방법 논문

골 재생 및 스캐폴드 성능 평가를 위한 다중 모드 접근법

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DOI:

10.3791/69483

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2026년 2월 13일

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1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

이 논문에서

요약

우리는 다양한 계층적 수준에서 뼈 재생을 평가하는 프로토콜을 제안합니다. 이 다중 모달 접근법은 다양한 길이 척도에서 구조 분석을 가능하게 하여 시료 준비의 문제를 효과적으로 해결합니다. 또한 생체 재료가 뼈 재생을 촉진하는 효과를 평가하는 신뢰할 수 있는 워크플로우를 제공합니다.

초록

임플란트의 임상적 성공은 주로 뼈 수리를 촉진하고 골통합을 촉진하는 능력에 달려 있습니다. 새로운 비계 설계에 상당한 진전이 있었지만, 다양한 뼈 길이 척도에서의 임플란트 성공률에 대한 철저한 평가는 충분히 연구되지 않았습니다. 뼈는 계층적으로 조직된 조직으로, 콜라겐 섬유의 조직과 나노미터 및 마이크로미터 규모에서의 광물화부터 조밀하고 관할성 뼈의 거시적 배열에 이르기까지 복잡한 구조를 가지고 있습니다. 이러한 계층적 조직은 뼈 기능과 기계적 성능을 보장하는 데 매우 중요합니다. 이러한 맥락에서, 생체재료가 뼈 수리에 미치는 영향에 대한 포괄적인 평가는 이식 재료의 효과와 안전성을 평가하는 데 필수적입니다. 그러나 통합 다중 모달 분석을 위한 샘플 준비는 기술적인 도전 과제를 제시합니다. 이 연구에서는 다양한 계층적 수준에서 뼈 재생을 평가하고 새로 형성된 뼈와 이식된 비계 간의 인터페이스를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 뼈 수리 유도에 있어 비계의 효과를 평가하는 견고한 방법을 제공합니다. 선택된 3D 및 2D 영상 기법의 조합은 뼈 치유 과정에서 형성되는 복잡한 광물화된 조직을 제대로 평가하는 데 매우 중요합니다

서론

뼈는 복잡하고 계층적으로 조직된 조직입니다 1,2. 세포의 구조적 조직을 이해하는 것은 세포가 조직 구조에 어떻게 기여하는지, 구조 변화가 기계적 기능에 미치는 영향에 관한 근본적인 질문을 해결하는 데 필수적입니다. 이러한 맥락에서 부상 후 뼈 재형성은 여전히 연구의 중심 주제로 남아 있습니다. 골절 치유는 초기 염증 반응에서 시작해 혈관신생과 전구세포가 연골세포와 골모세포로 분화되는 복잡한 다단계 과정입니다. 생체재료가 골통합을 자극하는 역할, 특히 생체 적합성과 섬유성 캡슐화 방지 능력에 대해 많은 논쟁이 있습니다.

생체재료 자극 골통합을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 방법은 광학 현미경으로, 정량적 및 정성적 조직학적 분석을 모두 가능하게 합니다. 이 접근법은 뼈 임플란트의 성공을 평가하는 신뢰할 수 있고 효과적인 방법으로 입증되었습니다 7,8. 그럼에도 불구하고, 뼈 계층적 조직과 관련된 여러 문제들은 단일영상 접근법, 특히 조직학적 접근법으로 탐구할 수 없으며, 이는 적어도 부분적으로 이 방법의 확대율 제한으로 인해 제한된다.

3차원 영상기술의 발전은 뼈의 계층적 조직을 이해하는 데 필수적임이 입증되었습니다. 마이크로컴퓨터 단층촬영(microCT; 싱크로트론 방사선 또는 기존 실험실 기반 X선 소스)9,10,11, 슬라이스 앤 뷰 단층촬영(12,13,14)과 투과전자 단층촬영(투과전자 단층촬영)과 연계된 이중 빔 주사 전자현미경(FIB-SEM)과 같은 기법들은 다중 규모에서 뼈 구조에 대한 새로운 통찰을 제공했습니다.

다양한 3D 영상 접근법을 바탕으로, 뼈 계층적 조직 모델이 제안되었으며, 처음에는 뼈 구조 조직의 9가지 뚜렷한 수준이 확인되었습니다. 이 체계는 최근 약 12개의 계층적 수준을 포함하도록 개정 및 확장되었으며, 뼈 조직의 구조와 기능 간 관계를 탐구하는 데 귀중한 참고 자료가 되었습니다 2,17. 중요하게도, 이 제안된 계층적 모델은 부상 후 골 수리의 성공 여부를 평가하는 기초를 제공합니다. 재생된 뼈 조직이 고유의 계층 구조를 재현하는지 평가하는 것은 특히 손상된 부위에 생체재료가 사용될 경우 뼈 치유의 질 평가에 있어 핵심 기준입니다.

뼈 조직을 조사하기 위해 다중 영상 기법을 사용하는 것은 6,7,18,19,20 시점에서 논의되었지만, 다양한 영상 기법을 통합하여 여러 공간 규모에서 골 미네랄 조직을 평가하는 워크플로우에 대해서는 거의 탐구되지 않았습니다. 앞서 언급했듯이, 뼈는 유기상(세포, 콜라겐, 고분자)과 광물질화된 기질로 이루어진 복합 조직입니다. 시료 준비 관점에서 이러한 복잡성은 시료를 통한 용매 투과, 단단한 시료의 절획, 동일한 시료에 대한 다양한 이미징 전략의 통합과 관련된 기술적 도전을 제기합니다.

이 연구의 핵심 혁신은 3차원 이미징과 보완적 기법을 활용한 재현 가능하고 상관적이며 다중 규모의 영상 워크플로우를 구축한 점입니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이, 워크플로우는 동일한 샘플을 서로 다른 영상 기법으로 순차적으로 검사할 수 있도록 설계되어 있습니다. 이 중 일부 기법은 파괴적이거나 단면화가 필요하기 때문에, 작업 흐름은 비파괴 방법으로 시작해 절단이나 재료 제거를 포함하는 접근법으로 진행됩니다.

이 샘플 준비 및 분석 워크플로우는 피질 및 소뇌골, 착상 전 비계, 그리고 착상 후 뼈/생체재료 경계 평가 등 단단하거나 광물화된 표본에 널리 적용됩니다. 서로 다른 시야와 해상도 범위를 아우르는 영상 방식을 결합함으로써(그림 1B), 이 워크플로우는 센티미터 스케일에서 마이크로미터 및 나노미터 스케일까지 샘플 분석을 가능하게 합니다. 서열은 단일 표본에 대한 상관 분석을 지원하도록 최적화되어 있지만, 각 기법은 실험 목표에 따라 독립적으로 적용할 수도 있습니다. 이 접근법은 생체재료의 골통합을 상세히 평가하고 치유 부위의 재생된 골 성장 상태를 평가할 수 있게 합니다.

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프로토콜

이 프로토콜에서 제시된 결과는 이전 연구에서 수행된 실험 절차를 통해 얻어진 것입니다21. 모든 절차는 브라질 플루미넨시 연방대학교 실험동물 사용 및 관리 윤리 위원회(CEUA/UFF: 779)의 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해, 300에서 400g 사이의 수컷 위스타 쥐 20마리를 두 그룹, 샴 그룹과 cHA-미세구 이식 그룹에 무작위로 배정했습니다. 모든 동물은 경골 골단에 2mm 결손이 생기는 수술을 받았습니다. 샴 그룹은 비위축 결손에서 뼈 재생을 평가하기 위한 혈전 조절 역할을 했으며, 실험 그룹은 결함 부위에 이식된 CHA37 미세구체를 받았습니다. 7일과 21일 후, 동물들은 전신마취 과다복용으로 안락사되었고, 각 그룹과 시점(7일과 21일)에서 경골 블록을 채취했습니다. 광학 현미경과 마이크로CT를 통해 뼈의 질과 새로 형성된 뼈의 범위를 평가하였다.

1. 샘플 고정 및 수지 임베딩

  1. 안락사 직후에는 삽입된 생체 물질이 들어 있는 경골을 제거하고, 이를 카르노프스키 고정액(2.5% 글루타알데히드, 4% 포름알데히드 0.1M 카코딜레이트 완충제)이 담긴 바이알로 옮깁니다. 샘플은 최소 1일 이상 -4 °C에서 보관하세요.
    참고: 고정제는 휘발성 물질에 노출되지 않도록 연기 후드 아래에서 준비하고 다루세요. 모든 화학물질 취급은 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 하며, 필요할 때마다 추가적인 기술적 안전 조치를 시행해야 합니다.
  2. 고정액에서 0.1 M 카코딜레이트 완충액이 든 바이알로 샘플을 옮깁니다. 샘플을 부드럽게 회전시키면서 10분 간격으로 버퍼를 2번 교체하세요. 이 단계에서 작은 톱으로 샘플 가장자리를 다듬어 수지 침투를 촉진합니다. 샘플을 절단할 때는 0.1M 카코딜레이트 완충제에 적신 상태로 유지하여 건조를 방지하세요.
    참고: 샘플은 항상 샘플 부피의 최소 2배 이상의 버퍼 부피에 보관하세요. 이 프로토콜에 사용되는 모든 용액과 수지에 대해 이 규칙을 따라야 합니다. 위에서 언급한 화학 성분을 다룰 때는 연기 후드 안에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 고정액과 카코딜레이트 버퍼 폐기물을 명확하게 라벨이 붙은 화학적으로 호환되는 용기에 적절히 장착된 캡에 모으세요. 유해 화학 폐기물의 안전한 저장 및 폐기를 위한 기관 표준 운영 절차(SOP)를 준수하세요.
  3. 아세톤 농도(10%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%)를 사용하여 탈수 과정을 시작하세요. 샘플을 각 농도별로 30분간 회전시키세요. 100% 무수 아세톤 단계를 3번 반복하세요.
    참고: 아세톤을 다룰 때는 연기 후드 안에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 사용 후에는 명확하게 라벨이 붙은 화학적으로 호환되는 폐기물과 적절한 캡에 남은 용매를 수집하세요. 유해 화학 폐기물의 안전한 보관 및 폐기를 위한 기관 표준 절차(SOP)를 준수하세요.
  4. 샘플을 2:1, 1:1, 1:2 등 단계별 아세톤 대 수지 비율로 옮기며 스퍼 레진으로 침투하여 최종적으로 순수 수지로 전환합니다. 각 단계는 12시간 동안 진행되어야 하며, 상온에서 회전시키며 진행해야 합니다. 아세톤에서 수지로 침투한 후 순수 수지를 2배로 교체합니다. 마지막으로 샘플을 순수 수지가 포함된 몰드로 옮겨 70°C에서 24시간 중합합니다.
    참고: 수지는 데이터 시트에 따라 중간 경도를 달성하기 위해 준비되었습니다. 스퍼 레진을 다룰 때는 연기 후드 내부에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 사용 후에는 명확하게 라벨이 붙은 화학적으로 호환되는 폐기물에 남은 물을 적절히 맞춘 캡에 담아 수집하세요. 유해 화학 폐기물의 안전한 보관 및 폐기를 위한 기관 표준 절차(SOP)를 준수하세요.

2. 마이크로컴퓨터 X선 단층촬영(microCT)을 이용한 샘플 시각화

참고: 마이크로CT는 임플란트 위치 및 뼈 재생을 평가하는 데 사용됩니다. 또한 추가 분석을 위한 잠재적 관심 영역을 식별하는 데도 도움이 됩니다. 이 단계는 샘플을 수지에 내장한 상태로 수행해야 합니다.

  1. 제조사에서 제공한 샘플 홀더를 기반으로 사용하여 스캔 중 샘플이 움직이지 않도록 안전하게 위치시키세요. 지지용으로 폴리스티렌, 거즈, 또는 마이크로 원심분리기 튜브와 같은 저밀도 재료를 사용하세요.
  2. 다음 최적 스캐닝 매개변수를 사용하여 시각화하세요: 튜브 전압/전류 = 60 kV/133 mA; 각도 단계 = 0.33°; 프레임 평균 = 5; 복셀 크기 = 5 μm; 회전 모드 = 180°. 금속 임플란트가 포함된 샘플의 경우, 360° 회전과 0.5mm 알루미늄 필터를 사용하세요.
    참고: 뼈 재생 과정에서 소설과 유사한 엮인 뼈의 두께는 일반적으로 기존 마이크로CT 영상의 해상도 한계 내에 있습니다. 트라베클 골의 전통적인 형태측정 매개변수(예: 트라베클 두께, 간격, 수치)를 정확히 정량화하기 위해서는 가장 작은 복셀 크기(명시된 5 μm)를 사용하는 것이 권장됩니다. 만약 관심 영역(ROI)이 이 명목 해상도에서 시야각(FOV)을 초과하면, 먼저 멀티스캔 기능을 사용해 ROI를 타일링합니다. 멀티스캔으로 ROI를 포착할 수 없을 때는 최후의 수단으로만 복셀 크기를 늘리는 것을 고려하세요.
  3. 스캔 후 원시 획득 데이터는 일련의 번호가 매겨진 이미지 파일로 구성됩니다. 제조사에서 제공한 소프트웨어를 사용하여 샘플의 관심 영역 내 인위물을 최소화하는 데 중점을 두고 재구성을 수행합니다.
    참고: 특히 분석되지 않는 영역에서 이미지 경계를 따라 이미지 아티팩트가 자주 발생합니다. 최종 볼륨은 제조사 소프트웨어를 사용해 이 영역들을 제거해 크롭할 수 있습니다.
  4. Avizo, VGStudio Max, CTVox, Dragonfly22 등 다양한 3D 시각화 소프트웨어 옵션을 사용하여 재구성된 부피를 분석하세요. 디지털 이미지 필터를 적용해 아티팩트를 제거하세요. 이 경우, 이 목적을 위해 비국소 수단 잡음 제거 방법을 사용하세요19.
    참고: 비국소 없음 소음 제거 필터 평활화 값은 인터페이스의 중요한 세부 사항을 방해하지 않도록 가능한 한 낮게 유지해야 합니다.

3. 광학 현미경을 위한 시료 준비

  1. 실험 목표에 따라 샘플 단면 방향을 선택하세요. 경골은 뼈의 긴 축을 따라 횡방향 또는 종방향으로 절개할 수 있습니다. 횡단면을 사용하여 결함 전체 부피를 덮는 직렬 단면을 만듭니다. 종방향 절개는 장축 방향의 뼈 재생을 평가하는 데 적합합니다. 하지만 이 방법은 결함의 단일 단면만 제공합니다.
    1. 저속 다이아몬드 톱 디스크를 사용해 실험 전략에 따라 샘플을 1mm 조각으로 분할합니다.
      참고: 두께 0.006에서 0.012인치의 다이아몬드 디스크를 사용하는 것이 권장됩니다. 얇은 칼날은 칼날 두께로 인한 재료 손실을 최소화하면서 매우 정확한 절단을 가능하게 합니다.
    2. 액체 저장소를 액체 수준이 칼날 하단 가장자리를 덮을 때까지 채우세요.
      참고: 증류수는 뼈 샘플에 적합합니다. 하지만 금속 이식물이 포함된 샘플과 같이 과도한 가열이 예상된다면, 장비 제조업체에서 제공한 오일을 사용해 저장소를 채우세요.
    3. 샘플을 시료 홀더에 고정하고 기기 암에 부착하세요. 샘플이 원반 표면에 안정적이고 수평이 되도록 하세요. 위치 조절 노브를 사용해 시료 절단 영역을 디스크에 맞게 조정하세요.
    4. 시료를 더 높은 속도(210 - 250 RPM)로 절단하기 시작하고, 시료에 움푹 들어간 자국이 생길 때까지 저압을 가하세요. 그 후 속도를 93 - 124 RPM으로 낮춰 섹션 작업을 원활하게 완료하고 과도한 진동을 방지합니다.
    5. 절단이 끝나면 즉시 톱을 멈추세요. 샘플이 원래 블록에서 분리되는 즉시 절단이 멈추도록 시스템을 적절히 조정하세요.
  2. 입체 현미경으로 샘플을 검사하세요. 처음에는 저배율(예: 5배-10배)에서 전체 표본을 검사한 뒤, 배율(예: 20배-40배)을 올려 과학적 질문에 따라 관심 영역을 선택하세요. 정확한 배율 범위는 사용되는 기기에 따라 다를 수 있습니다. 이 연구에서는 새로 형성된 뼈와 생체재료 사이에 경계면이 더 높은 영역을 선정하여 추가 분석을 수행하였습니다.
  3. 희석을 위한 샘플 장착
    1. 샘플을 지지대에 장착하여 연마 시 적절한 취급을 용이하게 하세요. 시료가 광학 현미경 분석만을 위한 경우, 미리 연마된 면에 순간접착제를 사용해 플라스틱 커버슬립에 직접 부착하세요.
      참고: 접착력이 향상된 플라스틱 슬라이드를 권장합니다. 유리 슬라이드도 사용할 수 있습니다(중성 비누로 충분히 세척한 후). 하지만 유리 슬라이드는 연마 시 샘플이 떨어질 위험을 증가시킵니다.
    2. 상관분석 방식을 통해 추가 분석할 시료의 경우, 2부분 알루미늄 튜브 조립체에 장착하세요. 이 프로토콜에서는 직경 2.5cm의 내부 고체 실린더와 연마 시 기계적 지지를 제공하는 외부 속이 빈 실린더로 구성된 자체 알루미늄 튜브 조립체가 개발되었습니다. 시료는 내부 고체 실린더에 부착됩니다.
    3. 내부 알루미늄 실린더를 핫플레이트 위에 올려놓고, 왁스를 녹이기에 적합한 온도(일반적으로 왁스 종류에 따라 약 60-70 °C)로 가열합니다.
      참고: 밀랍도 적합합니다. 왁스 장착 작업은 연기 후드 안에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 사용 후에는 명확하게 라벨이 붙은 화학적으로 호환되는 폐기물과 적절한 캡이 부착된 폐기물에 잔류물을 수집하세요. 유해 화학 폐기물의 안전한 보관 및 폐기를 위한 기관 표준 절차(SOP)를 준수하세요.
    4. 실린더 표면에 소량의 왁스를 바르고 완전히 녹게 하세요.
    5. 녹은 후에는 관심 있는 표면이 있는 샘플을 왁스 코팅된 표면 위에 내려놓고 부드럽게 눌러 완전한 접촉을 보장합니다.
      참고: 관심 표면은 원통 표면을 향해야 하므로 얇아짐은 반대편에서 수행되어야 합니다. 과도한 왁스 사용을 피하세요. 이는 마운팅이 고르지 않아 연마 품질에 영향을 줄 수 있습니다.
    6. 실린더를 핫플레이트에서 분리하고 실온에서 왁스가 굳어지도록 하세요.
  4. 연마 중 시료 두께 모니터링
    1. 연마 과정 중 시료 두께를 모니터링하려면 저배율에서 중간 배율(예: 10배-20배)의 반사 현미경을 사용하세요. 현미경 교정과 시료 두께 측정을 보여주는 도표는 그림 2에 나와 있습니다.
    2. 일반적으로 약 150 μm 두께의 표준 커버슬립으로 현미경 Z축을 보정합니다. 표지의 한쪽에는 빨간색 영구 마커로, 반대쪽 인접한 부분에는 파란색 마커로 표시하세요. 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착하세요.
    3. 미세 초점 노브와 마이크로미터 눈금을 사용해 먼저 커버슬립의 하단 표면에 초점을 맞추고, 그 다음 상단 표면에 초점을 맞추세요.
    4. Z-변위 값을 기록하세요. 이 값은 커버슬립 두께(약 150 μm)에 해당하며 기준 역할을 합니다.
    5. 시료를 연마하는 동안에는 알루미늄 실린더에서 시료를 분리하지 않고 이 Z축 보정을 주기적으로 사용하여 시료 두께를 추정합니다.
      참고: 이 기술은 연마 시 빠르고 비파괴적인 두께 추정을 가능하게 합니다. 또는 시료를 마운트에서 분리하여 디지털 캘리퍼나 마이크로미터로 측정할 수도 있습니다.
  5. 얇아내기 및 연마
    1. 1200, 2500, 4100 사포를 사용해 거칠고 중간 연마를 시작하세요. 이 단계의 목적은 시료 두께를 약 0.15mm로 줄이면서 상당한 표면 불규칙성을 제거하는 것입니다.
    2. 1200방 사포로 시작해서 2500방으로 점차 나가세요. 이 과정에서 가볍게 압력을 가하세요. 연마 중에는 반사 현미경을 이용해 주기적으로 시료 두께를 모니터링하세요.
    3. 원하는 두께가 달성되면 4100방 사포로 샘플 양면을 연마합니다. 연마는 수동으로 하거나 저회전 속도로 설정된 반자동 연마기를 사용해 수행할 수 있습니다. 연마 단계마다 증류수로 샘플을 지속적으로 깨끗이 세척하세요.
      참고: 연마 시 샘플과 사포를 젖게 유지하면 열을 줄이고 거친 사포로 인한 표면 오염을 방지할 수 있습니다.
    4. 최종 연마를 위해서는 연마 디스크에 장착된 펠트 연마 천에 다이아몬드 페이스트(예: 6 μm 또는 3 μm)를 소량 바릅니다. 시료의 표면 거칠기에 따라 다이아몬드 페이스트 입자 크기를 선택하세요.
      참고: 6 μm 페이스트는 예비 미세 연마에 적합하며, 최종 미러 연마에는 3 μm 페이스트가 권장됩니다. 가능하다면 두 개의 페이스트를 순차적으로 사용하는 것이 가장 좋은 결과를 냅니다. 그럼에도 불구하고 6 μm 페이스트만으로도 만족스러운 연마가 가능합니다.
    5. 샘플 양면을 최소한의 압력으로 부드럽게 연마하세요. 현미경 검사 전에 압축 공기나 면으로 샘플의 광택 표면을 건조시키세요.
    6. 샘플을 실린더에서 분리하려면 핫플레이트로 왁스를 데우고, 무수 아세톤으로 샘플에 남아 있는 왁스를 깨끗이 제거하세요.
      참고: 왁스와 무수 아세톤을 다룰 때는 훈기 후드 안에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 사용 후에는 명확하게 라벨이 붙은 화학적으로 호환되는 폐기물과 적절한 캡이 부착된 폐기물에 잔류물을 수집하세요. 유해 화학 폐기물의 안전한 보관 및 폐기를 위한 기관 표준 절차(SOP)를 준수하세요.
    7. 샘플을 유리 슬라이드와 커버슬립 사이에 침지용 오일을 장착 매체로 사용하고, 편광 현미경을 사용해 콜라겐 섬유 방향을 평가합니다. 샘플을 조사할 때는 저배율(예: 5배-10배)에서 시작해 중간 배율(예: 20배-40배)으로 확대하여 전자현미경을 이용한 추가 탐사를 위한 잠재적 영역을 식별합니다.
      참고: 상관적 작업 흐름과 주사 전자현미경을 통한 후속 분석을 진행하기 위해서는 시료를 밀봉하지 않는 것이 권장됩니다.

4. 주사 전자현미경을 위한 시료 준비

  1. 유리 슬라이드에서 샘플을 조심스럽게 꺼내세요. 피펫 팁을 사용해 커버슬립을 유리 슬라이드에서 부드럽게 밀어내세요. 과도한 침수 오일을 제거하려면 필터 페이퍼를 사용하세요. 샘플을 중성 비누로 씻으세요. 세척은 작은 용기 안에서 진행하여 샘플 손실을 방지하세요.
    참고: 샘플에 잔여 침수 오일이 남아 있다면, 70% 에탄올로 살짝 적신 면봉으로 표면을 부드럽게 세척하세요.
  2. 샘플을 필터 페이퍼에 올려 자연 건조시키세요. 압축 공기나 면화를 사용해 샘플을 건조시킬 수도 있습니다. 완전히 마르면 샘플을 카본 테이프로 스텁에 부착하세요. 이미징 중 충전을 방지하기 위해 10nm 두께의 금층을 스퍼터코팅합니다.
  3. 이중 빔 FIB-SEM 현미경을 활용하여 다양한 방법으로 샘플을 탐색하세요.
    1. SEM(주사 전자현미경) 모드에서는 2차 전자나 역산란 전자를 사용하여 광학 현미경으로 이전에 선택된 영역에서 샘플 형태, 생체재료, 새로 형성된 뼈 계면을 평가합니다.
    2. 집중 이온 빔 주사 전자현미경(FIB-SEM) 모드에서는 슬라이스 앤 뷰 단층촬영을 수행합니다.
  4. SEM 모드에서 보조 전자 검출기를 사용하면, 이전에 편광 현미경과 SEM으로 분석된 영역을 선택하여 슬라이스 앤 뷰 단층촬영 획득을 진행합니다.
  5. 관심 있는 특징에 따라 트렌치 부피, 픽셀 크기, 슬라이스 두께 매개변수를 조정하세요. 우리 장비에서는 트렌치 부피 15 μm x 10 μm x 10 μm, 픽셀 크기 20 nm, 슬라이스 두께 60 nm로 슬라이스 앤 뷰 단층촬영을 수행했습니다. 가능하면 모든 3차원(XYZ) 전반에 걸친 영상 품질을 향상시키기 위해 등각 투영 복셀 크기를 사용하는 것이 권장됩니다.
    참고: 이 매개변수는 특정 FIB-SEM 시스템에 따라 다를 수 있습니다. 분석 요구사항과 시스템 능력에 따라 최적의 조건을 결정하기 위해 장비 운영자에게 상담하세요.

5. FIB-SEM 슬라이스 앤 뷰 단층촬영의 정렬, 필터 처리 및 분할

  1. 슬라이스 앤 뷰 단층촬영은 순차적으로 번호가 매겨진 일련의 이미지를 생성합니다. 정렬을 진행하려면 해당 시리즈를 MRC 파일(일반적으로 스택이라고 함)로 변환합니다.
  2. IMOD 소프트웨어를 사용하여 MRC 파일 생성과 이미지 스택 정렬을 수행합니다.
    참고: Avizo, FIJI/ImageJ 같은 다른 소프트웨어들도 스택 정렬 플러그인을 제공합니다. 자세한 안내는 각 소프트웨어별 문서를 참조하시기 바랍니다. 또한, Peddie 등(23). 스택 정렬 과정에서 채택된 접근법에 대한 개요를 제공합니다.
  3. MRC 파일을 생성하려면 터미널이나 명령 프롬프트를 열고 이미지 시퀀스가 있는 폴더로 이동한 후 다음 명령을 실행하세요: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. TIFF 형식이 아닌 이미지는 raw2mrc를 사용하세요. -g(예: tif2mrc -g)를 추가하면 24비트 RGB 이미지를 8비트 그레이스케일로 변환합니다. 이로 인해 계산 시간이 크게 단축됩니다.
  4. 터미널에서 Etomo를 실행하고 ' 직렬 섹션 정렬' 옵션을 선택하세요. 스택을 정렬하는 순서를 따르세요: (1) 정렬되지 않은 스택을 단일 프레임에 로드합니다. (2) 초기 자동 정렬을 사용하는 Algin 탭. (3) Make Aligned Stack을 사용해 스택 탭을 만들고, 정렬된 스택을 엽니다.
    참고: 이 과정은 스택 크기와 시스템 성능에 따라 몇 분이 걸릴 수 있습니다.
  5. 완료 후에는 결과를 검토하세요. 정렬된 스택 파일은 stackname_ali.mrc라는 이름이 붙습니다.
    참고: 이 절차는 스택 정렬에 대한 시스템 기본 설정을 사용합니다. 하지만 초기 정렬과 최종 스택 생성과 관련된 매개변수는 사용자 선호에 따라 수정할 수 있습니다. 자세한 안내는 IMOD 문서: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html 을 참조하세요.
  6. Avizo 소프트웨어를 사용해 추가 이미지 필터링을 수행하세요. 정렬된 스택을 열고 다음 필터를 순차적으로 적용하세요: Sandbox Filter 플러그인에서 제공하는 Fast Fourier 변환(FFT) 필터(수직 줄무늬 방향 옵션, 허용오차: 2 선택 가능), 음영 보정 마법사(이미지의 모든 그림자 영역을 덮도록 마스크 선택 조정, 정규화 계수 100 사용 가능), 히스토그램 이퀄라이제이션(기본 구성), 그리고 Non-local Means(값을 5; 0.1; 10; 3으로 조정).
    참고: 이와 유사한 필터는 다른 이미지 분석 소프트웨어에서도 제공됩니다. FIJI/ImageJ에서는 다음과 같은 순서를 권장합니다: FFT 필터, 배경 빼기, 국소 대비 향상(CLAHE), 그리고 비국소 평균 필터.
  7. 소프트웨어를 이용한 이미지 분할과 3D 렌더링으로 진행하세요. 수동 세분화와 임계값 기반 세분화 등 다양한 세분화 전략이 제공됩니다. 워터셰드 알고리즘과 같은 추가 도구는 과정을 자동화하고 세분화 시간을 단축하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

6. 투과 전자현미경을 위한 시료 준비

  1. 골/생체재료 경계면을 평가하기 위해 집광 이온 빔 주사 전자현미경(FIB-SEM)을 이용해 라멜라 준비합니다.
    참고: 이식된 생체재료가 세라믹이나 금속이 아닌 경우(본 연구에서처럼), 투과 전자현미경(TEM)에 적합한 초박 절편을 초음파 절단기를 사용해 준비할 수 있습니다. 하지만 광물화된 물질을 단절하는 것은 다이아몬드 나이프의 수명을 크게 단축시킬 수 있다는 점을 유념해야 합니다.
  2. 초박막 절면을 5% 우라닐 아세테이트 수용액에 20분간 염색합니다.
    참고: 우라닐 아세테이트를 다룰 때는 연기 후드 안에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 사용 후에는 잔류 용매를 명확하게 라벨이 붙은 화학적으로 호환되는 폐기물 용기에 적절히 장착된 캡에 담아 수집하세요. 유해 화학 폐기물의 안전한 보관 및 폐기를 위한 기관 표준 절차(SOP)를 준수하세요.
  3. TEM을 사용해 절면을 분석하세요. 포괄적인 분석을 위해서는 이미징과 선택적 영역 전자 회절(SAED), 에너지 분산 X선 분광법(EDS), 전자 단층촬영을 결합하세요.

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결과

수지 내장된 샘플의 초기 분석은 마이크로컴퓨터 단층촬영(microCT)을 사용하여 수행됩니다. 이 비파괴 기술은 결함 영역 전체의 3D 시각화를 가능하게 하여 시료의 정량적 및 정성적 분석을 가능하게 합니다. 마이크로CT 영상에서의 대비는 주로 샘플 내 재료의 밀도 차이에서 비롯됩니다. 그림 1은 CHA37 생체재료가 이식된 쥐 경골의 비중증 결손에 대한 microCT 분석을 보여줍니다. 샘플은 이식 후 12주에 채취되어 앞서 설명한 수지 삽입 프로토콜에 따라 준비되었습니다. microCT 분석은 샘플의 내부 구조를 드러내는 3D 모델을 생성했으며(그림 3A-B), 뼈, 생체재료, 수지, 새로 형성된 뼈를 구분할 수 있게 했습니다(그림 3C-D

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토론

골 구조를 조사하고 생체재료가 골통합을 유도하는 효과를 평가하기 위해 다양한 영상 기법이 사용되었습니다 7,21,22,23,24. 이 프로토콜에서는 X선 미세단층촬영, 광학 현미경, 전자현미경을 통합하여 생체 재료 이식 후 쥐 경골 결손부위에 형성된 광물화된 뼈 조직을 분석하는 워크플로우를 구축했습니다. 이 워크플로우를 실행하려면 상당한 투자와 전문 계측 장비에 대한 접근이 필요합니다. microCT와 광학 현미경은 비교적 접근성이 높고 중간 정도의 획득 시간이 필요하지만, FIB-SEM 단층촬영, 라멜라 준비, TEM과 같은 고해상도 접근법은 더 고급 장비가 필요합니다. 더불어...

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공개 사항

저자들은 본 논문에서 보도된 연구에 영향을 미칠 수 있는 알려진 경쟁 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 브라질 국가 과학 및 기술 연구소(CNPq/Brazil)와 카를로스 샤가스 피료 데 암파로 재단 (FAPERJ)의 연구비로 지원받았습니다. 전자현미경 시설을 제공해 준 LABNANO/CBPF와 CENABIO/UFRJ에 감사드립니다. 언어 정제와 문법 수정은 ChatGPT(OpenAI, GPT-5.1, 2025)를 사용해 수행되었습니다. 모든 편집은 저자들이 검토하고 검증하였습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세톤 머크67-64-1
알루미늄 실린더수제해당 없음
Avizo 버전 2022.1서모피셔해당 없음이미지 필터링, 세분화 및 3D 시각화용 소프트웨어
카코딜산, 나트륨염, 삼수화물테드 펠라18851카코딜레이트 버퍼용 가루. 0.2 M 용량의 재고 용액을 준비하세요
다이아몬드 연마 컴파운드 3 및 마이크로; M 크기테드 펠라895-8
다이아몬드 연마 컴파운드 6 및 마이크로; M 크기테드 펠라895-9
다이아몬드 휠 x.006사우스 베이 기술DWH 3063
다이아몬드 휠 x.012사우스 베이 기술DWH 4122
펠트 광택 천테드 펠라816-20
평면 내장형 캡슐응급의료 서비스70021
유리 덮개 슬립니텔해당 없음
유리 슬라이드니텔해당 없음
글루타알데히드, 25% EM 등급테드 펠라18426/18427
골드 스퍼터 K550X에미테크해당 없음
이미지J국립보건원(NIH)이미지 처리, 필터링, 세분화 및 3D 시각화용 소프트웨어
IMOD 버전 5.1콜로라도 대학교이미지 조정, 세분화 및 3D 시각화를 위한 소프트웨어
래핑 e 폴리싱 머신사우스 베이 기술모델 910
저속 다이아몬드 휠 쏘 및 nbsp;사우스 베이 기술모델 650
저점도 임베딩 키트응급의료 서비스14300SPURR 레진용 키트. 데이터시트 사양에 따라 준비하세요.
마이크로-CT 스카이스캔 1273 브루커해당 없음
현미경 전2100F 200kV 절해당 없음
현미경 올림푸스 BX51올림포스해당 없음
현미경 테스캔 라이라3테스캔해당 없음
현미경 자이스 액시오플랜자이스해당 없음1등급 람다판 장착
파라포름알데히드, EM 등급시그마P6148포름알데히드 용액용 분말. 16% 스톡 용액을 준비하세요
플라스틱 슬라이드엑삭트41500
퀵스틱 135 마운팅 왁스사우스 베이 기술해당 없음
사포   그릿 크기 1200해당 없음해당 없음
사포   그릿 크기 2500해당 없음해당 없음
사포   그릿 크기 4100해당 없음해당 없음
슈퍼글루록타이트해당 없음
수용성 냉각수  사우스 베이 기술해당 없음
왓만 1등급 여과지시그마WHA1001150

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