본 연구는 동일한 플레이트에서 미토 스트레스 및 당화 스트레스 검사의 실시간 대사 분석을 동시에 수행하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 부착자(BMDM)와 비부착자(림프구) 세포 모두에 맞춰 맞춤화되어 관심 세포의 미토콘드리아 및 당분해 기능을 정확하고 재현 가능하며 병행적으로 평가할 수 있습니다.
이 논문에서
요약
초록
실시간 대사 분석을 통해 미토콘드리아 호흡과 당해를 표지 없이 측정할 수 있어, 연구자들이 세포 에너지 대사와 질병 기전 및 치료 반응을 다양한 분야에서 연계할 수 있게 합니다. 다양한 생쥐, 다른 동물, 인간 또는 세포 간 에너지 대사를 다양한 처리 하에서 비교할 때는 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 한 번의 측정 내에서 측정하는 것이 매우 중요합니다. 더 나아가, 실험 설계에서는 분석 대상 세포 유형, 예를 들어 골수 유래 대식세포(BMDM)처럼 부착형인지, 림프구처럼 비부착형인지도 고려해야 합니다. 따라서 별도의 약물 주입과 분석 프로그램이 필요함에도 불구하고 동일한 판에서 미토 스트레스 및 당화 스트레스 검사를 동시에 수행할 수 있는 프로토콜이 개발되었습니다. 고밀착 세포(예: BMDM)와 비부착 '떠다니는' 세포(예: T 세포 및 기타 림프구) 모두를 분석하기 위해 별도의 처리 프로토콜이 최적화되었습니다. 여기서는 이러한 분석들을 효율적이고 재현 가능하게 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다.
서론
Seahorse XF 분석기는 다양한 세포 유형에서 미토콘드리아 호흡과 당해를 실시간으로 측정할 수 있는 독특한 기기입니다. 산소 소비율(OCR)과 세포외산성화율(ECAR)을 동시에 정량화함으로써, 이 기술은 생리적 또는 스트레스 조건에서 생체에너지 경로를 정밀하게 해부할 수 있게 합니다. 그 다재다능함 덕분에 암1, 신경과학2, 면역학3, 노 화3, 4, 5, 신약 발견6 등 다양한 연구 분야에서 대사 재프로그래밍이 질병 진행과 치료 반응의 특징으로 작용하는 등 필수적인 역할을 합니다. 기능적 생체에너지학을 세포표현형과 연결함으로써 분석은 기전 규명, 대사 취약성 규명, 유전적 또는 약리학적 개입의 효과 평가를 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.
많은 분야에서 약물, 소분자, 사이토카인 또는 천연 화합물이 세포 대사에 미치는 즉각적인 효과를 비교하는 것은 동일한 실험 조건, 동일한 배지, 배양 시간, 환경 매개변수, 하루 중 시간대에서 수행하는 것이 가장 좋습니다. 따라서 이 접근법은 서로 다른 처리법이나 유전적 배경을 가진 세포를 같은 판에 접질하고 여러 대사 매개변수를 동시에 분석하는 것입니다. 이 전략은 약물 또는 유전학 관련 세포 에너지 대사 변화를 가장 정확하게 비교할 수 있도록 보장합니다.
많은 세포 유형이 배양에서 다르게 행동합니다. 림프구는 현탁 상태로 남아 판에 부착하지 않으며,대식세포는 강하게 부착되어 이동이 어렵고, 암세포는 선에 따라 빠르게 증식하지만 속도는 다릅니다. 이러한 차이는 실시간 대사 분석에 도전 과제를 제기합니다; 따라서 실험 내 각 세포 유형은 맞춤형 프로토콜이 필요합니다.
이 글은 실시간 대사 분석을 통해 이러한 검사를 수행하는 단계별 프로토콜을 제공하여 효율성과 재현성을 보장합니다. 이 프로토콜들은 시장에 나와 있는 모든 버전의 분석기에 적용할 수 있습니다.
프로토콜
쥐들은 메해리 의과대학의 국립보건원(NIH) 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜에 따라 관리되었습니다. 이 기관은 국제실험동물관리평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)의 인증을 받았으며, 병원체가 없는 환경에서 실험동물의 치료 및 사용을 위한 공중보건국 정책을 준수합니다. 시약과 사용 장비의 세부 사항은 재료표에 기재되어 있습니다.
1. 셀 밀도 최적화
참고: 각 세포 유형은 고유한 대사 특성과 상당한 크기 변이를 보입니다. 이 두 요소는 최적의 결과를 얻기 위해 유정당 적재할 셀 수를 결정하는 데 매우 중요합니다. 초기 실험 분석을 수행하기 전에, 관심 있는 세포를 다양한 밀도로 도금한 테스트 플레이트를 준비하고 실행합니다.
- 부착 세포(예: 암세포)의 경우, 웰당 20,000에서 100,000 세포 사이의 씨앗 밀도를 시험합니다. 대사가 매우 심하거나 큰 세포(예: 인간 암세포나 섬유아세포)의 경우, 밀도 최적화는 웰당 10,000개 이하의 세포에서 시작됩니다.
- 비부착 세포(예: 림프구)의 경우, 웰당 100,000–500,000 세포 범위 내에서 시딩 밀도를 최적화합니다. 모든 세포 유형에 대해 최적의 결과를 얻기 위해 균일한 단일 세포 단층을 목표로 합니다(예를 들어 샘플의 플레이트 배치 같은 그림 1 참조).
- 미토 스트레스 분석법(아래와 같이)을 실행하세요. 이 예비 분석법 데이터는 주요 실험의 최적 세포 밀도를 결정하는 데 활용될 수 있습니다. 분석 조건 간 차이가 가장 큰 밀도를 선택하세요.
참고: 이 프로토콜은 3D 샘플(예: 세포 구체, 오가노이드) 분석에는 적용되지 않습니다. 그러나 샘플 두께와 고르지 않은 표면을 고려하여 수정할 수 있습니다.
2. 분석 준비
- 분석 전날에는 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에서 부드럽게 들어 올리고, 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200 μL의 RNAase/DNAse 무첨가 물을 추가한 후, 센서가 완전히 물에 잠길 때까지 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 넣습니다.
참고: 센서 카트리지의 형광체가 적절히 수분이 공급되지 않으면 작동하지 않으므로, 센서가 밤새 완전히 잠기도록 수위가 충분히 높아야 합니다. XF 하이드로부스터를 사용해 카트리지를 수화시킬 경우, 카트리지를 캘리브란트 용액에 직접 넣고 물 수화 단계를 제외할 수 있습니다. - 수분 센서 카트리지/유틸리티 플레이트를 37°CCO2 없는 인큐베이터에 하룻밤 넣으세요. 플레이트에서 증발하는 것을 방지하기 위해 인큐베이터에 이중 증류수가 담긴 용기도 넣으세요.
- 분석 당일,CO2 없는 인큐베이터에서 센서 카트리지/유틸리티 플레이트를 제거하고, 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에서 조심스럽게 분리한 뒤, 카트리지 센서 면을 위로 향하게 작업대 위에 올려놓습니다.
- 유틸리티 플레이트의 물을 버리고 느슨한 방울을 흔들어 말린 후, 각 우물에 200 μL XF 캘리브런트 용액을 추가하세요.
- 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 조심스럽게 다시 넣어 센서가 캘리브런트 용액에 완전히 잠기게 한 후, 37 °CCO2 없는 인큐베이터에 다시 넣습니다.
3. 분석 배지 준비
- 미토 스트레스 배지 준비:
- 50 mL 튜브에 45 mL XF RPMI 배지에 다음을 첨가합니다: 100x 피루베이트 나트륨 500 μL (최종 농도: 1 mM), 100x L-글루타민 500 μL (최종 농도: 2 mM), 그리고 45% 포도당 용액 550 μL (최종 농도: 25 mM)
- pH를 7.4로 조절하세요. XF RPMI 미디엄을 50mL로 채우세요. 사용 전에 준비된 배지를 37°C 수조 또는 건조 목욕에 보관하세요.
- 당분해 분석 배지 준비:
- 50 mL 튜브에 100x L-글루타민 250 μL을 XF RPMI 배지 45 mL에 첨가합니다.
- pH를 7.4로 조절한 후 XF RPMI 배지를 보충해 최종 부피 50mL를 만듭니다. 사용 전에 준비된 배지를 37°C 물이나 건조 목욕에 보관하세요.
참고: 미토 스트레스 및 당화 분석 배지의 pH는 pH를 변경하는 보충제를 추가한 후에는 7.4로 재조정해야 하며, 작은 편차도 검사 결과에 큰 영향을 줄 수 있습니다.
4. 분석 전 세포 세척 및 배지 변경
참고: XFe96/XF 프로 세포 배양 마이크로플레이트의 세척 단계는 부착 세포 유형과 비부착 세포 유형에 따라 다릅니다. 부착 세포(암세포, 원발 BMDM 세포)와 비부착 세포(T 세포 및 기타 림프구)를 참고하여 사용하는 세포 유형에 맞는 최적의 세척 방법을 결정하시기 바랍니다.
- 각 웰에서 160–180 μL의 성장 배지를 멀티피페터로 제거하며, 한 행/컬럼씩 작업하여 세포가 건조하지 않도록 합니다. 우물 바닥을 만지지 마세요.
- 싱글 팁 피펫맨을 사용해 웰에서 남은 20–30 μL를 제거하며, 웰 하단의 셀 층을 접촉하지 않습니다.
- 각 웰에 180 μL 이상의 당화 또는 유사 스트레스 분석 배지(3단계 참조)를 추가하며, 그림 1의 레이아웃에 따라 합니다. 셀 층을 방해하지 않으려면, 각 웰의 측면벽을 따라 매체를 부드럽게 분배하여 모든 웰이 가득 찰 때까지 마찬가지입니다. 두 검사 모두 같은 판에 있습니다.
참고: 세포가 없는 우물과 대조 우물은 반드시 분석 배지로 채워져야 합니다. - 분석을 시작하기 전에 마이크로플레이트를 37°CCO2 없는 인큐베이터에 40–45분간 넣고 약물 준비를 시작하세요.
5. 약물 준비 및 탄약 장전
주의: 일부 약물(FCCP, 안티마이신 A/로테논, 올리고마이신)은 위험하므로 주의해서 다루어야 합니다. 인원을 보호하기 위한 적절한 조치가 필요하며; 여기에는 장갑 및 기타 개인 보호 장비(PPE) 착용, 기관 승인 화학 폐기물 통 또는 용기에 물질을 폐기하는 것이 포함됩니다.
참고: FCCP/올리고마이신의 최적 농도는 세포 유형에 따라 다르며, 특히 민감한 세포를 다룰 경우 검사 전에 경험적으로 적정됩니다. 최종 농도는 세포 유형에 따라 약물에 따라 달라질 수 있습니다. 약물을 준비하고 사용한 당일에 신선한 배지를 분석하세요. 냉동하거나 재사용하지 마세요. 최적의 결과를 위해 이 45분 이내에 분석제 준비를 완료할 수 있습니다.
- 3단계에서 미리 예열한 미토 스트레스 및 당해 분석 배지를 사용하여, 표 1 및/또는 표 2 에 따라 각 세포 유형에 적합한 농도로 화합물을 희석합니다. 각 화합물을 별도의 15mL 튜브에서 준비하세요(6개 화합물을 모두 사용할 경우 6개의 튜브가 필요합니다).
- 37 °CCO2 없는 인큐베이터에서 센서 카트리지/유틸리티 플레이트를 제거하고 뚜껑을 열어, 키트에 제공된 XF 로딩 가이드(인젝터 포트에 해당하는 XF 로딩 가이드, 포트 A의 가이드)를 센서 카트리지 상단 위에 안전하게 놓으세요( 그림 2 참조).
- 각 약물별로 다중 채널 피펫터와 시약 저장소를 사용해 해당 포트에 필요한 부피를 천천히 추가하여 나아가세요(부피는 표 1 과 표 2 참조). 약물을 적재할 때는 피펫터를 엄격히 똑바로 세워 보관하세요( 그림 2 참조).
- 각 포트(포트: A, B, C, D)마다 로딩 가이드를 꼼꼼히 헹구고 건조한 후 교체하거나 재사용하고, 각 포트가 장착된 후에는 피펫 팁을 버리세요.
참고: 피펫 팁은 가이드 포트에 단단히 맞아야 하지만, 너무 꽉 끼지 않도록 해야 합니다. 피펫 팁이 가이드에 끼일 수 있습니다! 샘플 오로딩을 방지하기 위해 가이드에 사용되는 피펫 팁/피펫을 미리 테스트하는 것이 권장됩니다. - 모든 컴파운드를 각자의 포트에 장전한 후, 가이드를 제거하고 모든 포트가 채워진 것을 육안으로 확인한 후 카트리지를 뚜껑으로 고정합니다. 약물은 동일한 판의 각 부분에서 분석과 일치해야 합니다(그림 1).
참고: 미토 스트레스에 권장되는 최종 웰 농도는 1 μM 올리고마이신, 1 μM FCCP, 0.5 μM 로테논/안티마이신입니다; 당화학에는 10 mM 포도당, 1 μM 올리고마이신, 50 mM 2-DG 등이 있습니다.
6. Seahorse XFe96 분석기 설치
- 분석기를 켜고 WAVE 소프트웨어를 열어 보세요(그림 3 참조).
- XF 미토 스트레스 테스트를 선택하세요.
참고: 적절한 분석지와 화합물을 사용하면, 분석기는 XF 미토 스트레스 테스트를 사용하여 동일한 플레이트에서 미토콘드리아 및 당해 분석을 동시에 수행할 수 있습니다. - 플레이트 구성에 따라 '그룹' 수를 선택하고 각 그룹에 라벨을 붙이세요. 다음 탭으로 이동하여 플레이트 맵에 맞는 웰을 할당하세요( 그림 3 참조). 두 검사 모두 같은 플레이트에서 수행됩니다.
- 판이 적재되는 방식에 따라 각 그룹별 우물을 강조 표시하세요.
- 세포 유형과 실험 목적에 따라 프로그램을 조정하세요. 예를 들어, 분석 전에 사전 활성화된 그룹이 포함되거나 실행 중에 활성화제를 추가하는 경우, 각 사이클의 부화 시간을 연장하여 활성화가 일어날 수 있도록 합니다.
- 다음 탭인 '분석 실행 중'을 선택하고 필요한 정보를 입력하여 데이터 파일을 저장하세요.
- 초기 단계에서 약물이 담긴 사전 수화된 카트리지에 기계에 적재하세요(5단계부터). 초기화 단계는 센서가 적절히 수분을 공급받고 작동하는지 보여줍니다.
- 분석 시작과 프로그램 중 안내에 따라 판을 적재 및 하역하세요.
참고: 카트리지나 마이크로플레이트를 분석기에 넣을 때는 모든 뚜껑을 반드시 열어두세요! 일부 분석기 모델은 뚜껑을 감지하는 안전 기능이 있지만, 초기 모델은 그렇지 않습니다. 플레이트 작업 중 뚜껑이 온전하면 기계가 손상될 수 있습니다.
7. 정규화 방법: (SRB) 및 핵 수(DAPI 염색 및 영상)
주의: SRB 검사 키트 내 일부 시약은 부식성이 있어 피부에 닿으면 화상을 입을 수 있습니다. DAPI는 알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 장갑 및 기타 개인 보호 장비(PPE) 착용이 권장되며, 물질은 기관에서 승인한 화학 폐기물 통이나 용기에 폐기될 것입니다.
참고: 분석된 세포의 특성과 전처리를 기준으로 정규화 방법을 선택하세요. 두 방법 모두 증식율이 다른 세포를 비교할 때 적합하며, 두 방법 모두 이러한 차이를 반영합니다. 그러나 약물 치료가 노화를 유도하여 증식을 멈추고 세포 크기를 증가시키는 경우, DAPI 염색이 선호되는 정규화 접근법입니다. DAPI는 핵 염색이 눈에 띄기 어려운 세포(예: 지방세포, 적혈구)이나 다핵세포(예: 실질 간세포, 근세포)가 있는 세포 유형에는 적합하지 않을 수 있습니다.
- 실시간 대사 분석 후 SRB 분석법(설포호다민 B 세포 독성 검사 키트)을 사용해 세포를 정규화하려면, 기계에서 플레이트를 분리하고 각 웰에 고정액의 1/4 용량(예: 200 μL 배양 배양 중 50 μL)을 추가합니다.
- 실온에서 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
- 용액을 제거한 후 세포층을 손상시키지 않도록 주의하면서도 200 μL RNase/DNase 무첨가 물로 웰을 세 번 부드럽게 세척합니다. 단기 보관(필요 시)을 위해 최종 세척물을 PBS로 교체하고 4 °C에서 보관하세요.
- SRB 분석법을 이용한 즉각적인 정규화를 위해 세척액을 제거하고 상온에서 완전히 자연 건조시키세요.
- 각 웰에 25 μL SRB 용액을 추가하고, 실온에서 어두운 상태에서 15분간 염색하거나 배양 기간 동안 알루미늄 호일로 플레이트를 감싸 둡습니다.
참고: SRB 솔루션은 빛에 민감하며, 이 실험 부분은 저조도 지역에서 수행되어야 합니다. - 염색 용액을 제거하고 100μL 1x 세척액을 넣어 각 웰을 2–3번 세척합니다.
- 표백을 피하려면 가능한 빨리 세척하고, 진공 흡입으로 세척액을 최대한 제거하세요.
- 각 웰에 1x 용해화 용액 100 μL 넣고, 플레이트를 셰이커에 실온에서 10분간 올려놓습니다.
- 플레이트 리더기에서 565 nm 광밀도(O.D.)를 측정하여 색상 채도를 기반으로 웰 밀도를 결정합니다(시각적 참고용으로 그림 3 참조).
- O.D. 값 데이터를 엑셀 파일로 내보내세요. 이 스프레드시트는 정규화를 위해 WAVE 소프트웨어에 붙여넣습니다(8단계).
참고: 셀 과부하로 인해 강한 색상이 관찰될 경우(> O.D. 3.5), 최적이 아닌 파장(예: 490–530 nm)을 사용하여 측정값을 기기의 선형 범위로 낮출 수 있습니다. 모든 샘플의 측정값에서 배양 배지(배경 대조 우물)만 포함된 대조군의 O.D.를 빼서 배경 정확히 측정합니다.
- DAPI 염색의 경우, DAPI 스톡 용액을 300 nM으로 1x PBS에 희석하세요.
- 세포 플레이트의 각 웰을 200 μL 1x PBS로 부드럽게 3회 세척합니다.
참고: 부착하지 않은 셀이 있을 경우, 각 세척 단계 후 각 웰 바닥에 셀이 매달려 있는지 200 x g 에서 3분간 원심분리하여 브레이크 없이 돌립니다. - 세포를 2%–4% PFA에 1x PBS에 희석하여 상온에서 10–15분간 고정합니다.
- 세포 플레이트의 각 웰을 200 μL 1x PBS로 부드럽게 3회 세척합니다.
- 각 웰에 약 150 μL의 희석 DAPI 염색액을 첨가하여 셀이 완전히 덮이도록 합니다.
- 실온에서 저조도 공간(또는 알루미늄 호일로 덮은 판)에서 1분에서 5분간 배양하세요.
- 각 웰에서 DAPI 염색 용액을 제거하세요.
- 세포 플레이트의 각 웰을 200 μL 1x PBS로 부드럽게 3회 세척합니다.
- 남은 PBS는 모두 제거하세요.
- 358–461 nm 사이의 모든 여기/방출 또는 현미경의 DAPI 필터 설정 하에서 세포를 영상화합니다.
- 배출 값 데이터를 엑셀 파일 형식으로 내보내세요. 이 스프레드시트는 정규화를 위해 WAVE 소프트웨어에 붙여넣습니다(8단계).
- 세포 플레이트의 각 웰을 200 μL 1x PBS로 부드럽게 3회 세척합니다.
8. 데이터의 분석 및 정규화
참고: 데이터 분석을 위해서는 "Wave" 또는 기타 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 제공된 프로토콜은 Wave 소프트웨어에도 적용됩니다.
- 분석 결과를 Wave로 열어 보세요( 그림 3 참조). 정규화는 SRB 염색(7단계) 후 마이크로플레이트 리더가 생성한 엑셀 파일을 사용하여 수행됩니다.
- "정규화"를 클릭하세요.
- 열린 창에서 "모두 선택"을 선택한 후 "붙여넣기"를 눌러 정규화 단계에서 생성된 Excel 스프레드시트에서 복사한 데이터를 붙여넣으세요. "지원"을 클릭하세요. 이 절차는 모든 실험 데이터를 자동으로 정규화했습니다.
- 보고서를 생성하려면 오른쪽에 열리는 패널에서 "내보내기"를 클릭해 "XF 세포 미토 스트레스 테스트 보고서 생성기"를 선택하세요. 생성된 파일을 저장하세요. 분석 중에는 미토 스트레스 테스트에 할당된 우물만 선택하세요( 그림 3 참조).
- 보고서를 생성하려면 오른쪽에 열리는 패널에서 "내보내기"를 클릭해 "XF 세포 당화 스트레스 테스트" 보고서 생성기를 선택하세요. 생성된 파일을 저장하세요. 분석 중에는 당분해 스트레스 검사에 할당된 웰만 선택하세요( 그림 3 참조).
9. 부착 세포 대 비부착 세포
참고: 부착 세포와 비부착 세포는 성장 행동, 표면 부착 방식, 취급 요구사항 등에서 차이가 있습니다. 부착 세포(예: 암세포, BMDM)가 배양 표면에 부착되므로 도금 및 세척 시 특별한 주의가 필요하지 않습니다. 비부착 세포(예: T 세포, 기타 림프구)는 계속 현탁 상태로 남아 있어 원심분리, 재현탁, 플레이트 방식이 다릅니다. 이러한 차이를 이해하는 것은 정확한 세포 시딩, 약물 처리, 그리고 분석의 일관성에 매우 중요합니다.
- 실험에 사용되는 모든 세포는 분석 직전에 배양지와 선택한 세포 배양 용기에서 배양된 후, 분석하기 위해 마이크로플레이트로 옮겨 분석해야 합니다.
참고: 이 프로토콜에 설명된 세포 유형에는 XF RPMI 배지를 권장하지만, 다른 세포 유형에 대해서는 제조사와 상담하여 적절한 배지를 사용해야 합니다. - 부착 세포(암세포, BMDM 세포)의 경우, 세포를 분석보다 4–5시간 전에 최적화된 세포 밀도(1단계 참조)에서 200 μL 배지 부피에 시딩하여 37 °CCO2 인큐베이터에 시딩합니다.
참고: BMDM 세포는 증식하지 않고 동일한 세포 밀도를 유지하므로 검사 24시간 전까지 판질할 수 있습니다. 암세포주와 같이 빠르게 성장하는 부착 세포의 경우, 추가 치료가 필요 없으면 검사 당일에 플레이트를 부착하고, 세포가 부착되자마자 즉시 분석하여 추가 세포 증식을 방지하는 것이 권장됩니다. 이 설계가 불가능하다면 단백질 양/웰 또는 핵 수/웰로 정규화가 필요합니다. - 마이크로플레이트의 네 모서리마다 세포가 없으나 매질로 채워져 있는지 확인하세요. 이는 빈 대조 웰로 측정됩니다.
- 3–5시간 배양 후에는 각 웰 바닥에서 세포가 균일한 수준으로 플레이트에 부착되었는지 미세판을 관찰합니다.
- 세포가 아직 부착되지 않은 경우, 플레이트를 세포가 완전히 부착될 때까지 37°CCO2 인큐베이터에 추가로 보관할 수 있습니다.
- 다음으로, 4단계에서 언급한 세척을 위해 부착 세포가 포함된 마이크로플레이트를 준비하여 분석에 나아갑니다.
- 비부착 세포(T세포 및 기타 림프구)의 경우, 세포를 추가하기 전에 마이크로플레이트에 폴리-D-라이신을 코팅하세요.
참고: 이 프로토콜에서는 폴리-D-라이신 코팅이 권장되지만, 세포 유형에 따라 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴 등 다른 플레이트 코팅이 더 적합할 수 있습니다. 대체 코팅을 사용할 경우, 제조사의 사용 지침을 따르시기 바랍니다. - 마이크로플레이트를 코팅하기 위해, 20 μg/mL 폴리-D-라이신 용액 2.5 mL(1 mg/1 mL 물 용액의 50배 희석)를 0.1 M 탄산수소나트륨, pH 8.0에 준비합니다(중탄산염은 접착 흡착에 최적의 pH를 제공합니다). 이 단계는 검사 전이나 검사 당일에 수행할 수 있습니다.
- 각 웰에 25 μL의 용액을 적용한 후 상온 벤치나 플레이트 로커에서 20–30분간 배양합니다.
- 남은 용액은 흡입하거나 피펫으로 제거하고, 각 웰을 200 μL RNAase/DNAse 무첨가 물로 두 번 세척합니다.
- 웰이 마른 후(1–2시간) 미세판에 세포를 시딩합니다.
- 다음으로, 세척 단계에 맞춰 200 x g 에서 원심분리하여 각 웰 바닥에 셀이 매달려 있도록 3분간 원심분리하여 세척 단계에 사용할 수 있습니다.
- 4단계로 진행하고 5–7단계에서 언급한 대로 나머지 분석도 진행합니다.
결과
이 결합 프로토콜은 두 검사법을 동일한 판에서 수행할 수 있도록 개발되었습니다. 예를 들어, 이 방법은 활성화10 중 CD8+ T 세포의 대사 능력에 영향을 미치는 mGluR1−TCR 크로스토크 신호를 밝히는 데 사용되었습니다. 이 연구는 mGluR1 억제가 탈당과정으로의 전이와 미토콘드리아 호흡 변화에 미치는 영향을 평가하는 것으로, 각 실험에서 사용되는 T세포 수를 최소화하는 데 필수적인 과정입니다. 동일한 단일 판 기법은 부착성 골수 유래 대식세포(BMDM; 그림 4와 그림 5), 그리고 인간 말초혈 단핵세포(PMBC; 그림 3). 활성화된 CD8+ T 세포에서 mGluR1 신호 차단이 미토콘드리아 및 비미토콘드리아 에너지 생산에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌습니다. 반면, 순진한 세포는 대사 에너지 프로필에 유의미한 변화가 없었습니다(그림 6A,B). 활성화된 CD8+ T 세포의 미토 스트레스 검사에서는 기저 및 최대 호흡과 호흡 예비 용량이 높음을 보였습니다(그림 6C). 글루타메이트가 mGluR1에 결합할 때 하위 신호를 차단하는 비경쟁적 길항제인 CPCCOEt로 처리한 T세포는 나이브 세포처럼 산소 소비율(OCR)이 감소하여 ATP 생성이 감소했습니다(그림 6C). 당분해 분석은 또한 처리되지 않은 활성화된 CD8+ T 세포만이 당화작용을 통해 ATP를 생성했으며, CPCCOE 처리 역시 순진한 상태와 유사한 대사 활성을 보였음을 보여주었습니다(그림 6D). 이 결과들은 mGluR1 신호전달이 활성화 시 CD8⁺ T 세포의 적절한 기능에 필수적임을 확인시켜 줍니다.
그림 1: 이 그림은 동일한 플레이트에 미토 스트레스 및 당화 분석법을 포함한 마이크로플레이트의 플레이트 구성을 개요로 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2: 약물 카트리지 장전. (A) 카트리지 후방과 앞면의 센서와 포트에 대한 상세한 지도, 어떤 약물을 어느 포트에 장전해야 하는지 라벨링. (B) 해당 포트를 장전할 때 카트리지 상단에 가이드를 배치하는 권장 위치와 가이드 위에 다채널 피펫을 사용할 때 권장되는 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: WAVE 프로그램을 이용해 분석법을 실행하고 분석하는 모습. (A) 프로그램 설정 과정에는 분석 유형 선택, 그룹 할당, 플레이트 맵 생성, 약물 포트 프로그래밍 등이 포함됩니다. (B) 해당 포트에 주입할 약물의 순서는 샘플이 미토 스트레스인지 당해작용인지에 따라 달라집니다. (C) 정규화 마지막 단계에서 SRB 염색을 클로즈업하는 사진. (D) 정규화 후 플레이트 데이터는 동일한 플레이트에 대해 당화 및 미토 스트레스 테스트로 각각 별도로 내보낼 수 있습니다. (E) 미토 스트레스 데이터는 현재 선택을 편집하여 미토 스트레스 샘플만 선택할 수 있습니다. (F) 당화 데이터는 현재 선택을 편집하여 당화 샘플만 선택할 수 있습니다. 이 그림에서 사용된 예시 데이터는 인간 말초혈 단핵세포 분석에서 가져온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 4: 같은 플레이트에서 동시에 미토 스트레스 운동을 수행한 모습. 2개월 된 WT 마우스와 Tusc2 KO 마우스에서 유래한 골수 유래 대식세포는 두 가지 분석 유형 모두에 적용되었습니다. 세포는 무처리(가짜)로 방치하거나 LPS(100 ng/mL)로 5시간 동안 자극하여 플레이트 시행(30,000 세포/웰)을 투여했습니다. 정확한 비교를 위해 유사성 응력 및 당해 스트레스 검사가 병행하여 수행되었으며, 이는 그림 1에 나타난 바와 같습니다. (A) 다양한 세포 유형(WT 및 KO) 및 조건(순진형 및 활성화)에 대한 미토 스트레스 프로파일을 Wave 소프트웨어를 사용해 생성됨. 정규화는 7단계에서 설명한 SRB 염색을 통해 수행되었습니다. (B) 각 검사에서 분석된 매개변수들의 비교 막대 그래프. ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.005, 학생 T 검정. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 5: 동일한 플레이트에서 동시에 수행된 당분해 스트레스 검사. 2개월 된 WT 마우스와 Tusc2 KO 마우스에서 유래한 골수 유래 대식세포는 두 가지 분석 유형 모두에 적용되었습니다. 세포는 무처리(가짜)로 방치하거나 LPS(100 ng/mL)로 5시간 동안 자극하여 플레이트 시행(30,000 세포/웰)을 투여했습니다. 정확한 비교를 위해 유사성 응력 및 당해 스트레스 검사가 병행하여 수행되었으며, 이는 그림 1에 나타난 바와 같습니다. (A) 다양한 세포 유형(WT 및 KO) 및 상태(순진형 및 활성화 상태)에 대한 당화 스트레스 프로필, Wave 소프트웨어를 사용해 생성됨. 정규화는 7단계에서 설명한 SRB 염색을 통해 수행되었습니다. (B) 각 검사에서 분석된 매개변수들의 비교 막대 그래프. ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.005, 학생 T 검정. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 6: 마우스 비장구에서 정제한 CD8⁺ T 세포를 이용한 단일 플레이트에서의 미토 스트레스 및 당화 스트레스 검사. (A) 순진, 활성화, 활성화된 + mGluR1 억제제 T 세포 그룹과 비교한 CD8+ T 세포의 산소 소비율(OCR) 약물 의존적 변화를 비교하는 미토콘드리아 스트레스 검사의 대표적 프로필. (B) 순진, 활성화, 활성화된 + mGluR1 억제제군에서 수행된 CD8+ T 세포의 세포외산성화율(ECAR)의 약물 의존적 변화를 비교한 당분해 검사의 대표적 프로필. (C) 순진, 활성화, 활성화된 + mGluR1 억제제 그룹에서 CD8+ T 세포의 미토콘드리아 호흡 매개변수 차이를 정량적으로 보여주는 막대 그래프. 막대는 SEM 평균 ± (n = 4)을 나타냅니다. (D) 나이브, 활성화, 활성화된 + mGluR1 억제제 CD8+ T 세포에서 당해의 다양한 매개변수가 정량적으로 변하는 바 그래프. 막대는 SEM 평균± (n = 4)을 나타냅니다. ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.005, 학생 T 검정. 이 도표는 Aquino 등에서 차용한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
| 최종 우정 (μM) | 스톡 용액 부피 (μL) | 미디어 볼륨 (uL) | 10배 포트 (μM) | 포트에 추가된 볼륨 (μL) | |
| 포트 A 올리고마이신 | 0.5 | 150 | 2850 | 5 | 20 |
| 1.5 | 450 | 2550 | 15 | 20 | |
| 2.5 | 630 | 1890 | 25 | 20 | |
| 포트 B FCCP | 0.125 | 37.5 | 2962.5 | 1.25 | 22 |
| 0.25 | 75 | 2925 | 2.5 | 22 | |
| 0.5 | 150 | 2850 | 5 | 22 | |
| 1 | 300 | 2700 | 10 | 22 | |
| 2 | 600 | 2400 | 20 | 22 | |
| 포트 C 로테논/안티마이신 | 0.5 | 300 | 2700 | 5 | 24 |
표 1: 미토 스트레스를 위한 XFe96 센서 카트리지 장전을 위한 화합물 준비.
| 최종 우물 | 스톡 용액 부피 (μL) | 미디어 볼륨 (μL) | 10배 포트 | 포트에 추가된 볼륨 (μL) | |
| 포트 A 포도당 | 250 mM | 100 | 2400 | 20 | |
| 포트 B 올리고마이신 | 0.5 μM | 150 | 2850 | 5 uM | 22 |
| 1.5 μM | 450 | 2550 | 15 uM | 22 | |
| 2.5 μM | 630 | 1890 | 25 uM | 22 | |
| 포트 C 2-DG | 50 mM | 3000 | 0 | 500mM | 24 |
표 2: 당화를 위한 XFe96 센서 카트리지 장전을 위한 화합물 준비.
토론
여기서 제시된 프로토콜은 두 가지 주요 에너지 생산 경로인 산화적 인산화(미토콘드리아 ATP 생성)와 혐기성 당화(산소 필요 없는 ATP 생성)를 정확하고 신뢰할 수 있게 비교할 수 있게 하며, 두 가지 다른 스트레스 테스트를 한 번의 실행 내에 수행할 수 있습니다. 또한, 실험 설계는 분석할 세포 유형을 고려하여 세포 대사 분석에 대한 폭넓은 이해를 가능하게 하면서도 사용되는 샘플과 시약의 양을 최소화합니다.
Agilent, Inc.가 설계하고 판매하는 실시간 대사 분석 기기 프로토콜에서 수행되는 미토 스트레스 검사와 당화 스트레스 검사 간의 차이는 상당합니다. 이 두 검사법은 서로 다른 분석체, 특정 약물, 그리고 서로 다른 기기 프로그램이 필요합니다. 미토 스트레스 검사는 포도당, L-글루타민, 피루베이트를 포함한 분석 배지를 사용하는 반면, 당분해 스트레스 검사는 L-글루타민만 보충한 무포도당 배지를 사용합니다. 분석은 다양한 화합물로 진행됩니다: 미토 스트레스 검사는 올리고마이신 → FCCP → 항마이신 A + 로테논, 당화 스트레스 검사는 올리고마이신 → 포도당→ 2-DG입니다. 따라서 실시간 대사 분석기가 한 번에 한 판만 처리하기 때문에 이러한 검사는 보통 서로 다른 시간에 별도의 판에서 수행됩니다.
이러한 한계를 해결하기 위해, 이전논문 10에서 미토 스트레스 테스트 설정을 사용해 동일한 판에서 두 검사를 수행할 수 있는 통합 프로토콜이 개발되었습니다. 면역세포, 암세포, 부착세포, 현탁세포 등 다양한 세포 유형을 분석하기 위한 권고안이 제공됩니다. 이 지침들은 개별적으로 또는 조합하여 적용할 수 있으며, 실험자의 목표와 이용 가능한 자원에 따라 유연성을 제공합니다.
SRB 분석법 또는 DAPI를 통한 세포 정규화는 성장 속도나 크기가 다른 여러 세포 유형을 사용할 경우 더 큰 유연성을 제공합니다 9,11. 또한, 이 기법은 두 번의 분석에 단 한 판만 필요하므로 다양한 샘플 유형과 결합하여 대사 과정을 측정할 수 있습니다.
방법의 성공에 영향을 미치는 요인: (1) 웰당 최적의 셀 수; (2) 효율적인 셀 부착; 그리고 (3) 카트리지 장전을 신중하게 해야 하는데, 이는 두 가지 뚜렷한 약물 세트를 카트리지의 별도 구간에 장전해야 하기 때문입니다.
이 방법의 과학적·실험적 장점은 동일한 생물학적 맥락 내에서 직접 비교할 수 있다는 점입니다. 동일한 세포를 동일한 배양 조건에서 사용하면 플레이트나 런 간 변동성이 없어지고, 동일한 샘플 내에서 미토콘드리아와 당해 기능을 보다 정확하게 비교할 수 있습니다. 또한 세포 대사에 대한 통합적 관점도 포함하고 있습니다. 산화 인산화(OXPHOS)와 당분해를 병행하여 측정하는 것은 세포의 전반적인 에너지 대사와 경로 간 전환의 유연성을 포괄적으로 파악할 수 있게 합니다. 이 병행 분석은 생물학적 변이성도 감소시킵니다. 두 검사 모두 동일한 세포 집단에서 수행되므로 세포 플레이트 밀도, 통과 수, 환경 조건의 차이가 최소화되어 재현성이 향상됩니다. 두 테스트를 동시에 수행하면 센서 카트리지 보정, 온도 변화, 시약 준비로 인한 런 간 변동성을 줄일 수 있습니다.
이 기술의 기술적 이점으로는 분석법을 결합하여 시간, 시약, 판 소모품을 절약할 수 있어 대규모 또는 고처리량 연구에 중요하다. 이로 인해 샘플 요구량이 줄어듭니다. 세포 플레이트 한 장만 필요하므로, 림프구, 뇌유래 세포 등 제한적이거나 희귀한 1차 세포를 다룰 때 유리합니다. 두 검사가 동일한 플레이트를 사용하고(예: 단백질 함량이나 세포 수에 맞춰) 정규화를 사용하므로 더 나은 정규화가 이루어지며, 더 일관되고 신뢰할 수 있습니다. 이러한 일관성 덕분에 데이터 상관관계가 향상됩니다. 동일한 샘플에서 미토콘드리아와 당분해 매개변수를 직접 결합하면 대사 프로파일링과 통계 분석이 용이해집니다.
이 기술의 유일한 알려진 한계는 두 프로토콜을 단일 판에 결합하면 사용 가능한 웰 복제 수가 줄어든다는 점입니다. 각 조건당 최소 8개의 웰 복제를 보장하기 위해 플레이트당 조건 수를 제한하는 것이 권장됩니다.
감사의 글
이 연구는 국립 소수자 건강 및 건강 격차 연구소(NIMHD)의 지원을 받았으며, 연구비 번호 5U54MD007586-37, A. Ivanova에게 시범 프로젝트로 진행되었습니다; NHGRI 유전체 연구 다양성 센터 UG3HG013248보조금, 연구 프로젝트 2, PI-Ivanova, 그리고 일부 지원은 Genprex Inc.에서 제공되었습니다. 더욱이 이 연구는 NIH 보조금의 지원을 받는 메해리 의과대학 핵심 시설에서 수행되었으며, MD007586, CA163069, S10RR025497 지원을 받고 있습니다.
재료
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| Biologix 피펫 팁-200 & mu; l 확장 (팩, 멸균) | 바이오로직스 USA | SKU 21-0200 | |
| 바이오텍 시너지 H1 | 바이오스펙스 | ||
| BZ-X700 형광 현미경 | 키엔스 | ||
| 코닝 코스타 멸균 일회용 시약 저장소 | 피셔 | 4873 | |
| D-(+)-포도당 용액 45% 함유 | 시그마 | G9769 | |
| DAPI, 염산염 및 nbsp; | 써모피셔 사이언티픽 | D1306 | |
| 에펜도르프 원심분리기 5810 R | 에펜도르프 | ||
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| L-글루타민 200 mM (100x) | 깁코 | 25030-081 | |
| 올림푸스 플라스틱 22-284, 올림푸스 1.7ml 마이크로튜브, 투명, 멸균 폴리프로필렌, 보일프루프, 스테르, 50개/봉지, 250개 튜브/단위 | 제네시 사이언티브 | 22-284 | |
| 올림푸스 플라스틱 28-108, 50ml 원뿔형 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌 벌크, 멸균, 25개 튜브 20봉지, 500개/단위 | 제네시 사이언티브 | 28-108 | |
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| QBI PBS, 1배, Ca, Mg, 페놀 레드, 0.1um 멸균 | 제네시 사이언티브 | 25-507B | |
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