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방법 논문

쥐 무릎 관절 연골세포의 1차 분리, 배양 및 표현형 검증

848 조회수

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DOI:

10.3791/69509

⸱

2025년 11월 7일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 순차적 효소 소화를 사용하여 일차 쥐 무릎 관절 연골 세포의 분리 및 배양을 설명합니다. 이 방법은 검증된 표현형 특성을 가진 연골 세포를 생성하여 연구자에게 연골 연구 응용을 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다.

초록

외상, 노화 또는 염증 상태로 인한 연골 손상은 조직의 본질적으로 제한된 재생 능력으로 인해 중요한 임상적 과제로 남아 있습니다. 연골의 유일한 세포 구성 요소인 연골세포는 세포외 기질 구조와 기능을 유지하는 역할을 하므로 연골 생리학, 병리학 및 재생을 이해하는 데 필수적입니다. 현재 연구는 무릎 관절에서 일차 쥐 관절 연골 세포의 분리, 배양 및 표현형 검증을 위한 포괄적이고 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 최대 세포 생존력을 보장하기 위해 새끼를 새끼 먹는 쥐를 활용하고 효율적인 세포 추출을 위해 트립신 및 콜라게나제 II형을 사용한 순차적 효소 소화를 사용합니다. 연골세포 표현형은 II형 콜라겐 면역형광, 유세포 분석 및 인터루킨(IL)-1β 자극 분석을 통해 확인되어 세포 정체성과 염증 반응성을 확인합니다. 이 최적화되고 재현 가능한 워크플로를 통해 약물 스크리닝, 기계론적 조사 및 조직 공학 응용 분야에 적합한 고순도 연골 세포 배양을 생성하여 연골 생물학 연구를 발전시킬 수 있습니다.

서론

연골은 지지, 쿠셔닝, 충격 흡수 등 여러 가지 중요한 기능을 수행하는 특수한 유형의 결합 조직입니다1. 이는 구조적 안정성을 유지하고 골격계 내에서 이동성을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다 2,3. 기계적 손상, 퇴행성 변화, 염증 또는 대사 이상은 연골 손상을 일으킬 수 있습니다 4,5,6. 연골 세포의 제한된 증식 능력과 결합된 혈관과 신경의 선천적 부족으로 인해 연골 복구는 상당한 어려움을 안겨줍니다. 골관절염(퇴행성 변화 및 기계적 손상으로 유발) 및 류마티스 관절염(자가면역 염증 반응으로 유발)과 같은 질병은 돌이킬 수 없는 연골 손상을 일으켜 환자의 삶의 질을 크게 저하시킬 수 있습니다7,8,9. 연골 조직 내의 독점적인 세포 유형인 연골세포는 세포외 기질의 분비 및 유지, 골격 발달 지원, 관절 완충 및 복구 참여, 연골 성장 및 신진대사의 중추 조절과 같은 주요 기능을 담당합니다 10,11,12.

연골세포는 무혈성 기질 열공 내에 국한되어 있어 자체 증식 및 조직 복구 능력이 심각하게 제한됩니다13,14. 연골 세포의 기능적 상태는 연골 조직의 건강을 직접적으로 결정합니다15. 노화, 염증, 외상 또는 유전적 요인으로 인해 발생하는 연골 세포 기능 장애는 기질 합성을 감소시키고 분해를 증가시킵니다16,17. 이 병리학적 과정은 연골 변성(예: 골관절염)을 유발하여 연골의 필수 지지, 완충 및 윤활 기능을 손상시킵니다. 연골의 제한된 재생 능력은 연골 복구에 상당한 어려움이 있는 핵심 원인이며 현대 정형외과 및 재생 의학의 핵심 연구 분야를 구성합니다. 연골에 대한 현재 연구는 약물 기반 개입, 조직 공학 및 유전자 치료와 함께 이 분야의 주요 초점이 되었으며, 모두 시험관 내 연구를 위해 연골 세포의 분리가 필요합니다 18,19,20,21,22,23,24,25. 결과적으로, 연골세포를 분리하고 식별하는 것은 많은 실험적 접근법에서 중요한 단계를 구성합니다. SW1353과 같은 불멸화된 연골 세포 유사 세포주는 일부 연구에서 편리한 대용물로 사용되지만, 중요한 표현형 마커, 특히 진정한 연골 세포 기능 및 기질 형성에 필수적인 II형 콜라겐의 발현이 부족합니다26. 따라서 일차 연골 세포는 생리학적 관련성이 필요한 연구의 황금 표준으로 남아 있습니다. 여러 효소 조합 또는 광범위한 기계적 조작이 필요한 이전에 발표된 프로토콜과 비교할 때, 단순화된 효소 분해 접근법은 여러 효소 조합 또는 광범위한 기계적 조작이 필요한 방법에 비해 복잡성과 처리 시간을 줄여줍니다. 또한, 포괄적인 검증 단계를 통합하면 기능적 연골세포의 일관된 식별이 보장되고 실험과 실험실 전반에 걸쳐 재현성이 향상됩니다.

연골세포는 II형 콜라겐의 분비를 특징으로 하며, 염증 인자의 자극을 받아 광범위하게 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)를 합성하고 방출합니다27. 따라서 연골 세포 분리 후 II형 콜라겐 면역형광을 통해 세포를 확인하고, 유세포 분석을 이용하여 연골 세포 순도를 평가하였다. 그리고 인터루킨(IL)-1β로 자극하여 매트릭스 메탈로프로테이나제의 특징적인 합성 및 분비를 확인했습니다. 본 연구는 신생아 마우스로부터 연골세포 추출 및 특성화 과정을 설명하여 후속 연골세포 관련 실험의 토대를 마련합니다.

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프로토콜

본 연구에서 동물 피험자의 사용은 중일 우호병원 실험동물 관리 및 복지 윤리 위원회(No. zryhyy21-21-05-16)의 승인을 받았습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 실험동물 및 준비 작업

참고: 슬관절 전치환술 후 쥐, 토끼 및 인간의 관절에서 나온 연골은 연골 세포 분리에 사용할 수 있습니다. 그러나 생존율이 높기 때문에 본 연구에서는 젖먹쥐를 연골세포 추출에 활용하였다.

  1. 실험 동물 생산 시설에서 특수 이송 용기를 사용하여 젖먹이를 쥐를 실험실로 운송합니다.
  2. CO2 질식(기관에서 승인된 프로토콜에 따름)으로 젖먹이를 쥐를 안락사시키고 멸균 용액으로 몸 표면을 헹굽니다.
  3. 안락사된 젖먹이를 쥐를 75% 에탄올에 10분 동안 담가 표면 오염 물질을 소독합니다.
  4. 소독된 젖먹이를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
    참고: 젖먹쥐의 철저한 표면 청소와 에탄올 침수는 후속 실험에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 박테리아 또는 곰팡이 오염을 방지하기 위한 중요한 단계입니다.

2. 관절 연골 조직의 분리

참고: 신생아 연골은 뼈 골단을 덮고 있는 반투명한 청백색 층으로 나타납니다. 후속 실험을 손상시킬 수 있는 오염을 방지하기 위해 이 단계에서 엄격한 무균 기술을 따라야 합니다.

  1. 메스와 안과용 가위를 사용하여 젖먹쥐 무릎 관절을 분리한 다음 그 위에 있는 피부 조직을 제거합니다.
  2. 해부된 무릎 관절을 새 멸균 페트리 접시로 옮기고 메스와 안과용 가위를 교체합니다.
  3. 메스를 사용하여 무릎 관절에서 관절 연골을 채취한 다음 안과용 가위로 주변 결합 조직을 철저히 잘라냅니다.

3. 연골 조직의 소화

참고: 트립신을 사용하여 연골 주변의 결합 조직을 소화한 다음 연골 기질 소화를 위해 0.2% 콜라게나제 II를 사용합니다.

  1. 수확한 연골을 3부피의 0.25% 트립신에 넣고 37°C 온도 조절 셰이커에서 30분 동안 교반하면서 배양합니다.
  2. 소 태아 혈청(FBS)을 10% 함유한 PBS를 첨가하여 소화를 종료합니다. 안과용 가위를 사용하여 연골에서 부착 조직을 제거합니다. 원심분리(4°C, 500× g, 5분)하고 상청액을 버립니다.
  3. 연골 조직을 PBS에 재현탁하고 원심분리(4°C, 500× g, 5분)하고 상청액을 버립니다. 이 세탁 단계를 3회 반복합니다.
  4. 처리된 연골 조직에 0.2% 콜라게나제 II를 첨가하고 37°C 온도 조절 셰이커에서 4시간 동안 교반하면서 소화합니다.

4. 연골 세포 분리 및 배양

알림: 모든 절차는 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 멸균 장갑은 실험적 오염을 방지하기 위해 세포 여과기에 주사기 플런저를 사용하여 연골 조직을 기계적으로 해리하는 동안 착용해야 합니다. 표준 배양 조건에서 일차 연골 세포는 일반적으로 첫 번째 계대에 대해 80%-90% 합류에 도달하는 데 약 2-3일이 필요합니다.

  1. 멸균 배양 접시 위에 200μm 세포 여과기를 놓고 메쉬를 통해 소화된 연골 현탁액을 여과합니다.
  2. 멸균 주사기 플런저를 사용하여 스트레이너의 잔여 연골 조각을 분쇄한 다음 완전한 DMEM 배지로 스트레이너를 헹굽니다.
  3. 모든 여과액을 수집하고 원심분리(4°C, 500× g, 5분)하고 상청액을 버립니다.
  4. 펠릿을 PBS에 재현탁하고 원심분리(4°C, 500× g, 5분)하고 상청액을 버립니다.
  5. 세포를 완전한 DMEM 배지에 재현탁하고 T25 배양 플라스크로 옮깁니다.
  6. 가습된 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 플라스크를 배양합니다.
  7. 트립신-EDTA를 사용하여 이 합류점에서 계대 세포를 계대하고 1:2 비율로 계대배양합니다.

5. 연골세포 식별을 위한 II형 콜라겐 면역형광 염색

참고: 부착된 연골 세포는 방추 모양의 다각형 형태를 특징으로 합니다. 이 연구에서 제시된 모든 바이오마커 분석은 Passage 2의 세포를 사용하여 수행되었습니다. 3계대의 연골세포는 방추 모양의 섬유아세포 유사 형태로의 이동과 증식 속도의 감속을 특징으로 하는 보다 뚜렷한 역분화를 나타내기 시작합니다. 이 표현형 변화는 4번 통과 후에 더욱 분명해집니다. 6계대까지 대부분의 세포는 길쭉한 섬유아세포와 같은 모양을 취합니다. 항체 희석액은 제조업체의 권장 사항에 따라 결정되었으며 최적의 특이성과 신호 강도를 보장하기 위해 예비 실험을 통해 검증되었습니다.

  1. 24웰 플레이트에 연골 세포를 종자 하고 세포 접착을 허용하기 위해 24시간 동안 배양합니다.
  2. 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 3회 세척합니다(각 웰에 PBS를 추가하고 5분 동안 배양한 다음 흡인).
  3. 세포를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정한 다음 PBS로 3회 세척합니다.
  4. 0.3% Triton X-100(PBS에서 준비)으로 세포를 10분 동안 투과화합니다.
  5. 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 동물이 없는 차단 용액(150μL/웰, PBS에서 5× 희석)으로 실온에서 1시간 동안 차단합니다.
  6. 차단 용액을 제거하고 1차 항체(anti-Col II, 1:200 희석)와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다.
  7. 1차 항체를 회수하고 PBS로 세포를 3회 세척합니다.
  8. Alexa Fluor 488 접합 항토끼 IgG 2차 항체(1:50 희석)를 첨가하고 어두운 곳에서 37°C에서 1.5시간 동안 배양합니다.
  9. 2차 항체를 제거하고 PBS로 세포를 3회 세척합니다.
  10. DAPI 함유 퇴색 방지 배지로 마운트하고 어두운 곳에서 10분 동안 건조시킵니다.
  11. 도립 형광 현미경을 사용하여 이미지를 관찰하고 캡처합니다.

6. 연골세포 순도의 유세포 분석

참고: 연골세포는 식별을 위한 결정적인 마커 역할을 하는 II형 콜라겐을 합성하고 분비하는 능력이 특징입니다. 연골육종 세포주 SW1353은 일부 연골 세포 특성을 나타내지만 II형 콜라겐 분비 능력이 부족하여 이 실험에서 음성 대조군 역할을 합니다.

  1. EDTA가 없는 트립신을 사용하여 연골 세포와 SW1353 세포를 모두 소화합니다.
  2. 완전한 DMEM 배지로 분해를 중화하고 PBS에 세포를 재현탁합니다.
  3. 세포를 고정/투과화 용액과 함께 15분 동안 배양한 다음 1mL 세척 완충액을 첨가합니다.
  4. 원심분리(500× g, 5분)하고 상청액을 버리고 100μL 항형 II 콜라겐 항체(1:100 희석)와 함께 빛으로부터 보호된 상태에서 15분 동안 배양한 다음 1mL 세척 완충액을 첨가합니다.
  5. 원심분리(500× g, 5분)하고 상청액을 버리고 Alexa Fluor 488 접합 항토끼 IgG 2차 항체와 함께 빛으로부터 보호된 상태에서 30분 동안 배양한 다음 1mL 세척 완충액을 첨가합니다.
  6. 원심분리(500× g, 5분)하고 상층액을 버리고 각 샘플을 200μL 세척 완충액에 재현탁한 다음 유세포 분석법으로 분석합니다.

7. 연골세포의 IL-1β 자극

참고: IL-1β 자극에 반응하여 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 생성은 연골세포의 특징적인 특징입니다. 따라서 이 연구는 IL-1β 자극을 사용하여 분리된 연골 세포에서 이러한 표현형 특성을 검증합니다.

  1. 배양 플라스크에서 연골 세포를 소화하고 완전한 DMEM 배지에 재현탁합니다.
  2. 세포 수를 계산하고 완전한 DMEM을 사용하여 농도를 5 × 105 cells/mL로 조정합니다.
  3. 세포를 6웰 플레이트(총 24웰)에 시드하고, 12개의 웰을 블랭크 대조군으로, 12개의 웰을 IL-1β 자극 그룹으로 지정합니다.
  4. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 12시간 동안 배양합니다.
  5. 세포 접착이 완료된 후 자극군에 10ng/mL IL-1β를 첨가한다.
  6. ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 분석을 위해 24시간 후에 세포 배양 상청액을 수집합니다.
  7. PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
  8. 후속 웨스턴 블롯 분석을 위해 6개의 대조군 웰과 6개의 IL-1β 자극 웰을 RIPA 완충액으로 용해합니다.
  9. qPCR 분석을 위해 TRIzol을 사용하여 6개의 대조군 웰과 6개의 IL-1β 자극 웰에서 RNA를 추출합니다.

8. 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 분석

참고: 모든 RNA 관련 실험은 DEPC 처리된 소모품을 사용하여 수행되었습니다. 간단히 말해서, 튜브와 팁을 0.1% DEPC에 12시간 동안 담가두고, 고압멸균(121°C, 20분)하여 RNase와 잔류 DEPC를 모두 비활성화하고, 사용하기 전에 오븐에서 건조시켰다.

  1. 세포 펠릿에 1mL Trizol을 첨가하고 균질화기를 사용하여 균질화합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  2. 0.2mL 클로로포름을 첨가하고 30초 동안 세게 소용돌이치게 소용돌이치게 합니다. 실온에서 3분 동안 배양합니다.
  3. 4°C, 12,000 × g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 무색 수성상을 새 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 같은 부피의 이소프로판올을 첨가합니다.
  4. 잘 섞고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 4°C, 12,000 × g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 RNA 펠릿을 유지합니다.
  5. RNA 펠릿에 사전 냉각된 75% 에탄올 1mL를 첨가합니다. 완전히 소용돌이치고 4°C, 12,000 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 RNA 펠릿을 유지합니다.
  6. 생물안전 캐비닛에서 RNA 펠릿을 자연 건조합니다. RNA를 RNase가 없는 물 20μL에 용해시킵니다.
  7. Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도와 품질을 측정합니다.
  8. 역전사 키트를 사용하여 총 RNA를 cDNA로 역전사합니다.
  9. 총 RNA 1μg, 염화마그네슘 용액 4μL, dNTP 혼합물 2μL, RNase 억제제 0.5μL, AMV 역전사 효소 0.6μL, 랜덤 프라이머 1μL 및 RNase가 없는 물을 포함하는 반응 혼합물을 준비하여 최종 부피를 20μL로 조정합니다.
  10. 반응을 42°C에서 15분 동안 배양한 다음 95°C에서 5분 동안 배양합니다. 4°C에서 5분 동안 식힌 다음 RNase가 없는 물로 cDNA를 희석합니다.
  11. 2 μL cDNA, 10 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix, 정방향 및 역방향 프라이머(표 1)를 각각 0.2 μmol/L의 최종 농도, RNase가 없는 물을 포함하는 PCR 반응 혼합물을 최종 부피 20 μL로 준비합니다.
  12. PCR 조건을 다음과 같이 설정합니다: 95°C에서 1분 동안 사전 변성한 후 95°C에서 15초, 60°C에서 15초, 72°C에서 45초 동안 40회 사이클을 수행합니다. 72°C 확장 단계 동안 형광 데이터를 수집합니다.
  13. 반응 후 각 샘플과 내부 참조에 대한 CT 값을 기록합니다. 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 표적 유전자의 상대적 발현 수준을 계산합니다.

9. ELISA 분석

참고: 사용하기 전에 비오티닐화 항체 작동 용액과 효소 접합체 작동 용액을 신선하게 준비하십시오.

  1. 30분 전에 냉장고에서 ELISA 키트를 꺼내 실온으로 평형을 이룹니다.
  2. 키트 지침에 따라 필요한 모든 솔루션을 준비하십시오.
  3. 100μL의 샘플 또는 표준 용액(다양한 농도)을 지정된 웰에 추가합니다(제로 웰에는 표준/샘플 희석 완충액만 포함됨). 플레이트를 접착 필름으로 밀봉하고 37°C에서 90분 동안 배양합니다(블랭크 컨트롤 웰 제외).
  4. 액체를 버리고 350μL 세척 완충액으로 각 웰을 세척합니다. 30초 동안 배양하고 액체를 버리고 두꺼운 흡수성 종이에 닦아냅니다. 세탁을 4회 반복합니다.
  5. 각 웰에 100μL의 비오티닐화 항체 작동 용액을 첨가합니다. 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 60분 동안 배양합니다(빈 대조군 웰 제외).
  6. 액체를 버리고 4단계에서 설명한 대로 각 웰을 4회 세척합니다.
  7. 각 웰에 100μL의 효소 접합체 작동 용액을 첨가합니다. 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다(블랭크 대조군 웰 제외).
  8. 액체를 버리고 4단계에서 설명한 대로 각 웰을 4회 세척합니다.
  9. 각 웰에 100μL의 기질 용액을 첨가합니다. 빛으로부터 보호하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
  10. 각 웰에 100μL의 정지 용액을 첨가하고 완전히 혼합한 다음 즉시 450nm에서 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
  11. CurveExpert 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선을 생성하고 시료 농도를 계산합니다.

10. 웨스턴 블롯 분석

참고: 실험 전에 전기영동 완충액, 전사 완충액, TBST, 5% 탈지유를 준비하고 PVDF 멤브레인을 미리 적절한 크기로 절단하십시오. 그런 다음 화학발광 이미징 시스템을 사용하여 화학발광 신호를 캡처합니다. 일반적으로 10초에서 5분 사이의 그래디언트 노출을 위해 기기를 자동 또는 수동 모드로 설정하여 신호가 선형 동적 범위 내에서 캡처되도록 하고 픽셀 포화를 방지합니다. 신호 캡처 후 후속 정량 분석을 위해 대상 대역이 선명하고 배경이 낮은 노출 이미지를 선택합니다.

  1. RIPA 용해 완충액(1% PMSF 및 1% 포스파타제 억제제 포함)을 준비하고 6웰 플레이트의 웰당 250μL의 비율로 RIPA 용해 완충액을 첨가합니다.
  2. 초음파 교란기 (3 사이클, 각각 7-10 초)를 사용하여 세포를 용해하고 얼음 위에서 30 분 동안 배양합니다.
  3. 용해물을 4°C, 12,000 × g 에서 10분 동안 원심분리한 다음 단백질 정량을 위해 상청액을 수집합니다.
  4. 비신코닌산(BCA) 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.
  5. RIPA 용해 완충액을 사용하여 단백질 농도를 동일한 수준으로 조정합니다.
  6. 5× 로딩 버퍼를 샘플에 4:1 비율로 추가합니다(샘플: 버퍼).
  7. 샘플을 10분 동안 끓인 다음 4°C, 12,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하고 전기영동을 위해 상청액을 수집합니다.
  8. 전기영동 챔버에 SDS-PAGE 젤을 조립하고 빗이 잠길 때까지 전기영동 완충액을 채웁니다.
  9. 빗을 제거하고 샘플을 웰에 로드한 다음 참조 레인에 단백질 사다리를 추가합니다.
  10. 브로모페놀 블루 염료가 겔 바닥에 도달할 때까지 전기영동을 실행한 다음 장치를 분해하고 겔을 회수합니다.
  11. 전송 "샌드위치"를 조립하고 일정한 전압에서 습식 전송을 수행합니다.
  12. 실온에서 1시간 동안 TBST의 5% 탈지유로 PVDF 멤브레인을 차단합니다.
  13. 희석된 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다.
  14. 1차 항체를 회수하고 TBST로 멤브레인을 세척합니다(5 × 5분).
  15. HRP 접합 2차 항체와 실온에서 90분 동안 배양합니다.
  16. 2차 항체를 회수하고 막을 TBST로 세척합니다(5 × 5분).
  17. ECL 기판 용액을 준비하여 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
  18. ECL 기판을 멤브레인에 적용하고 구배 노출이 있는 이미징 시스템을 사용하여 화학 발광 신호를 캡처합니다.
  19. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드 강도를 분석하고 추가 분석을 위해 상대적인 단백질 발현 수준을 계산합니다.

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결과

II형 콜라겐에 대한 면역형광 염색은 분리된 연골세포가 강하게 양성임을 입증했습니다(그림 1A). 유세포 분석 결과 세포의 98% 이상이 II형 콜라겐에 대해 양성인 반면(그림 1B), 음성 대조군 SW1353 세포는 음성이었습니다(그림 1C). 24시간 동안 10ng/ml IL-1β로 자극한 후, 웨스턴 블로팅은 연골 세포에서 MMP3 및 MMP13 단백질 수준의 현저한 상승을 입증했으며(그림 2A), RT-PCR 분석은 연골 세포에서 MMP3 및 MMP13 mRNA 발현의 유의한 증가를 나타냈고(그림 2B) ELISA는 세포 배양 상청액에서 MMP3 및 MMP13 단백질 함량의 상당한 증가를 감지했습니다(그림 2C

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토론

여기에 설명된 프로토콜은 일차 쥐 관절 연골 세포의 분리 및 배양에 대한 몇 가지 주요 이점을 제공합니다. 어린 동물의 연골은 성인 연골에 비해 증식성 연골 세포가 더 많고 광물화된 기질이 적기 때문에 젖먹이를 새끼 쥐의 사용은 최적의 세포 수율과 생존력을 달성하는 데 중요합니다. 이 연령 선택은 효소 소화 및 후속 세포 회수의 효율성을 크게 향상시킵니다.

순차적 효소 소화 접근법은 이 프로토콜의 중요한 측면을 나타냅니다. 초기 트립신 치료는 말초 결합 조직을 효과적으로 제거하고 연골 기질을 부분적으로 파괴하는 반면, 후속 콜라게나제 II 분해는 연골 세포를 둘러싼 II형 콜라겐이 풍부한 세포외 기질을 구체적으로 표적으로 삼습니다. 4시간 콜라게나제 소화 시간은 세포 손상을 최소화하면서 완전한 세포 방출의 균형을 맞추도록 최적화되었습니다. 소화 기간이 짧으면 세포 방출이 불완전해질 수 있으며, 노출이 길어지면 세포 생존...

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공개 사항

저자는 이 작업에 대한 이해 상충이 없다고 보고합니다.

감사의 글

이 연구는 국립 고위급 병원 임상 연구 기금 및 중일 우호 병원의 엘리트 의료 전문가 이니셔티브(NO. ZRJY2025-QM05)를 사용합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% 파라포름알데히드솔라비오P1110
5× 로딩 버퍼솔라비오P1040
Alexa Fluor 488-접합 항토끼 IgG중산 징차오 생명공학ZF-0511
동물 없는 차단 솔루션세포 신호 전달 기술15019
항콜라겐 II 항체앱캠AB34712
비신코닉산(BCA) 단백질 분석 키트솔라비오PC0020
콜라게나제 II예센 바이오테크놀로지40508ES60
DAPI 함유 형광 마운팅 배지중산 징차오 생명공학ZLI-9556
둘벡코의 변형 독수리 미디엄솔라비오11995
태아 소 혈청(FBS)솔라비오S9010
고추냉이 페록시다제(HRP) 결합 염소 항토끼 IgG중산 징차오 생명공학ZB-2301
IL-1&베타;페프로텍400-01B
MMP13 토끼 mAb복종A11148
MMP3 토끼 mAb복종A11418
무지방 건조 우유솔라비오D3840
인산염 완충 식염수(PBS)솔라비오P1020
PVDF 멤브레인써모피셔 사이언티브88518
랫 MMP-13 ELISA 키트누브NBP3-06931
랫 MMP-3 ELISA 키트누브NBP3-06894
역전사 키트프로메가A3500
RIPA 용해 버퍼솔라비오R0010
RNase 없는 물솔라비오R1600
SDS-페이지 젤에피자임PG112
SYBR 그린 실시간 PCR 마스터 믹스토요보QPK-201
트리톤 X-100솔라비오T8200
트리졸솔라비오15596026
트립신솔라비오T1320
초민감 ECL 화학발광 기판 키트NCM 바이오텍P10300
β-액틴 토끼 mAb복종AC026

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