신생아 쥐 난소 배양 및 전체 난포 정량화: 원시 난포 조절을 연구하는 효율적인 시험관 내 접근법

요약

본 연구는 막 삽입물에서 출생 후 마우스 난소를 배양하는 프로토콜과 전체 난소에서 난포 전체를 정량하는 프로토콜을 제시합니다. 결과는 난소 배양 중 기술적 취급이 원시 난포 수에 큰 영향을 미친다는 것을 보여주었으며, 비생물학적 변이를 최소화하기 위해 일관성 유지의 중요성을 강조했습니다.

초록

암컷 포유류에서는 원시 난포가 태아 난소 발달 중에 형성되며, 성인 난소 기능을 유지하는 유일한 원천 역할을 합니다. 원시 난포가 조립되고, 휴면을 유지하며, 난포 발달을 위해 활성화되고, 세포가 사멸하는 메커니즘은 난소 생리학과 병리학적 상태를 이해하는 데 중요합니다. 본 연구는 출생 후 마우스 난소를 막 삽입물로 배양하는 프로토콜을 제시하여, 난소 발달 단계에 따라 최대 10일간 온전한 난소를 배양하고 약물 치료를 가능하게 합니다. 배양 조건의 변화는 배양된 난소가 포함된 삽입물을 플레이트 내 웰 사이로 옮겨 배양 중 조직에 물리적인 간섭을 피함으로써 달성할 수 있습니다. 예를 들어, P5 난소는 분리되어 24웰 플레이트의 12mm 삽입물에 배양되었습니다. 각 난소는 DMEM/F12 배양지의 방울에 10% FBS, 3 mg/mL BSA, 10 mIU/mL FSH, 항생제-항균제를 보충하여 막 삽입물에 부드럽게 안정화하였습니다. 배지는 이틀마다 교체되었고, 배양은 총 5일간 유지되었습니다. 배양 후 난소는 4% 파라포름알데히드에 2시간 고정된 후 난자 표지 DDX4의 전면 항체 염색을 위해 처리되었습니다. 난포는 난자 크기와 체성 난포 세포의 핵 형태를 바탕으로 단계별로 분류되고 정량화되었습니다. 결과는 각 난소의 원시 난포 수가 조직을 막 삽입물에 적절히 배치함으로써 유의미하게 영향을 받는다는 것을 보여주었습니다. 또한, 각 삽입물의 난소 수 차이는 비생물학적 변이를 초래할 수 있으므로 피해야 합니다.

서론

난자 형성은 성숙한 난자를 생산하는 매우 조절되고 복잡한 과정입니다. 포유류에서는 태아 난소에서 난자 발생이 시작되며, 여기서 원시 생식세포(PGCs)가 1차 난자로 분화합니다. 각 1차 난자는 편평 전과립 세포층으로 둘러싸여 원시 난포를 형성합니다. 이 원시 난포 대부분은 형성 후 휴면 상태가 되어 난소 예비 역할을 합니다 ^1,2,3. 성인 난소에서는 난포 발달을 위한 원시 난포의 주기적 활성화인 난포형성이 성숙한 난자와 난소 스테로이드 호르몬의 생산을 유지하는 데 필수적^이다. 활성화 신호가 없으면 인간의 원시 난포는 최대 50년간 조용히 있을 수 있습니다. 장기적인 휴면은 난자 질 저하와 노화 난소에서 원시 난포 손실률 증가에 기여할 수 있습니다⁶. 특정 난포 풀이 활성화되는 반면, 다른 풀은 정지하며 주기적으로 세포 사멸을 겪는 메커니즘은 아직 미해결 질문입니다.

포유류에서는 난자 발생 과정이 매우 보존되어 있어 쥐는 포유류 난자 발생 연구에 이상적인 모델이 됩니다⁷. 쥐에서는 원시 난포 형성이 출생 후 4일째(P4)에 완료됩니다. 원시 난포의 소수는 형성 직후 난포 발달을 경험합니다. 난포 발달 과정에서 난자는 기관 형성 강화와 mRNA 및 단백질 합성으로 인해 크기가 커^집니다. 편평 과립 세포는 입방체 과립세포로 전환하여 증^{식성을 갖}게 됩니다. 8. 이 발달 중인 난포는 21일째 되는 배란기까지 자라며, 이는 암컷 쥐가 사춘기에 접어드는 시기입니다. 이 난포 발달 단계는 일반적으로 '1파 난포형성'이라고 불립니다. 1차 난포 형성은 난포 발달 과정과 밀접하게 일치하기 때문에, 출생 후 생쥐 난소는 원시 난포 조절과 난소 난포 발생을 연구하는 이상적인 모델을^{제공합니다.}

난소 난포의 분류는 주로 난포 체세포의 핵 형태와 난자의 크기에 기반합니다. 쥐 난소에서 휴면 상태의 원시 난포는 직경 약 20 μm의 1차 난자를 감싸는 편평 전과립세포 단일 층으로 식별됩니다. 발달 중인 난포는 1차, 2차, 3차, 그리고 모순 난포로 분류할 수 있습니다. 1차 난포에는 보통 직경 25 μm 이상의 난자가 있으며, 주위를 단일 층의 입방체 과립세포로 둘러싸고 있습니다(보완 그림 1). 2차 난포는 두 겹의 과립 세포를 특징으로 하며, 3차 난포는 세 겹 이상의 과립 세포로 구성되어 있습니다. 모순 난포는 3차 난포보다 크고, 여러 층의 과립 세포를 포함하며, 난관(antrum)이라 불리는 액체로 채워진 공동을 가지고 있습니다. 난포가 발달함에 따라 난자는 크기가 커져 배란 시점에 약 80 μm에 도달합니다. 또한, 발달 중인 난포는 여러 겹의 얇은 테카 세포로 둘러싸여 있으며, 이 층은 과립 세포^{10, 11, 12} 밖에 위치한다.

산후 쥐 난소의 상대적으로 작은 크기는 전체 난소 배양을 연구에 실용적인 접근법으로 만듭니다. 이 방법은 물리적·생리적 미세환경을 보존하면서 주변 조직의 간섭을 최소화함으로써 난소 및 난포 발달을 효과적으로 연구할 수 있게 합니다¹². 이 접근법은 생체 내에서 수행하기 어려운 실험을 가능하게 합니다. 예로는 난소 발달의 실시간 영상 촬영, 시간 조절 다중 약물 치료, 배양 배지의 단백질 프로파일링을 통한 난소 분비 활동 분석 등이 있습니다^13,14. 더 나아가, 이 접근법은 세포 간 직접 상호작용 없이 분비 인자의 효과를 공동 배양 실험을 통해 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 이 실험들에서는 서로 다른 유형의 조직을 공유 매체 내 각각 막 삽입물에 배치할 수^{있습니다.} 또한, 조건부 유전자 노크아웃 마우스 난소를 시험관에서 사용하면 원시 난포 활성화와 성장에 관여하는 주요 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 글에서는 막 삽입물을 이용한 산후 마우스 난소 배양 방법과 전체 난소에서 난포 전체 실장 정량 방법을 소개합니다(그림 1). 여기서 설명하는 기법은 1) 신생아 마우스 난소 해리, 2) 신생아 마우스 난소 배양, 3) 배양 중 배지 변화, 4) 조직 고정 및 전체 마운트 항체 염색, 5) 조직 영상 및 난포 정량 검사입니다. 또한, 이 연구는 독소루비신을 이용해 원시 난포 손실을 실험적으로 유도하여 난소 예비력 고갈의 기전을 조사할 모델을 제공하였습니다. 결과는 삽입물당 난소 수와 배양 중 삽입물 내 난소 위치가 원시 난포 수에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 이는 실험 결과에서 비생물학적 변이를 방지하기 위해 일관된 배양 환경을 유지하는 것이 중요함을 강조합니다.

프로토콜

CD-1 수컷과 암컷 쥐는 1:1 비율로 번식 쌍으로 함께 사육되었습니다. 새끼 새끼의 출생일은 출생 후 0일로 지정되었습니다. 모든 동물 실험은 미주리 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(프로토콜 번호: 36647).

1. 시약 및 배양 매체

1. 이 연구에 사용된 모든 시약은 재료표에 나열되어 있습니다. 난소 배양 전에 모든 재료와 배지를 준비하세요.
2. 배양 배지: DMEM/F-12 배지가 ~5mL 분량에 3 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 10% 태아 소 혈청(FBS), 10 mIU/mL 난포 자극호르몬(FSH)을 보충합니다.
   참고: 배지는 DMEM/F-12 배지에 BSA(30 mg/mL), FBS, FSH 스톡(10 IU/mL)을 새로 첨가하여 준비해야 합니다. 배지를 페트리 접시에서 37°C의 5%_CO2 인큐베이터에서 약 30분간 평형으로 만듭니다. 육수는 -20°C에서 보관하고 사용 직전에 해동하세요. 재고를 적절한 양으로 분리하여 반복적인 냉동 및 해동을 방지합니다.

2. 난소 배양

1. P5 암컷 쥐는 참수하여 안락사시키세요. 수술용 가위와 겸자를 사용해 난소와 부착된 점액낭 조직을 제거합니다. 난소를 60mm 페트리 접시에 넣고, 항생제-항균제가 포함된 사전 냉각된 Dulbecco's 인산염 완충 식염수(DPBS)를 넣습니다(그림 2A,B).
2. 인슐린 주사기 2개(1mL)를 사용해 입체경으로 난소에서 점액낭 조직을 해부하고 제거합니다(그림 2C,D). 난소를 1mL 피펫으로 30mm 배양 배양 배지가 담긴 배양 접시에 옮긴 후_CO2 인큐베이터에 넣습니다.
   참고: 난소를 찌르거나 쥐는 것을 피하세요. 인슐린 주사기를 사용해 난소 점액낭을 깨끗하고 균일하게 절개하여 난소를 배출하세요. 약 50 μL 배지를 피펫 팁에 미리 채우고, 난소 옆에 피펫 팁을 놓은 뒤 팁으로 흡입하여 옮깁니다.
3. 층류 후드 아래에서 각 웰에 400 μL의 매체와 인서트를 넣어 판을 준비합니다(그림 2E,E'). 매체는 인서트 외부에 위치하며, 인서트의 막은 매체에 적시면 불투명해집니다.
4. 24시간 Dox 처리를 한 배양 시에는 Dox 스톡(10 mg/mL)을 신선하게 0.1 mg/mL 농도로 도크스 함유 배지를 묽어 제조합니다.
   참고: 독스가 포함된 매체는 생물안전 및 환경 보건 및 안전 기관 위원회의 지침에 따라 적절히 폐기되어야 합니다.
5. 입체경 하에서 1mL 피펫을 사용해 최대 세 개의 난소를 삽입물로 옮깁니다(그림 2F,G). 인서트에 옮겨지는 매체의 양을 최소화하고, 이송 직후 즉시 남는 매체를 제거하세요. 난소가 인서트에 부드럽게 삽입된 후에는 200 μL 피펫을 사용해 웰에서 인서트로 약 200 μL의 매체를 옮기고, 막이 매체로 완전히 덮이도록 합니다. 배지를 다시 웰로 옮기고 난소를 막 중앙에 두세요. 피펫 팁에 배양 배지를 채워 난소가 팁 쪽으로 빨려 들어가는 것을 방지하세요. 난소 사이에 충분한 공간을 두고, 난소가 배지에 떠 있지 않고 막 삽입물 위에서 안정화되도록 해야 합니다(그림 2H). 난소와 양막을 건드리지 않도록 주의하세요.
6. 5일 배양 시에는 2일마다 매 매번 매개체를 교체하여 웰에서 200 μL(전체 양의 절반)을 제거하고 200 μL의 신선한 배양 매체를 다시 웰에 추가합니다(그림 2J).
7. 24시간 약물 처리 배양의 경우, 초기 24시간 후 난소 삽입물을 400 μL 신선한 배양 배지가 포함된 새로운 웰로 다음 단계를 사용하여 옮깁니다:
   1. 난소가 포함된 삽입물을 겸자 한 쌍으로 웰에서 제거합니다.
   2. 60mm 접시에 신선한 배양 배지와 함께 넣어 인서트 바닥을 잠시 헹구세요.
   3. 빈 60mm 접시에 인서트 바닥을 부드럽게 두드려 과도한 매체를 제거하세요. 인서트를 신선한 배양 배지와 함께 우물에 넣으세요.
      참고: 삽입물 교체 또는 이식 직후 삽입물에서 과도한 배지를 제거하여 난소가 막에 안정화되도록 하십시오.

3. 고정 및 전면 면역염색

1. 배양된 난소를 고정하기 위해 인서트를 판에서 떼어내어 5mL DPBS가 들어 있는 60mm 배양 접시에 넣습니다. 난소 옆에 약 100 μL의 DPBS를 옮기고 1 mL 피펫으로 재현탁합니다.
2. 1 mL 피펫을 사용해 삽입물에서 난소를 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 튜브에서 DPBS를 제거하고 4% 파라포름알데히드 500 μL를 추가합니다. 난소를 4°C에서 2시간 고정하세요.
   참고: 난소가 너무 커서 피펫 팁 끝이 통과할 수 없을 경우 조직 손상을 방지하기 위해 피펫 끝을 더 넓게 다듬어야 할 수 있습니다.
3. 고정된 난소를 1mL PBST₂ (PBS, 0.1% 트윈 [v/v], 0.5% 트라이톤 [v/v])에 최소 세 번, 각각 1시간 동안 회전 셰이커에 세척하세요. 항체 침투를 높이기 위해서는 PBST₂ 내 4°C 온도에서 하룻밤(12-16시간) 방치하는 것이 권장됩니다.
   참고: 이 지점은 중단점이 될 수 있습니다; 조직은 1차 항체 배영 3일 전까지 PBST₂ 에 보관될 수 있습니다.
4. 난소를 1/400(2.3 μg/mL) 희석한 항체 희석 완충제(1% BSA [w/v], 10% Donkey serum [v/v], 0.1 M 글리신, 0.1% 트윈, 0.5% Triton in PBS)에 1/400(2.3 μg/mL) 희석 상태로 4°C에서 12-16시간 배양합니다.
5. 다음 날에는 1차 항체를 제거하고 1mL의 PBST₂ 를 튜브에 추가하세요. 휴지는 최소 세 번, 각각 1시간씩 회전식 셰이커에 사용해 세척하세요.
   참고: 이 지점은 중단점이 될 수 있습니다; 조직은 1차 항체 인큐베이션 후 최대 3일간 PBST₂ 에 머물 수 있습니다.
6. 2차 항체 당나귀-항토끼 AF488을 PBST₂ 내 1/500 희석(1.5 μg/mL)으로 희석합니다. 희석된 2차 항체 최소 100 μL과 함께 4°C에서 12-16시간 배양합니다.
7. 다음 날에는 PBST₂ 로 최소 세 번, 각 1시간씩 회전 셰이커에 대량 세척하세요_. 배경을 줄이기 위해 휴지를 최대 8시간 정도 세척하는 것이 권장됩니다. 이 단계에서 빛을 막기 위해 튜브를 호일로 덮으세요.
8. PBST₂ 를 제거하고 1/1000(1 μg/mL) 희석된 DAPI 100 μL을 튜브에 첨가합니다. 조직을 DAPI에서 상온에서 30분간 배양하세요.
9. 난소를 PBST₂ 로 한 번 30분간 세척한 후 미미경 슬라이드에 영상 스페이서를 부착하세요. 난소를 1mL 피펫을 사용해 스페이서 중앙으로 옮기고 과도한 PBST₂를 제거합니다. 약 5μL 안티페이드 마운팅 매체를 추가하고 현미경 슬라이드를 스페이서 상단에 올려놓습니다. 장기 보관을 위해 스페이서 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉하세요.
   참고: 슬라이드를 촬영하기 전에 매니큐어가 완전히 마른 상태이고 커버 슬립 바깥쪽에 장착 매체가 없는지 확인하세요. 이 시약들은 현미경의 대물렌즈를 손상시킬 수 있습니다. 또한, 난소가 영상 촬영 시 고정되어 있어야 하므로 과도한 장착 매체 사용을 피해야 합니다.
10. 공초점 현미경으로 10배 배율, Z-단계 크기 10 μm로 난소를 영상화합니다. 설정을 조정하고 Z-보상(여기 이득)을 사용해 난소 전체를 촬영하세요. 이는 다음과 같은 단계를 통해 수행할 수 있습니다:
    1. 히스토그램을 사용해 신호 포화도를 모니터링하여 여기 파워와 검출기 이득을 조절하는데, 이는 조직마다 다를 수 있습니다. 낮은 레이저 출력부터 시작해 필요에 따라 점차 증가시키세요.
    2. 더 깊은 영역을 촬영할 경우, 이득 검출기에 대해 Z-보상을 활성화하세요. 깊이에 따라 신호 세기가 감소할 수 있습니다. 프레임 평균 이상을 사용하고 600Hz 속도의 양방향 X-스캐닝을 활성화하세요.
       참고: 이 설정에서는 난소당 영상 촬영 시간이 10분(~200 μm)을 초과해서는 안 됩니다. 항-DDX4를 이용한 난소의 전면 면역형광 염색은 일반적으로 견고하며 광표백은 드뭅니다.

4. 난포 정량화

1. 각 난소의 난포를 정량화하려면 ImageJ 소프트웨어를 사용해 이미지를 열어보세요. 열면 컬러 모드가 컬러라이즈되어 있고, 분할 아래 채널 분할 체크가 체크되어 있는지 확인하세요. 관심 있는 이미지를 선택한 후, 이미지/변환/회전 도구를 사용해 난소를 이미지 내에서 대칭적으로 배치하세요.
   참고: 공초점 촬영으로 획득한 이미지는 Imaris 소프트웨어(그림 3A,B) 또는 ImageJ 소프트웨어¹⁶을 사용하여 3D로 시청 및 분석할 수 있습니다.
2. 분석/도구/격자 도구를 사용해 난소를 격자로 나누세요(그림 3C, C').
3. 플러그인/분석/셀 카운터 도구를 사용해 난소를 덮는 모든 격자를 표시하세요(그림 3D, D', 4로 표시된 격자). 이 격자 중 각 행의 다른 모든 격자를 표시하여 난포 정량화를 합니다(그림 3E, E', 8로 표시된 격자). 난소 가장자리에 난자가 10개 미만인 격자는 난포 정량화에 포함되지 않습니다.
   참고: 셀 카운터 를 초기화하고 읽기 쉬운 카 운터 타입 을 선택하세요.
4. 난자세포는 DAPI 양성인 핵을 둘러싼 DDX4 양성 고리 모양 구조의 존재로 식별할 수 있습니다. 원시 난포는 직경 약 20 μm 크기의 난자세포를 가지고 있으며, 편평 체세포로 둘러싸여 있습니다. 발달 중인 난포는 지름이 25 μm을 초과하며, 한 개 이상의 입방체 과립 세포층으로 둘러싸여 있습니다(보완 그림 1).
5. 각 표시된 격자에서 원시 난포를 세어보세요( 그림 3E, E' 와 카운터 타입 8 참조). 격자 내 광학 절편/스택을 사용해 난포를 점검하고, 각각 세포 카운터 도구로 표시하세요. 두 번의 연속된 시력 절개/스택에서 원시 난포를 중복 세지 않도록 주의하세요. 카운터 타입 4로 표시된 모든 격자에서 발달 중인 난포를 세어보세요.
   참고: 줌 옵션을 사용해 난자를 시각화하고 쌓인 덩어리를 세는 데 도움이 됩니다.
6. 난소 전체(nf)의 원시 난포 수를 그리드당 평균 원시 난포 수(nfgrid)에 난소를 포함하는 그리드 수(ngrid)를 곱하여 계산합니다. nf = ngrid s× nf 그리드.
   참고: 통계 분석이 수행되었으며, 그래프는 Prism 10.2.0 소프트웨어(GraphPad Software, 버전 10, Inc., CA)를 사용하여 생성되었습니다. 그룹 간 차이는 일방향 분산분석(ANOVA)과 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 평가하였습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05에서 고려되었습니다. 데이터는 표준오차(SE)± 평균으로 제시됩니다.

결과

이 글에서는 신생아 난소 배양, 전체 마운트 항체 염색, 공초점 영상 촬영, 난포 정량화 방법을 시연하여 배양 중 삽입물 내 난소의 수와 위치가 실험 결과, 특히 난소 내 난포 수에 영향을 미치는지 평가합니다. 우리는 다음과 같은 방식으로 난소를 배양했습니다: 안정화 배양은 삽입물당 1개, 2개 또는 3개, 부유 배양은 3개씩 포함했습니다. 난소는 두 가지 조건에서 배양되었는데, 대조군 또는 약물 치료 그룹에서 0.1 μg/mL로 24시간 동안 Dox 치료를 받았습니다. 24시간 배양 후, 대조군과 Dox 처리군 모두의 난소가 신선 배양 배지로 전환되어 추가로 4일간 배양되었습니다.

안정화 배양법을 사용한 대조군 배양 중 평균적으로 1난소 배양군은 원시 난포가 더 많고, 3군은 원시 난포가 적음을 보였다. 그러나 세 그룹 간에 유의미한 차이는 없었습니다. 특히, 부유 배양법으로 배양된 3난소 그룹은 네 가지 배양 조건 중 원시 난포 수가 가장 적었다. 그러나 안정화 방식과 부유식...

토론

본 연구에서는 신생아 쥐 난소 배양 및 전체 난소 난포 정량 방법을 시연하였습니다. 배양 방법은 시험관 내에서 원시 및 초기 발달 난포를 유지할 수 있습니다. 전체 마운트 난포 정량화법은 조직 처리가 최소화되어 시간을 절약하고 조직 완전성을 유지하여 정확한 난포 정량을 보장합니다.

대조군에서 관찰된 원시 난포 수는 출생 후 10일째 난소에서 문헌에서 보고된 난포 수에 비해 약간 감소했음에도 불구하고(난소당 약 4,300개의 난포), 결과는 여전히¹⁷개와 비교 가능함을 시사합니다. 이 감소는 시험 관 내 배양 환경이 생 체 내 조건에 비해 최적이 아니기 때문인 것으로 보입니다. 원시 난포 외에도, 배양된 난소에서 1차, 2차, 3차 난포를 포함한 발달 중인 난포가 관찰되었습니다. 이 관찰은 산후 10일째에 CD1 난소에서 보고된 난포 형성과 일치하...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 세포 배양 플레이트	피셔 사이언티픽	09-761-146
알렉사 플루어 488 당나귀 안티 래빗	잭슨 면역연구소	711-546-152
안티-앤티 (100배)	깁코	15240-062
소 혈청 알부민	시그마-올드리치	A1470-25G
CD-1 IGS 마우스	찰스 리버 연구소	022	쥐들
세포 배양 삽입물	밀리포어	PICM01250
컴포트 포인트 인슐린 주사기 바늘 1cc 28G x 1/2	엑셀	26027
다피	써모 사이언티픽	62248
DDX4 토끼 mAb	ABCAM	AB13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)	깁코	11320-033
독소루비신 하이드로클로라이드	시그마-올드리치	PHR1789
DPBS (1회)	깁코	14190-144
태아 소 혈청	시그마-올드리치	F0926-500ML
피지-이미지	미국 NIH(https://imagej.net/ij/)	ImageJ 1.52p
피셔브랜드 튜테이팅 믹서 - 가변 속도	피셔 사이언티픽	88-861-043	셰이커
난포 자극 호르몬	시그마-올드리치	F4021-10UG
포르마 스테리 사이클 i160	열학 및 무역;	i160	CO2 인큐베이터
글리신	피셔 사이언티픽	BP381-500
이마리스	옥스퍼드 인스트루먼츠 (https://imaris.oxinst.com/)	이마리스 10.2
라이카 TCS SP8	라이카 마이크로시스템즈	SN 8100001409	공초점
일반 당나귀 혈청	잭슨 면역연구소	017-000-121
올림푸스 SZ61	올림푸스 현미경	SZ61	입체경
파라포름알데히드	피셔 사이언티픽	15714
SecureSeal 이미징 스페이서	그레이스 바이오랩스	654002
트리톤 X-100	시그마-올드리치	X100-500ML
웬 20	시그마-올드리치	P1379-500ML
벡타쉴드 안티페이드 마운팅 매체	벡터 연구소	H-1000