 수행합니다.
- 냉동 보존
- 1.5절에 설명된 냉동 보존 세포.
일시정지: 세포는 향후 이식 실험을 위해 액체 질소에 장기간 저장할 수 있습니다.
- 1.5절에 설명된 냉동 보존 세포.
3. 측두정맥 주입을 위한 세포 현탁 준비
- 루시퍼레이스 표지 백혈병 세포 또는 NB 세포를 37°C 수조에서 빠르게 냉동 보존하여 작은 얼음 결정이 남을 때까지 진행합니다.
- 즉시 70% 에탄올로 바이알을 소독한 후, 내용을 15mL 원뿔형 튜브에 담은 9mL의 미리 가열된 DMEM + 10% FBS 배지로 옮깁니다.
- 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 흡입한 후 펠릿을 멸균 얼음 냉각 PBS에 재현탁합니다.
- 트리판 블루 배제와 혈구계(또는 자동 세포 계수기)를 사용하여 생존 가능성을 판단합니다. 생존율이 80%인 서스펜션≥만 사용하세요.
- 세포 현탁물을 40 μm 셀 체에 통과시켜 덩어리를 제거합니다.
주의: 세포 덩어리는 실패한 주사와 조직 손상을 증가시킵니다. - 신생아당 10^4 백혈병 세포 1개(백혈병 이식용) 또는 10^4 NB 세포 5개(10^4 NB 세포 포함)×× 20 μL의 농도를 조절합니다.
- 세포 현탁액을 얼음 위에 보관한 후 주사기를 장전하기 직전에 부드럽게 섞어 균질성을 유지하세요.
일시정지: 생존율이 80%≥ 유지되면 주사 전 최대 2시간 동안 세포를 얼려 두세요.
4. 측두정맥 주입 (P1–P2 새끼)
참고: 신생아 측두정맥 주사는 마취 없이 시행할 수 있습니다. 그러나 움직임을 줄이고 주사 정확도를 높이기 위해 짧은 저체온 고정술이 흔히 사용됩니다. 일부 기관 동물 관리 위원회에서는 저체온 고정 시술을 허용하지 않으며, 연구자는 이 절차를 수행하기 전에 관련 기관 위원회와 협의해야 합니다. 귀하의 기관에서 승인을 받으면, 다음 단계들은 저체온증 고정에 효과적입니다.
- 멸균 냅킨을 안감한 작은 용기를 준비하고 얼음 위에 올려 미리 냉장하세요.
- 새끼 자리 (출생 후 1일-2일; P1–P2)를 용기 내부 냅킨에 붙여 저체온성 고정 시술을 2분에서 3분간 사용하다가 자발적 움직임이 현저히 줄어듭니다.
중요: 강아지가 얼음에 직접 닿지 않도록 하세요(항상 용기와 냅킨 차단막을 사용하세요). - 셀 현탁액 60 μL를 100 μL 유리 주사기에 주입하고 30게이지 바늘을 부착합니다. 현탁액을 다시 튜브 안으로 배출하여 주사기와 바늘의 빈 부피를 채우세요. 죽은 부피가 프라이밍되면, 공기 방울이 없도록 20 μL의 세포 현탁액을 흡입하여 주입합니다. 백혈병 세포와 NB 세포의 수혜자로 각각 BALB/c와 TH-MYCN 마우스를 사용하세요.
- 플렉시글라스 플랫폼 아래에 차가운 광원을 놓아 투명 조명 무대를 준비하세요.
- 주사 부위를 관찰하려면 확대 안경을 착용하거나 입체 현미경을 사용하세요.
- 무대 위에 중앙에 구멍이 뚫린 멸균 냅킨을 놓고 강아지를 측두정맥이 보이도록 위치시키세요.
- 주사 시 바늘을 안정시키기 위해 강아지 머리 옆에 작은 모델링 점토(플레이도우) 조각을 놓으세요.
- 바늘 베벨업을 눈에 보이는 측두정맥에 삽입하고 세포 부유물을 천천히 주입하며 혈관 충전 상태를 관찰하여 정맥 주사 투여가 성공했는지 확인합니다.
- 주사 후에는 멸균 면봉으로 주사 부위에 부드럽게 압박을 가하세요. 강아지를 따뜻한 회복 표면(약 37°C, 예: 수건 차단벽 아래 낮은 온열 패드)에 올려놓고 정상적인 움직임과 분홍색 색깔이 돌아올 때까지 기다립니다.
- 회복 후 5분에서 10분 정도 새끼를 관찰한 후 다시 암컷으로 돌려보내세요.
주의: 회복 중 과열을 피하세요. 장벽층을 사용하고 지속적으로 모니터링하세요. - 주사기를 즉시 PBS로 헹구고, 그 후 주사기 세척액으로 마무리한 후 70% 에탄올로 마무리하세요.
5. 바이러스 준비 및 감염
- 기관의 생물안전 및 동물 관리 승인에 따라 BSL-2 격리 하에 쥐 세포대바이러스(mCMV)와 관련된 모든 절차를 수행하십시오.
- 인증된 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 바이러스 재고를 관리하고, 지정된 BSL-2 절차 영역에서 동물 감염을 수행합니다.
- 인증된 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 바이러스 준비 및 취급을 수행하고, 지정된 BSL-2 절차 구역에서 동물 감염을 수행합니다.
- 실험실 코트나 일회용 가운, 장갑, 안구 보호 장비 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 모든 바이러스 함유 물질(주사기, 침구, 케이지, 표면)은 잠재적으로 감염될 수 있는 것으로 간주하세요.
- 날카로운 도구의 사용을 최소화하고, 바늘은 즉시 승인된 생물학적 위험 용기에 폐기하세요. 사용 후에는 작업면과 장비를 오염 제거하세요. 모든 고체 및 액체 폐기물을 기관 절차에 따라 생물학적 위험 폐기물로 처리해야 합니다.
- P7(백혈병 세포 이식 후 5–6일)에 쥐를 감염시킨다.
- 바이러스 알리코트를 얼음 위에서 녹이고, 부드럽게 역전시켜 섞은 후 준비 중에는 얼음 위에 보관하세요. 반복되는 냉동-해동 사이클을 피하세요(일회용 알리코트 사용).
- pbs × 2 10^5 플라크 형성 단위(PFU)/mL에 mCMV를 준비하고, 30게이지 바늘을 사용해 50 μL PBS에 1× 10^4 PFU를 복막 내 주입합니다. 복부 장기를 피하기 위해 오른쪽 하부 사분면에 얕은 각도로 주사하세요.
주의: mCMV는 전파성이 있습니다(BSL-2). 적절한 격리 및 오염 제거를 사용하세요. - 동물 식별, 나이, 실험군, 바이러스 용량, 양, 주입 세부사항을 기록하세요.
6. 생물발광 영상(BLI)
참고: 아래에 설명된 대로 P7(세포 주입 후 5–6일 및 감염 전)과 P17(감염 후 10일)에 BLI를 수행하십시오.
- D-루시페린을 10 μg·μL-1 용량의 PBS에 용해합니다. 0.22 μm 필터를 사용해 필터 멸균하고, 알리코트를 사용한 후 빛으로부터 보호된 −20 °C에서 보관합니다.
주의: D-루시페린은 빛에 민감합니다. 준비 및 사용 중 빛 노출을 최소화하세요. - 30게이지 바늘을 사용해 강아지당 50 μL의 D-루시페린 i.p.를 주사합니다.
- 산소(0.8–1.0 L·min-1)에서 아이소플루란(유도 3–4%, 유지 1.5–2%)으로 새끼를 마취합니다. 체온을 가열한 영상 장비(약 37°C)에서 유지하세요.
주의: 이소플루란은 휘발성 마취제입니다. 승인된 베이퍼라이저와 스캐빈저 시스템을 사용하세요. - 마취된 새끼를 소동물 영상 시스템에 넣으세요(기기 세부 사항은 재료표에 제공).
- D-루시페린 주입 후 10분 후 일관된 노출 설정을 사용하여 생물발광 및 X선 이미지를 획득하세요(BLI 설정: P7 이미지는 노출 시간 120초, P17은 30초, P7과 B17 이미지는 B4 비닝, 시야각(FOV) 25, f-스톱 1.2, 물체 높이 1.5, X-선 설정: 해상도 높음, 배율 높음).
일시정지: 이미지 파일 저장 직후; 분석은 나중에 완료할 수 있습니다. - 적절한 BLI 영상 소프트웨어를 사용해 각 마우스의 몸 전체를 포함하는 관심 영역(ROI)을 정의하고 방출된 빛을 광자·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1로 정량화하여 이미지를 분석합니다.
- 하류 통계 분석을 위해 정량화된 ROI 값을 내보내세요.
7. 세포 이식 마우스에서 백혈병 세포 채취
- 1.1절에 설명된 대로 백혈병 세포를 채취하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
8. 유세포 측측 염색 및 획득
- 세포 세기와 원심분리기 현탁액을 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 투여한 후, FACS 버퍼 내 1× 10^7 세포·mL-1 에 재현탁합니다.
- 100 μL(1× 10^6 세포)을 폴리스티렌 유동 세포검사 튜브에 옮깁니다.
- Fc 수용체 차단 항체(항-CD16/32; 튜브당 1 μL)를 추가하고 상온에서 5분간 배큐합니다.
- FACS 버퍼에 항체 마스터 믹스를 준비하고, 각 튜브에 CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC, 그리고 계통 음성 마커(TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP)를 100 μL FACS 버퍼 내 1 x 10^6 세포당 각 항체 1 μL 첨가합니다.
- 어두운 실온에서 20분간 배양하세요.
- 5 mL FACS 버퍼로 세척한 후 원심분리기를 사용하고, 7-AAD(3 μL)와 카운팅 비드(6 μL; 6,000 비드)가 포함된 200 μL FACS 버퍼에 재현탁합니다.
- 항체 포획 비드나 세포를 이용해 단일 염색 보상 대조군을 준비하고, 실험 샘플과 함께 대조군을 획득합니다.
- 표준 FITC/PE/APC/PerCP 검출기 설정과 중간 유량을 사용하여 유세포계에서 샘플을 채취합니다. 1,000개의 구슬을 모을 때까지 이벤트를 수집하세요.
- FCS 파일을 내보내고 유동 세포분석 소프트웨어(재료표에 나열 됨)를 사용해 확립된 게이팅 전략(그림 2D)을 사용해 분석합니다.
- 비드 또는 골수당 절대 세포 수를 계산하는데, 1,000개 구슬에서 획득한 목표 사건 수에 6의 스케일링 계수(6,000개 구슬 추가)를 곱하고, 염색된 세포 비율(1× 10^6 세포)을 기준으로 전체 장기 세포수로 정규화합니다.
9. 그래프 플롯 및 통계 분석
참고: BLI 및 유세포측 데이터에 대해 통계 소프트웨어 패키지(재료표에 등재됨)를 사용하여 그래프를 생성하고 통계 분석을 수행하세요.
- 데이터를 평균± 표준오차(SEM)로 제시합니다.
참고: 이 연구에서 동물은 제외되지 않았습니다. - BLI의 경우, P7과 P17에서 PBS와 mCMV 그룹을 별도로 비교하여 비쌍 Mann–Whitney 검정을 사용하고, Holm–Šídák 보정을 적용하여 시간대에 걸친 다중 비교를 조정합니다.
- 양측 무쌍 Mann–Whitney 검정을 사용하여 유세포 분석 결과를 분석합니다.
- 통계적 유의성을 p < 0.05로 정의합니다.
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결과
측두정맥 주입은 신생아에 백혈병과 신경모세포종 세포의 효율적인 이식을 가능하게 합니다
초기 감염이 소아 암 진행에 미치는 영향을 모델링하기 위해, 백혈병 성체 Eμ-Ret 마우스에서 유래한 루시퍼레이스 태그 B-ALL 세포 또는 죽어가는 Th-Mycn 마우스에서 유래한 NB 세포를 측두정맥을 통해 1–2일 된 공동 유전자 새끼에게 정맥 주사했습니다. 백혈병(그림 2A, n = 7)과 NB(그림 3A, n = 9)에 대해 BLI와 X선 영상을 사용하여 이식 5일째에 성공적인 이식이 확인되었으며, 측두정맥 주입이 시술 중 100% 성공했고 시술 관련 사망률은 없음을 보여주었습니다.
신생아 mCMV 감염은 백혈병 진행을 억제합니다
착립 확인 후, 신...
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토론
초기 면역 발달이 암 진행에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것은 연령에 맞는 면역조절 전략을 설계하는 데 필수적입니다. 본 연구에서는 출생 후 면역 미성숙의 중요한 시기에 암세포 부착과 면역 조절을 정밀하게 시간 조절할 수 있는 재현 가능한 신생아 이식 플랫폼을 설명합니다. 측두정맥 매개 정맥 주사 투여와 BLI를 결합함으로써, 이 모델은 초기 감염이 다양한 질병 맥락에서 소아암 진행에 어떻게 영향을 미치는지 체계적으로 조사할 수 있게 합니다.
이 접근법을 사용하여 신생아 mCMV 감염이 신생아 정맥주사 이식 후 백혈병 진행을 현저히 억제하는 반면, 동일한 실험 조건에서는 NB 진행에 영향을 미치지 않음을 입증했습니다. 이러한 상반되는 결과는 감염 유발 면역 조절이 조기 생애에서 맥락 의존적임을 강조하며, 소아 암과 면역 상호작용을 모델링할 때 질병 특이적 생물학의 중요성을 강조합니다.
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공개 사항
저자들은 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 캐나다 보건연구소(Canadian Institutes of Health Research)로부터 G.S.D.R.(MOP-126122)에 대한 운영 보조금으로 지원받았습니다. A.F.는 마이클 쿠치오네 소아암 연구 프로그램(MC3RP) 박사후 장학금을 수상했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100µL, Microliter Syringe, Luer Tip | Hamilton | 80601 | - |
| 30 G Needle | BD | 305106 | - |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | - |
| Ami-X 이미징 시스템 | Spectral Instruments Imaging | - | - |
| anti-mouse B220- APC | Biolegend | 103212 | - |
| anti-mouse CD19-FITC | Biolegend | 152404 | - |
| anti-mouse CD3ε- PerCP | Biolegend | 100326 | - |
| anti-mouse Ly-51-PE | Biolegend | 108308 | 또한 BP1이라고 함 |
| anti-mouse TER119- PerCP | Biolegend | 116226 | - |
| anti-mouse/human CD11b- PerCP | Biolegend | 101230 | - |
| Aura 소프트웨어 | Spectral Instruments Imaging | - | 버전 4.0.8 |
| BD Accuri C6 | BD | - | - |
| BD Fortessa X-20 | BD | - | - |
| Cleaning solution | Hamilton | 18310 | - |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 2770930 | 6 µL에는 6000개의 비드가 포함되어 있음 |
| D-Luciferin | GoldBio | eLUCK-1G | - |
| DMEM | Gibco | 11965092 | - |
| DNase I | Sigma | 1.13E+10 | - |
| Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged | FALCON | 352340 | - |
| FBS | Gibco | A5256701 | - |
| FlowJo 소프트웨어 | BD | - | v10.8 |
| GeltrexTM | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | - |
| GraphPad Prism 소프트웨어 | Dotmatics | - | v10.4.1 |
| LE.5209 냉광원 | Euromex | - | - |
| Liberase™ TM Research Grade | Sigma | 5.4E+09 | - |
| NSG 마우스 | Jackson Labrotary | 5557 | NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ |
| Polybrene | Sigma | H9268-5G | - |
| Purified anti-mouse CD16/32 항체 | Biolegend | 101301 | - |
| RBC 용해 완충액 (10X) | Biolegend | 420301 | - |
참고문헌
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