렙토스피라 바이오필름의 정량적, 구조적, 기능적 분석을 위한 모듈식 워크플로우

Summary

이 프로토콜은 결정-바이올렛 바이오매스 분석, 타임랩스 위상 차비 역학, 공초점 3D/매트릭스 매핑, SEM 초구조, 생체 내 햄스터 감염 모듈을 결합한 모듈형 BSL-2 워크플로우를 제공하여 렙토스피라 바이오필름의 기능적 역할을 배양, 정량, 특성화, 조사하여 실험실 간 돌연변이 및 반바이오필름 개입의 표준화된 평가를 가능하게 합니다.

Abstract

여기서는 렙토스피라 속 바이오필름의 배양, 정량적 모니터링, 구조적 및 기능적 특성 분석을 위한 통합 프로토콜 모음을 제시합니다. 이 워크플로우는 결정 자비 미세타이터 분석법을 결합하여 여러 시점에서 바이오필름 생체량을 측정하며, 부착(바이오필름)과 비부착(액체상) 박테리아 집단을 구분하는 시간 분해 분획 접근법, 비파괴적 동역학적 관찰을 위한 타임랩스 위상 대비 영상, 공초점 레이저 주사 현미경으로 매트릭스 프로브 판독을 포함한 전체 3D 재구성을 생성하고, 막 지지 주사 전자현미경을 이용해 초구조 분석을 수행합니다. 동시에 온전한 바이오필름 집합체를 수확하여 감수성 있는 골든 시리아 햄스터 모델에 복막 내 주입을 준비하는 표준화된 절차를 상세히 설명하여, 일치된 플랑크톤 대조군과 함께 생 체 내 바이오필름 관련 병원성 직접 평가를 가능하게 합니다.

병원성 균주 Leptospira interrogans Manilae L495에 최적화된 각 모듈은 다른 Leptospira 종과 돌연변이 라이브러리로 쉽게 이전하여 바이오필름 형성 능력을 비교할 수 있습니다. 이 통합된 모듈들은 항생체막 전략 선별, 유전적 결정 요인 탐구, 그리고 바이오필름이 렙토스피라 지속 및 병인에 기여하는 바를 명확히 하는 견고한 토대를 제공합니다.

Introduction

바이오필름은 다당류, 단백질, 핵산 및 지질로 구성된 자가 분비성 세포외 고합물질(EPS) 기질 내에 세포가 내재된 구조화된 미생물 군집입니다^. 이 매트릭스는 기계적 안정성을 제공하고, 표면에 대한 접착을 매개하며, 건조, 산화 스트레스, 항균제와 같은 환경 스트레스에 대한 내성을 부여함으로써 미생물의 생존을 향상시킵니다 ^2,3. 병원성 박테리아에서 바이오필름은 지속, 면역 회피, 만성 감염을 촉진합니다 ^4,5.

플랑크톤 세포는 자유롭게 떠다니며 대사적으로 더 균질한 반면, 바이오필름 관련 세포는 유전자 발현, 성장 속도, 대사 활동에 변화가 있습니다⁶. 이러한 차이는 환경 도전, 항생제, 숙주 방어에 대한 내성을 향상시키며, 쿼럼 감지, 영양 보유, 공간 조직과 같은 조정된 행동을 가능하게 합니다 ^7,8.

바이오필름 형성은 Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae와 같은 모델 생물에서 광범위하게 특성화되어 왔으며, 이들은 바이오필름 생활방식의 유전적, 구조적, 생리학적 기초에 대한 이해를 형성하는 데 기여했습니다. 슈도모나스 연구는 외다당류와 쿼럼 감지가 함께 작용하여 복잡한 3차원 바이오필름 구조를 형성한다는 사실을 밝혀냈습니다 ^9,10. 포도상구균 연구는 표면 단백질과 세포외 DNA가 바이오필름 응집력과 항생제 내성을 향상시키는 역할을 강조했습니다^11,12. 비브리오 종에 대한 조사는 생물필름 형태의 놀라운 다양성과 수생 환경에서의 생태학적 중요성¹³를 더욱 부각시켰습니다. 이 시스템들은 표준화된 프로토콜¹⁴와 기존 기술에 대한 비판적 평가(^15,16)를 통해 바이오필름 연구를 위한 견고한 개념적·방법론적 틀을 제공하여, 렙토스피라와 같은 덜 연구된 박테리아에서 바이오필름 형성을 조사할 때 조화로운 접근법의 필요성을 강조합니다.

렙토스피라증의 원인균인 나선류(Leptospira) 속의 구성원들은 오랫동안 주로 플랑크톤성 생물로 추정되어 왔다. 최근 연구들은 여러 종에서 견고한 바이오필름 형성을 실험적으로 입증^{했습니다.} 일부 연구는 환경¹⁸과 숙주 관련¹⁹ 맥락에서 바이오필름 형성을 제안하는 반면, 다른 연구들은 렙토스피라가 Rattus norvegicus²⁰의 신미관과 말²¹의 유리체 내에서 바이오필름을 형성할 수 있는 능력을 실험적으로 입증했으며, 환경 바이오필름^22,23 내에서 렙토스파이클 종을 검출하는 능력도 입증했습니다. 따라서 렙토스피라 바이오필름을 지배하는 조건과 메커니즘을 해독하는 것은 환경 전파, 저수지 지속 가능성, 질병 발병 기전을 이해하는 데 매우 중요합니다^24,25.

기존의 렙토스피라 바이오필름 분석은 단편적이며, 정성적 현미경 관찰^17,26부터 종말 비도 또는 결정 보라색 염색^27,28까지 다양하다. 이 연구들은 바이오필름 형성에 대한 귀중한 통찰을 제공했지만, 바이오필름 성숙과 확산을 실시간으로 모니터링하는 데 필요한 운동학적 해상도와 공초점 또는 전자현미경이 제공하는 초구조적 맥락을 모두 갖추지 못하는 경우가 많습니다. 지속적인 모니터링과 3D 구조 분석은 바이오필름 형성과 확산의 동적 특성을 포착하기 위해 필수적이라고 여겨집니다 ^14,15. 이러한 한계는 연구 간 비교 가능성을 저해하고, 바이오필름 형성과 확산에 영향을 미치는 요인이나 개입에 대한 체계적 평가를 제한하여, 렙토스피르와 바이오필름의 구조적·기능적 역학을 모두 재현 가능하고 포괄적으로 포착하는 표준화된 다중 측정 워크플로우의 필요성을 강조합니다.

이러한 격차를 해결하기 위해, 우리는 동일한 문화 시리즈에서 가져온 여섯 가지 상호 보완적인 측정값을 통합하는 통합되고 모듈화된 워크플로우를 개발했습니다. 첫째, 고처리량 CV 미세타이터 분석법은 여러 시점에서 부착된 생체량을 정량화합니다. 둘째, 96웰 플레이트에서의 시간 분해 분획 분석은 OD₄₀₅ 비율로 전체 액체상(비부착 또는 부분 분리된), 부착(바이오필름) 집단을 OD₄₀₅로 나누어 형성과 분산 과정에서 진화를 추적합니다. 여기서 액체상이라는 용어는 플랑크톤 유사 세포와 분리된 세포 모두를 포괄하며, 자유 생활 표현형과 표면 관련 표현형 간의 동적 연속체를 인정한다^29,30. 셋째, 타임랩스 위상 대비 영상은 부착, 집단 운동성, 응집의 비파괴적 동역학을 제공합니다. 넷째, 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)은 라이브 및 데드 및 매트릭스 프로브 판독을 포함한 완전한 3D 재구성을 제공하여 깊이 의존적 생존성과 매트릭스 매핑을 가능하게 합니다. 다섯째, 막 또는 커버슬립 지지 주사 전자현미경(SEM)은 세포외 구조와 기저-끝 극성을 고해상도로 분해합니다. 또한, 생체 내 모듈을 포함해 생체 내 배경관 내 주입을 통해 감수성 골든 시리아 햄스터 모델에 생물필름 집합체를 주입하여 독성을 평가하였으며, 이는 렙토스피라증 31,32,33에 대한 민감하고 확립된 모델입니다. 이 접근법은 바이오필름 표현형과 병원성 잠재력을 연결하여 시험관 내 분석을 보완하는 기능적 맥락을 제공합니다.

단일 모달리티 접근법과 비교할 때, 이 플랫폼은 여러 가지 장점을 제공합니다: (i) 동기화된 정량(CV 및 분획 OD) 및 구조(CLSM/SEM) 판독; (ii) 초기 부착, 성장, 성숙 및 확산에 대한 비파괴적 동역학 모니터링; (iii) 표적 프로브를 이용한 3차원 생존 가능성 및 매트릭스 특성화; (iv) 세포외 기질 구조의 초세구조 시각화; 그리고 (v) 표준 BSL-2 인프라로 달성 가능한 감수성 햄스터 모델에서 바이오필름 관련 바이러스성 대 플랑크톤성 병원성의 직접적인 기능 평가. 멀티웰 포맷과 탈착식 유리 또는 폴리카보네이트 기판을 활용함으로써, 이 워크플로우는 환경 변수, 항균 화합물 또는 돌연변이 라이브러리의 복제 스크리닝을 지원하면서 무균성, 처리량, 모듈 간 교차 검증을 유지합니다.

생태학, 지속성, 숙주-병원체 상호작용, 또는 항바이오필름 발견에 초점을 맞춘 연구실은 개별 모듈이나 전체 파이프라인을 채택할 수 있습니다. 필요한 자원은 플레이트 리더, 타임랩스를 위한 환경 제어 기능이 있는 역현미경, 공초점 현미경 및 SEM 시설 접근, 햄스터 모델용 표준 동물 시설로 제한되어 있어 연구 간 광범위한 채택과 재현 가능한 비교가 가능합니다.

Protocol

윤리 진술:
이 연구는 뉴칼레도니아 파스퇴르 연구소 동물 관리 및 이용 위원회의 승인을 받았으며, 파리 파스 파스퇴르 연구소 동물 관리 및 이용 위원회의 지침과 유럽 권고안 2007/526/EC에 따라 수행되었습니다. 동물 연구 실험 등록 번호: IPNC-2018-ARE-001

참고: 살아있는 렙토스피라 배양이 포함된 모든 절차는 기관 생물안전 지침을 준수하는 생물안전 2단계(BSL-2) 실험실에서 수행되어야 합니다. 모든 배양 조작은 작업자의 안전을 보장하고 환경 오염을 방지하기 위해 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 수행되어야 합니다.

이 연구에 사용된 Leptospira interrogans serovar Manilae 균주 L495는 원래 파스퇴르 연구소(프랑스 파리)에서 수집되었으며, 현재 뉴칼레도니아 파스퇴르 연구소에 보관 중입니다. 병원성을 유지하기 위해 감염된 햄스터로부터 주기적으로 재분리됩니다. 모든 시험관 내 실험에서, 동물 숙주에서 회복된 후 6개의 아그룹양 이상 배양을 유지하지 않았습니다.

모든 동물 시술은 기관 지침을 준수하며 적절한 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아야 합니다. 실험은 유럽의 동물 복지 규정(EU 지침 2010/63)과 공중보건국의 권고를 준수해야 하며, 동물 사용이 정당하고 윤리적으로 규제되어야 합니다.

1. 박테리아 접종체 제제

1. Leptospira spp. 세포를 EMJH^{배지 34}에서 호기성 조건에서, 평평한 바닥의 스크류 캡 유리관 안에서 진동 없이 30°C에서 배양하다가 로그 단계 중간 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 이러한 조건에서 햄스터를 통해 생체 내에서 정기적으로 유지되는 저통도 균주 L495는 일반적으로 3-5일 이내에 적절한 세포 밀도에 도달합니다. 배양액이 405nm(2에서 5 x 10,⁸ cells/mL)에서 O.D.가 0.2-0.4 사이로 도달하도록 한 후 신선한 EMJH 배지에서 희석하고, 20배 배율의 암흑 현미경으로 운동성과 응집 없음을 검증합니다.
   참고: EMJH는 내재 흡수력을 가지고 있습니다. 분광광도계를 멸균 EMJH로 비우고 이 값을 모든 측정값에서 빼세요. 접종량은 광학 밀도 측정이나 페트로프-하우스 챔버를 이용한 직접 셀 카운팅을 통해 표준화할 수 있습니다. 검증된 중간 로그 배양을 1:100 희석하면 일반적으로 OD₄₀₅ = 0.02 (≈ 1 x 10⁶ cells/mL)가 나옵니다. 부드럽게 반전하여 섞으세요; 소용돌이 하지 마세요.
2. 10 μL 알리코트를 암흑 현미경 20배 배율로 검사합니다. 세포의 90%≥ 매우 운동성이 높고 눈에 띄는 뭉치가 없는지 확인하세요. 검증된 중간 로그 배양 1:100을 신선한 EMJH에 희석하여 OD₄₀₅ = 0.02(≈ 1 x 10⁶ cells/mL)를 얻습니다. 부드럽게 반전하여 섞으세요; 소용돌이 하지 마세요.
   참고: 하나의 작동하는 접종체가 이 프로토콜(그림 1)에 상세히 설명된 모든 하위 분석법을 지원합니다. 36mL를 준비하여 24웰 플레이트(1mL/웰) 또는 20mL를 96웰 플레이트(200 μL/웰)에 씨앗을 만듭니다. 필요한 플레이트 수에 맞게 부피를 조정하세요.

그림 1. 렙토스피라 바이오필름 분석의 글로벌 워크플로우. 기하급수적으로 성장하는 렙토스피라 배양은 먼저 성장 여부를 평가하고 광학 밀도로 표준화됩니다. 배양 데이터는 유리 또는 막 플레이트, 현미경 마이크로접시, 또는 96웰 플레이트에 배포됩니다. 작업 흐름은 7개의 모듈로 구성되어 있습니다: (1) 접종 제제; (2) 생체량 정량을 위한 결정 바이올렛 염색; (3) SEM에 의한 초구조 영상; (4) 타임랩스 위상 차비 현미경을 이용한 동적 바이오필름 모니터링; (5) CLSM을 통한 3D 시각화(생/죽음 염색 포함); (6) 광학 밀도 를 이용 한 바이오필름 형성 중 부착 및 비부착 분획의 시간 분해 정량화; 그리고 (7) 시리아 햄스터에서 감염 중 바이오필름의 기능적 역할을 조사했다. 이 통합 접근법은 바이오필름 발생, 구조 및 병원성에 대한 다중 모달 분석을 가능하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 크리스탈 바이올렛 - 커버슬립 또는 멤브레인 위의 바이오필름 기반 정량화

1. BSL2 생물안전 후드 내부에서는 멸균 겸자를 사용해 12mm 멸균 유리 커버슬립 또는 0.1 μm 멸균 친수성 폴리카보네이트 멤브레인 1장을 각 웰 바닥에 덮어 뚜껑이 있는 멸균 24웰 플레이트에 평평하게 놓습니다. 멤브레인/유리 커버슬립을 30°C에서 2시간 동안 1mL의 멸균 EMJH와 함께 미리 담가둡니다.
   참고: 필수는 아니지만, 기질을 EMJH에 미리 담가두면 젖음이 개선되고 박테리아 부착력이 약간 향상됩니다.
2. 불림 용액을 제거하고 희석된 박테리아 현탁액 1.5mL(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ cells/mL)를 각 웰에 추가합니다. 커버슬립이나 멤브레인이 바닥에 단단히 고정되어 있는지 확인하세요.
3. 배양 배양지를 증발시키기 위해 배양지를 유지하기 위해 30°C의 정적인 조건에서 습한 대기 환경에서 배양판을 배양합니다. 성장이 느린 균주에는 성숙하고 부착하는 바이오필름이 형성되도록 3주간의 잠복이 권장됩니다.
4. 원하는 시점에 바이오필름을 교란하지 않고 각 웰에서 가능한 한 많은 배양지를 조심스럽게 제거하세요. 각 웰을 1mL의 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 부드럽게 헹구어 잔여 비부착 세포를 제거하고, 커버슬립을 웰 바닥에 평평하게 붙여 연약한 바이오필름 세포가 떨어지지 않도록 하세요. 이러한 조건에서는 바이오필름 성장이 주로 커버슬립의 상부에서 발생하고, 아랫면에서는 거의 성장하지 않으므로, 세척만 해도 표면 부착 세포를 농축하여 후속 분석에 활용할 수 있습니다.
   참고: 이 단계에서 바이오필름은 매우 연약하여 실수로 흡입될 수 있습니다. 피펫팅은 바이오필름을 손상시키지 않도록 우물 벽을 따라 천천히 정밀하게 수행해야 합니다.
5. 바이오필름 샘플을 고정하기 위해 37°C에서 PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL를 30분간 첨가합니다. 고정제를 제거하고 1mL PBS로 조심스럽게 두 번 헹구세요.
   참고: 고정 시에는 4% 포름알데히드 용액(16% 메탄올 프리 스톡을 PBS에 1:4 희석)을 신선히 준비한 후 사용 후 버렸습니다. 이는 중합이 파라포름알데히드로 작용하면 가교 활성이 감소하기 때문입니다.
6. 각 웰에 0.1% (w/v) 크리스탈 바이올렛(CV) 용액 1mL를 추가하고, 실온에서 15분간 배양하여 멤브레인이나 커버슬립이 완전히 덮이도록 합니다.
7. 염료를 버리고 1mL PBS로 두 번 씻어내세요.
   참고: 크리스탈 바이올렛과 파라포름알데히드(PFA)는 독성이 있으며 피부와 눈을 자극할 수 있습니다. 항상 장갑을 끼고 두 화학물질 모두 조심스럽게, 가능하면 훈기 후드에서 다루세요. 폐기물은 기관 안전 지침에 따라 지정된 유해 염료 또는 화학 폐기물 용기에 폐기됩니다.
8. 접시를 기울이고 잔류 액체를 빼내세요. 우물을 실온에서 자연 건조하여 기질이 완전히 마른 것처럼 보이게 하세요(≥ 4시간, 가능하면 하룻밤 정도).
   참고: 이 단계에서는 덮개슬립이나 막 표면에 점 모양 또는 망상 구조물이 보일 수 있습니다(그림 2A).
9. 각 웰에 500 μL 용출 완충제(50% 에탄올, 50% 빙하 아세트산(부피/부피))를 첨가합니다. 플레이트를 15분간 부화시키세요. 피펫을 위아래로 움직여 바이오필름에 결합된 결정 바이올렛을 완전히 녹여내세요.
10. 각 샘플 200 μL을 광학 투명 96웰 마이크로플레이트에 옮기고 570 nm에서 흡광도를 측정합니다. 접종되지 않은 커버슬립 또는 멤브레인을 고정, CV 염색, 세척, 용출을 통해 내성 결합/배경을 제거하여 준비한 기판 전용 블랭크를 빼는 것입니다. 최소 세 번의 기술 복제± 표준편차의 평균 기록을 기록하세요. 흡광도가 분광광도계의 선형 범위를 초과하면 용출 버퍼로 희석 시료를 사용하세요.

3. 주사 전자현미경(SEM)을 이용한 바이오필름 시각화

1. BSL2 생물안전 후드 내부에서는 멸균 겸자를 사용해 12mm 멸균 유리 커버슬립 또는 0.1 μm 멸균 친수성 폴리카보네이트 멤브레인 1장을 각 웰 바닥에 덮어 뚜껑이 있는 멸균 24웰 플레이트에 평평하게 놓습니다. 멤브레인/유리 커버슬립을 30°C에서 2시간 동안 1mL의 멸균 EMJH와 함께 미리 담가둡니다.
2. 불림 용액을 제거하고 희석된 박테리아 현탁액 1.5mL(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ cells/mL)를 각 웰에 추가합니다. 커버슬립이나 멤브레인이 바닥에 단단히 고정되어 있는지 확인하세요.
3. 배양액의 증발을 방지하기 위해 30°C에서 습도 조절 인큐베이터에서 정적 조건에서 배양판을 배양하세요. 성장이 느린 균주의 경우, 성숙하고 부착하는 바이오필름이 형성되도록 3주간의 배양이 권장됩니다
4. 원하는 시점에 바이오필름을 교란하지 않고 각 웰에서 가능한 한 많은 배양지를 조심스럽게 제거하세요.
5. 그 후 각 웰을 1mL 멸균 PBS로 부드럽게 헹구어 잔여 비부착 세포를 제거하고, 커버슬립을 웰 바닥에 평평하게 붙여 연약한 바이오필름 세포가 떨어지지 않도록 합니다. 이러한 조건에서는 바이오필름 성장이 주로 커버슬립의 상부에서 발생하고, 아랫면에서는 거의 성장하지 않으므로, 세척만 해도 표면 부착 세포를 농축하여 후속 분석에 활용할 수 있습니다.
   참고: 이 단계에서 바이오필름은 매우 연약하여 실수로 흡입될 수 있습니다. 피펫팅은 바이오필름을 손상시키지 않도록 우물 벽을 따라 천천히 정밀하게 수행해야 합니다.
6. 4% 파라포름알데히드(PFA)와 1% 글루타알데히드 용액을 나트륨 카코딜레이트 버퍼(0.2 M, pH 7.4)에 직접 웰에 첨가하여 바이오필름을 고정합니다.
7. 37 °C에서 30분간 배양한 후 고정제를 제거하고 커버슬립이나 멤브레인을 PBS로 두 번 세척합니다. 이 방법은 표면에 부착된 바이오필름을 보존하면서 이탈을 최소화할 수 있는데, 이는 대부분의 바이오필름 성장이 우리 조건에서 커버슬립의 상부에서 발생하기 때문입니다.
   참고: 고정 시에는 4% 포름알데히드와 1% 글루타알데히드 용액을 신선하게 준비하여 (16% 메탄올 프리 스톡을 나트륨 카코딜레이트 버퍼에 1:4로 희석) 사용 후 버렸습니다. 이는 중합이 파라포름알데히드로 작용하면 가교 활성이 감소하기 때문입니다.
8. 기판을 1% 오스뮴 테트록사이드(OsO₄)에 PBS로 희석한 상태로 1시간 동안 담가 SEM 대비를 강화합니다. PBS로 두 번 세척하세요.
9. 샘플을 25%, 50%, 70%, 90%, 100%(v/v) 등 등급별 에탄올 시리즈에 순차적으로 담가 탈수하여 각각 10분간 담가합니다.
10. 헥사메틸디실라잔 500 μL을 추가하고 5분간 배양한 후 신선한 HMDS로 교체하고 추가로 5분간 배양합니다. 과도한 HMDS를 제거하고 샘플을 연기 후드 아래에서 완전히 자연 건조시킵니다.
    참고: 글루타알데히드, PFA, 카코딜레이트 나트륨, 사산화 오스뮴, 헥사메틸디실라잔은 독성이 있으므로 적절한 개인 보호 장비와 함께 화학 연기 후드 아래에서 다루어야 합니다.
11. 건조된 샘플을 SEM 스텁에 양면 전도성 탄소 테이프로 부착하세요. 샘플에 얇은 층(~10 nm) 금이나 백금을 스퍼터코팅하여 SEM 이미징에 충분한 전자 대비를 제공합니다. 이를 통해 추가 염료나 염색 없이도 세포 간 접촉, 세포외 기질 형태, 밀도, 이질성 등 바이오필름 구조를 고해상도로 시각화할 수 있습니다.
12. 적절한 샘플 홀더를 사용해 스텁을 SEM에 적재하세요. 가능하면 하룻밤 동안 챔버를 비워 영상 품질을 개선한 후, 5 - 15 kV의 2차 전자 이미지를 획득하고 적절한 배율로 바이오필름 초구조를 드러내세요(그림 2).

4. 성장하는 바이오필름의 타임랩스 위상 대비 영상

1. 작동 중인 접종량 500 μL(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ cells/mL; 섹션 1 참조)를 무균 35mm 유리 바닥 Hi-Q4 접시에 삽입하며, 이 접시에는 평행 뚜껑이 장착되어 반월상 변형을 제거합니다. 거품을 넣지 않고 즉시 접시를 닫으세요.
   참고: 35mm 유리 하단 Hi-Q4 접시는 4개의 뚜렷한 배양 영역을 포함하고 있어 4가지 다른 상태를 동시에 촬영할 수 있습니다. 한 구획은 무균 EMJH 배지에 음성 대조군으로, 나머지 3구획은 기술적 복제 또는 다른 균주/돌연변이체용으로 할당합니다.
2. 위상 차 광학 장치, 모터 포커스 드라이브(Biostation IMQ), 30°C, 95% 상대습도로 설정된 가습 인클로저가 장착된 역현미경의 환경 스테이지에 접시를 배치합니다. 이러한 조건들은 장기간 영상 촬영(최대 8일) 동안 증발을 최소화하는 데 도움을 줍니다.
3. BioStation IMQ 애플리케이션을 실행한 후 메인 인터페이스에서 새 타임랩스 설정 창을 열어 설정 패널에 접근하세요. 실험을 시작하기 전에 상태 디스플레이의 환경 매개변수를 점검하여 챔버와 수온 표시기가 안정적인지 확인하여 획득 중 프레임 드리프트를 방지하세요.
4. 새로운 타임랩스 설정 화면에서 라이브 탭을 선택한 후, 관측 조건 패널에서 위 상 대비(Ph) 를 필터로 선택하고 배율 을 20배로 설정하여 영상 파라미터를 설정하세요.
5. 수동 모드에서 빛의 세기와 노출 시간을 조정하여 채도를 피하면서 대비를 최적화하세요. 채도 확인 버튼을 사용해 확인해 보세요. 네 구획의 중심에 대응하는 네 개의 획득 지점을 정의합니다.
6. 조그 다이얼을 사용하거나 라이브 관측 이미지 디스플레이 내에서 직접 클릭하여 각 구획 위에 스테이지를 순차적으로 배치하세요.
7. 초점을 조절하는 데 초점을 맞추고, 타임랩스 실험 지점 등록 버튼을 클릭하여 각 위치를 기록하세요. 등록된 포인트는 관측점 검증 디스플레이에서 번호가 매겨진 파란색 프레임으로 나타나며, 포인트 탭에서 확인됩니다.
8. 획득 일정을 프로그래밍하려면 타임 탭을 열고 새로 시작을 클릭하여 타임랩스 대화상자에 들어가세요. 여기서 획득 주기는 30분, 총 시간은 7일로 설정되어 있습니다.
9. 적용 버튼을 클릭하면 소프트웨어가 자동으로 획득 라운드 수를 계산합니다. 타이틀 바를 우클릭하고 환경설정을 선택한 후 AF 모드를 활성화하면 각 스테이지 위치에서 자동으로 초점이 다시 맞춰집니다. 모든 지점에서 노출 설정, 게인, 빛 세기의 일관성을 확인한 후, 저장 버튼을 사용해 전체 구성을 저장하세요.
10. 타임 랩스 시작을 클릭하여 획득을 시작하세요. 소프트웨어는 자동으로 타임랩스 이미지로 전환하여 7일간의 실험 내내 획득 진행 상황과 챔버 안정성을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 모든 이미지는 소프트웨어가 생성한 실험 폴더 내에 TIFF 형식으로 자동으로 저장됩니다.
11. 이미지 스택을 FIJI로 가져오면서 이미지 시리즈를 처리 및 정량화합니다(그림 3A, B, C).
12. 파일 > 이미지 시퀀스 가져오기를 통해 각 위치에 대응하는 이미지 스택을 열어 프레임이 시간 순서대로 로드되도록 >.
13. 정렬된 스택을 이미지 > 타입 > 8비트 를 사용하여 8비트 그레이스케일로 변환하여 픽셀 강도를 표준화합니다.
14. Image> Adjust > Threshold를 사용하여 박테리아 바이오필름 영역을 분리합니다. 적용을 선택해 모든 프레임에 일관된 임계값 설정을 적용한 후, Process > Binary > Make Binary Binary를 사용해 결과를 바이너리 마스크로 저장하세요.
15. Analyze > Analyze Particles를 사용하여 면적, 백분율 면적, 평균 강도와 같은 매개변수를 기록하여 정량화를 수행합니다.
16. 각 프레임의 결과를 결과 창(파일 > 저장된 > .csv)을 통해 자동으로 스프레드시트로 내보내 운동 분석을 진행하세요. 모든 측정값을 바이오필름이 덮는 필드 면적(표면 커버)의 비율로 표현합니다.

5. 공초점 주사 레이저 현미경(CLSM)을 이용한 바이오필름 시각화

1. 1.5 mL의 작동 접종량(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ 세포/mL; 섹션 1 참조)을 멸균 35mm 유리 바닥 접시에 접종합니다. 가습 상자 안에서 30°C의 인큐베이터 내 정적 배양하여 원하는 발달 단계(최대 21일)에 도달할 때까지 배양합니다.
2. 정해진 시점에 접시 벽을 따라 생체막을 손상시키지 않고 천천히 흡입하세요. 플랑크톤 세포를 제거하기 위해 멸균 PBS 2mL로 한 번 세척하며, 생체막이 떨어지거나 손상되지 않도록 매우 주의하세요.
3. 고정되지 않은 생체필름(고정 전에 수행)과 함께 배양이 필요한 염색액을 준비하세요.
   1. 생/죽음 염색을 위해서는 3 μL SYTO9 녹색 형광 핵산 염색(1.67 mM)과 3 μL 프로필륨 요오화물(18.3 mM)을 10 mL PBS에 첨가하여 염색 용액을 만듭니다. 염색 용액 200 μL을 바이오필름 형성 박테리아에 직접 첨가한 후, 실온에서 어두운 환경에서 30분간 배양한 후 PBS에 한 번 세척합니다.
   2. 생세포 추적자는 고정 전에 세포를 염색하는 데에도 사용할 수 있습니다. 10 μM CFDA/SE 추적자로 30분간 생세포를 배양합니다. 또는 5 μg/mL 농도로 멤브레인을 표지하는 것도 사용할 수 있습니다. PBS에서 한 번 씻어보세요.
4. 바이오필름을 고정하여 4% 파라포름알데히드 용액 2mL를 PBS에 첨가하고 37°C에서 30분간 배양합니다. 고정제를 제거하고 PBS로 두 번 헹구세요.
5. 바이오필름을 덮고 기포를 방지하기 위해 안티페이드 마운팅 매체를 한 방울 넣으세요.
6. 조정 가능한 백색광 레이저(WLL)와 HC PL APO CS2 63×/1.4 NA 오일 침지 대물렌즈가 장착된 역방향 공초점 현미경에서 Z-스택을 획득하세요. CFDA/SE에서는 여기를 488nm로 설정하고, 1 Airy 단위(AU) 핀홀을 사용하여 500-550 nm 사이의 방출을 수집합니다. FM4-64의 경우, 여기를 561 nm로 설정하고 630-700 nm 사이 방출을 감지하며, 역시 1 AU 핀홀을 사용하세요.
7. 전체 바이오필름 두께 전반에 걸쳐 0.5-1.0 μm 간격으로 Z-스택을 획득합니다. 채도(<1% 포화 픽셀)를 피하면서 동적 범위를 극대화하기 위해 레이저 출력과 검출기 이득을 조정하세요.
8. 신호 대 잡음비를 개선하고 샘플 전반에 걸쳐 모든 영상 매개변수(레이저 출력, 검출기 대역폭, 핀홀 크기, 스캔 속도)를 일정하게 유지하기 위해 라인 평균(2-4×)을 사용하세요.
9. 이미지 스택을 12비트 파일로 저장하고 .lif(FIJI, ImageJ)에서 정량 분석을 위해 내보내세요.
   참고: 영상 촬영 전에 현미경 설정(예: 레이저 출력, 검출기 이득, 핀홀 크기)이 동일한 염료로 염색된 대조 샘플을 표준화하는지 확인하세요. 이 보정 단계는 획득 간 변동성을 최소화하고 실험 간 신뢰성 있는 비교를 가능하게 하는 데 필수적입니다.
10. COMSTAT 플러그인(또는 동등한 3D 분석 소프트웨어)이 장착된 FIJI를 사용하여 공초점 이미지 스택을 처리 및 정량화할 수 있습니다¹⁰. 생물량, 평균 및 최대 두께, 표면 커버리, 생사비(또는 기타 미리 정의된 지표)를 측정하세요. 설명 목적을 위한 대표 직교 뷰와 최대 강도 투영법(그림 3D, E).

6. 96웰 미세타이터 분석법에서 바이오필름 형성 중 부착 및 비부착 분획의 시간 분해 정량

1. 작동 접종액 200 μL(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ 셀/mL; 섹션 1 참조)을 96웰 플레이트의 웰에 접종합니다. 30°C에서 정적으로 배양하여 원하는 시점(3일, 5일, 7일, 10일, 12일, 14일, 17일, 21일차)까지 배양합니다.
   참고: 96웰 플레이트를 사용할 때 경계 효과와 증발이 흔하며, 특히 인큐베이터에 습도 조절이 불가능한 경우 더욱 그렇습니다. 이러한 영향을 최소화하기 위해 모든 주변 우물에 200μL의 멸균 증류수를 추가하세요. 또한, 플레이트는 물 저장소가 담긴 가습 박스 안에 배치되어 인큐베이터 내에 배치되어 증발을 더욱 줄이고 우물 전반에 걸쳐 일정한 습도를 유지했습니다.
2. 각 시점에서 세 가지 샘플 유형을 준비하세요:
   1. 완전 현탁 - 바이오필름을 포함한 한 웰의 전체 성분을 여러 차례 부드럽게 피펫팅하여 균질화하여 기포 형성을 방지합니다. 이 비율은 부착되지 않은 렙토스피어와 반부착형 바이오필름 내 박테리아 전체를 나타냅니다. 이 균질화 단계는 이후 흡수도 측정에 방해가 될 수 있는 세포 집합체를 분산시키는 데 도움을 줍니다.
   2. 액상 - 두 번째 웰에서 바이오필름층을 손상시키지 않고 상액 180 μL를 조심스럽게 제거합니다. 빈 우물로 옮기고 신선한 EMJH 매체 20 μL을 추가합니다. 세포 응집체를 분산시키기 위해 부드럽게 위아래로 여러 번 피펫을 움직입니다. 이 분획은 액체상 내에 존재하는 비부착 세포를 나타내며, 여기에는 자유롭게 부유한 렙토스파일과 분리된 바이오필름 집합체가 모두 포함될 수 있습니다.
   3. 바이오필름 - 2.2단계에서 사용한 동일한 우물에서 180 μL 신선 EMJH 매개체를 추가하고 부드럽게 위아래로 여러 번 피펫팅하여 남은 바이오필름을 재현탁합니다. 이 비율은 바이오필름 내 렙토스피어에 해당합니다.
3. 각 웰이 완전히 균질화되었음을 확인한 후, 분광광도계를 사용해 각 현탁의 흡광도를 측정하고, 값을 그래프로 표시하여 대표적인 그래프를 생성합니다(그림 4A).

7. 숙주 감염 중 바이오필름의 기능적 역할 조사

1. 작동 접종액 200 μL(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ 셀/mL; 섹션 1 참조)을 96웰 플레이트의 웰에 접종합니다. 원하는 발달 단계(최대 21일)에 도달할 때까지 30°C에서 정적으로 배양합니다.
2. 접종 농도를 결정하기 위해, 동물 주입이 아닌 성장 모니터링에만 사용되는 특정 '바이오필름 통제' 웰을 지정하세요. 바이오필름이 거시적으로 보이게 되면, 한 컨트롤 웰에서 180 μL의 상정액을 부드럽게 제거하여 바이오필름을 손상시키지 않습니다. 180 μL 신선 EMJH 배지로 교체하고, 기포가 생기지 않도록 바이오필름 응집체를 조심스럽게 재현탁한 후 OD₄₀₅ 를 측정하여 박테리아 농도를 추정합니다.
   참고: 원칙적으로 정량화 전에 웰을 세척하면 비부착 세포를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 하지만 렙토스피라 바이오필름은 96웰 플레이트에서 접착력이 약하기 때문에, 세척 시 바이오필름 물질이 통제되지 않고 손실될 수 있습니다. 이 때문에 재현액 단계는 사전 세척 없이 수행되어 웰 간 재현성과 균일한 박테리아 농도를 보장했습니다.
   바이오필름 통제 우물에는 일반적으로 ~2 x 10⁸ 개의 렙토스피어가 포함되어 있으며, 햄스터 감염 실험의 표준 접종체로 선택되었습니다. 이 농도는 또한 대조군으로 사용되는 플랑크톤 렙토스피어의 목표 수를 정의합니다. 플랑크톤 대조군은 30°C의 흔들림 조건에서 EMJH 배지에서 렙토스피라 를 신선하게 하층배양하여 최대 5일간 준비하는데, 이는 유사한 세포 밀도를 내는 중후기의 성장 단계에 해당합니다.
3. 동물 접종 시에는 별도의 바이오필름 웰(대조 웰이 아님)을 사용하세요. 대부분의 액체상 렙토스피어를 제거하기 위해 웰에서 180 μL의 상청액을 조심스럽게 제거하세요.
4. 구조 손상을 피하기 위해 200 μL 피펫 팁을 사용해 남은 20 μL 바이오필름 집합체를 수집합니다.
   참고: 바이오필름은 매우 약합니다. 수집 전후로 골재가 보이도록 하세요. 반복이 필요할 경우를 대비해 추가 우물을 준비하세요.
5. 골을 300μL 신선한 EMJH 배지로 미리 채워진 주사기로 옮깁니다. 골재가 중력에 의해 가라앉도록 두세요.
6. 21G 바늘을 연결하고 초과 EMJH를 부드럽게 배출하여 최종 부피인 200 μL에 도달합니다. 공기 방울이 남지 않도록 하고, 바이오필름 집합체가 보이도록 하세요.
   참고: 총량이 정산될 때까지 기다리면 거래량 조정 시 손실을 최소화할 수 있습니다. 생 체 내 사용 전에 21G 바늘을 통과한 후에도 응집체가 온전한지 확인하세요(그림 4C, D).
7. 200 μL EMJH 배지에 2개의 10⁸ 렙토스피레 2개를 복막 내 주입합니다.
   참고: 7-8주 된 골든 시리아 햄스터(남녀 모두)를 표준 사육 환경에서 관리하세요. 음성 대조군의 경우, 200 μL EMJH 배양액만 주입하세요(복제당 한 마리의 동물).
8. 동물을 하루 두 번 최대 21일간 임상적으로 렙토스피라증의 징후(털이 헝클어지고, 엎드리며, 자극에 대한 반응 감소)를 관찰하세요. 고통이 관찰되면 즉시 이산화탄소 흡입 으로 안락사시키고, 안락사 시간을 사망 시점으로 기록하세요.
9. 21일째에 생존한 모든 동물을 안락사시키세요.
   참고: 서로 다른 날짜에 배양물을 준비하여 세 번의 독립적인 생물학적 복제를 수행하십시오. 각 복제에는 각 질환당 2마리의 동물과 1마리의 음성 대조군 동물이 포함됩니다.

Results

접종물이 올바르게 준비되면 배양은 3-5일 이내에 중간 로그 단계에 진입하며, OD₄₀₅ 값은 ~ 0.2-0.4 정도이며, 암시야 현미경 하에서 밝고 매우 운동성이 높은 장(세포의 90% 운동성)과 눈에 띄는 뭭≥ 없습니다. 최적이 아닌 준비는 느린 박테리아와 필드 전반의 이질적인 운동성으로 나타납니다; 이러한 배양은 종종 약한 바이오필름을 생성하므로 폐기되어야 합니다. 실제로는 시드 시작 직전에 운동성과 OD를 나란히 확인하는 것이 실패한 러닝을 최소화합니다. 접종 단계에서 이러한 품질 관리 게이트를 구축하는 것이 하위 응용 분야에서 성공을 예측하는 가장 좋은 방법입니다. 방법론은 L. interrogans serovar Manilae L495에 최적화되었으나, 동일한 절차가 Leptospira biflexa Patoc 균주에도 적용되어 종 간 적용 가능성을 입증하였다. L. biflexa 는 일반적으로 L. interrogans에 비해 덜 응집력 있고 얇은 바이오필름을 형성하지만, 적절한 매개변수 조정을 통해 특징적인 발달 순서와 구조적 특징은 여전히 감지됩니다. 따라서 두 종을 모두 포함하는 것은 병원성 및 부생성 렙토스피라 모두에 대한 작업 흐름의 적응성을 강조합니다.

30°C에서 가습 챔버에서 21일간 정적 배양(또는 Leptospira 종에 적합한 기간)을 마친 후, 바이오필름은 유리 커버슬립과 친수성 폴리카보네이트 멤브레인에서 육안으로 보입니다. 성공적인 성장은 2-3주 후 점형 또는 가지, 또는 망상형 발자국이 표면에 부착되는 특징적인 CV 패턴을 만듭니다(그림 2A).

일반적인 관찰에서 야생형 L. interrogans Manilae L495는 3주차까지 표면 커버 ~50%에 도달하는 반면, 저바이오필름 돌연변이체는 약 ~ 20% 정체, 고바이오필름 표현형은 약 ~ 70-80%에 가까워 스크리닝을 위한 실용적인 동적 범위를 설정합니다. 바이오필름 형성의 정도는 렙토스피라 종과 균주에 따라 달라질 수 있으며; 예를 들어, L. biflexa Patoc 균주는 눈에 띄는 바이오필름을 더 빠르게 형성하며, 이전 연구들은 접종 후 120시간경부터 성숙한 바이오필름으로 간주되었습니다³⁵.

결정 바이올렛 염색은 바이오필름 생체량을 정량화하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 잘 발달된 바이오필름에서는 염색이 덮개 또는 막 부위에 국한된 짙은 보라색을 나타내며, 이는 높은 수준의 부착 생체량을 나타냅니다(그림 2A). 염색 및 용해화 단계에서의 시각적 단서는 프로토콜 성공을 나타내는 유용한 지표도 제공합니다. 예를 들어, CV 분포의 불균일하거나 연한 염색은 씨앗 부족, 증발, 또는 초기 바이오필름이 떨어지는 강한 세척 때문일 수 있습니다.

570 nm에서의 흡광도 측정값은 남아 있는 염색의 양과 따라서 상대적인 바이오필름 밀도를 반영합니다(그림 2B). 대표적인 실험에서 최적의 조건에서 배양된 L. interrogans 배양은 복제체 간에 일관되고 재현 가능한 OD₅₇₀ 수치를 보여, 안정적인 바이오필름 형성을 반영합니다. 반면, 매체 교환 시 샘플이 과도하게 피펫팅될 경우 복제 간 큰 변동이 관찰되며, 이는 접착력이 좋지 않거나 부분적인 바이오필름 박리를 나타낸다. 이러한 변동성은 기술적 문제의 신호로 간주되어야 하며, 영향을 받은 샘플은 제외하거나 프로토콜을 신중히 검토해야 합니다. 특히 L. biflexa Patoc은 유사한 조건에서 유리 커버슬립과 다중카보네이트 막에 더 광범위한 바이오필름을 형성하며, 이는 더 높은 CV 흡수 값으로 나타나 이 프로토콜이 Leptospira 종 전반에 걸쳐 적응 가능하고 효과적임을 보여줍니다.

성공적인 SEM 준비는 3일째부터 세포외 기질 침착물을 드러낼 수 있으며, 성숙한 바이오필름에서는 눈에 띄게 편광된 구조가 나타납니다: 다공성 내부 구조를 고정하는 거친 채널링 기저면(종종 > 5 μm 채널 포함)과 스피로헤이트가 밀집된 매트릭스에 얽힌 매끄러운 끝면(그림 2C, D, E, F). 고배율 필드는 종종 가지가 뻗은 세포외 섬유와 가끔씩 버섯 같은 돌출부를 포착합니다; 타임랩스에서 관찰되는 결합 역학에 해당하는 특징들(보충 영상 1). 최적이 아닌 준비에서는 접힌 매트릭스, 충전 상태, 불분명한 셀 윤곽이 관찰될 수 있는데, 이는 보통 불충분한 고정 후처리, 불충분한 전도성 코팅, 또는 건조 불량을 반영합니다. 기저-끝 극성과 광범위한 채널이 명확할 때, SEM 판독값은 두께와 다공성의 공초점 추정치와 매우 일치하여 준비와 영상 촬영 모두의 성공적인 수행을 확인한다.

효과적인 타임랩스 시리즈에서는 고립된 지점들이 24-72시간 이내에 나타나 점차 더 큰 집합체로 응집되어 표면을 가로질러 이동하다가 공간 제한으로 인해 움직임이 느려집니다(그림 3A, B, C). 정량적 세분화는 총 커버 면적이 단조적으로 증가하는 반면, 총합 수는 증가했다가 정점에 달했다가 ~12시간에서 216시간 사이에 충돌과 합병이 지배적으로 일어나면서 감소합니다. 이러한 운동학(면적 증가, 집합체 수는 감소)은 단순한 퇴적이 아니라 활발한 축적을 나타냅니다. 실패하거나 경계선에 있는 런은 초반 펀크타가 부족하거나, 평평한 면적과 시간 경비 곡선을 보이며, 불안정한 온도/습도로 인한 집중 분산이 발생합니다. 95% 습도의 안정된 30°C 환경을 유지하고 각 시점마다 자동 초점을 사용하면 돌연변이나 치료법을 비교할 수 있는 선명한 궤적을 복원할 수 있습니다.

성숙한 바이오필름에서 나온 대표적인 Z-스택은 두께가 50 μm를 넘는 폼 같은 다층 구조를 보이며, 대부분의 세포는 살아있는 염색(SYTO 9-양성)을 보이고, 성장 중 집단 재배열을 나타내는 중앙 빈틈도 가끔 존재한다(그림 3D). 기질 프로브는 기질 조성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다: WGA는 다당류 에피토프를 강조하고, BOBO-3는 풍부한 세포외 DNA를 표지하며, 단백질 선택적 염색은 외부 세포 관련 신호를 거의 기여하지 않습니다(그림 3E). 최적이 아닌 결과로는 프로피듐 요오다이드가 지배하는 얇거나 불연속적인 스택, 강한 광표백, 또는 일관되지 않은 게인 설정이 있어, 각각이 정량적 비교 가능성을 저해합니다. 두께, 생체부피, 생사비를 함께 해석하면(조건상 레이저 출력, 검출기 이득, 핀홀 비율을 일정하게 유지함) 성숙 상태를 확인하고 SEM 초구조 및 CV 생체량과의 직접 비교를 지원합니다.

렙토스피라의 바이오필름 형성 과정은 일반적으로 뚜렷한 단계를 따르지만, 종이나 균주에 따라 정확한 시기와 값은 달라질 수 있습니다. L. interrogans 균주 Manilae L495를 기준으로 하면, 21일간의 예상 진행에는 박테리아가 대부분 플랑크톤성 상태로 유지되고 바이오필름이 최소화된 초기 단계(0-3일)가 포함됩니다(그림 4A). 이후 3일차부터 7일까지의 기하급수적 성장 단계가 이어지며, 이 기간 동안 플랑크톤 박테리아와 바이오필름 관련 박테리아가 약 9 x 10⁸ cells/mL에 도달하고, 바이오필름 집합체가 형성되고 확장됩니다. 7일째에서 12일째 사이에 플랑크톤 박테리아는 크게 감소하고, 바이오필름 관련 세포는 개체군의 약 80%를 차지하며 최고조에 달합니다. 마지막으로, 성숙 단계(12일째-21일)에는 플랑크톤 세포 수가 증가하지 않고 바이오필름 박테리아 수가 감소하지만, 바이오필름 크기와 복잡성은 계속 증가합니다. 이러한 변화의 연속을 관찰하는 것은 프로토콜이 렙토스피라 바이오필름의 역동적인 발달과 성숙을 효과적으로 포착하고 있음을 보여줍니다.

적절히 수행될 경우, 감염 프로토콜은 명확히 정의된 플랑크톤(5일) 또는 바이오필름(21일) 배양에서 추출한 200 μL EMJH에 ~2 x 10⁸ 렙토스피리얼을 포함한 접종체를 사용합니다. 이 두 배양 유형은 서로 다른 생리학적 상태를 나타내지만, 이 차이는 의도된 것으로, 실험은 대사 활동 감소와 구조적 분화가 특징인 렙토스피라 바이오필름이 감염을 시작할 수 있는 능력을 유지하는지 여부를 확인하는 것을 목표로 합니다. 이 대조는 플랑크톤과 바이오필름 간 유전자 발현의 주요 변화를 보여주는 전사체 연구들에 의해 뒷받침^됩니다. 바이오필름 골재는 21G 바늘을 통과한 후에도 구조를 보존하고 주입 전에 확인된 대로 신중하게 수확됩니다(그림 4C, D). 복강 내 주사 후 골든 시리아 햄스터는 보통 3일에서 5일 이내에 렙토스피라증의 임상적 징후(예: 무기력, 털이 헝클어지기, 엎드림)를 보입니다. EMJH 배지를 단독으로 주사한 음성 대조군은 질병 징후를 보이지 않습니다. 임상 징후의 진행 및 심각도, 안락사까지의 시간은 접종 종류에 따라 달라지는데, 플랑크톤성 박테리아는 종종 더 일찍 급성 증상을 유발하는 반면, 바이오필름 유래 집합체는 지연되지만 지속적인 감염을 일으킬 수 있다(그림 4B). 하루 두 번 최대 21일간 모니터링하면 질병의 전체 경과를 포착할 수 있습니다.

그림 2. 결정 바이올렛 염색, 정량화 및 렙토스피라 바이오필름의 초구조적 영상. (A) 다양한 기판에서 성장한 바이오필름의 크리스탈 바이올렛(CV) 염색. CV 염색은 다양한 종과 기판의 바이오필름 구조와 초기 부착 패턴을 시각화할 수 있게 해줍니다. i. 폴리카보네이트 필터 위의 L. interrogans; ii. 폴리카보네이트 필터 위의 L. biflexa; iii. 유리 커버 슬립에 있는 L. interrogans; iv. 유리 덮개 슬립에 있는 L. biflexa. (B) L. interrogans와 L. biflexa에 대해 CV 흡수력(OD570 nm)으로 시간에 따라 정량적 바이오필름 형성 사례를 평가합니다. 이 운동학 판독은 초기 접착과 바이오매스 축적 역학을 모두 포착하며, 병원성 종과 부생성 종 간 바이오필름 성장의 차이를 강조합니다. 이 수치는²⁷명에서 수정되었습니다. (C-E) L. interrogans 바이오필름의 주사 전자현미경(SEM): (c) 초기 미세 군락 형성과 초기 세포외 기질 침착을 보여주는 3일 된 바이오필름; (d) 14일 된 생물막으로 광범위한 매트릭스 구조와 3차원 조직을 가진 성숙한 구조를 보여줌; (e-f) 3주 된 바이오필름은 장기간 배양에 걸친 구조적 고정과 매트릭스 성숙을 보여줍니다. CV 염색, 정량적 외측 측정, SEM 이미징의 결합은 초기 부착부터 성숙한 초구조 조직에 이르기까지 바이오필름 발생에 대한 포괄적인 개요를 제공하여 종 및 배양 기간 간 직접 비교를 가능하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3. 렙토스피라 바이오필름 형성의 시각화. BioStation으로 획득한 위상 대비 이미지는 (A) 48시간, (B) 96시간, (C) 144시간의 바이오필름 형성을 보여줍니다. (D) 3D 시각화를 위한 직교 단면으로 전체 생체 부피를 표시하는 Leptospira 바이오필름의 CLSM 재구성. (E) 성숙한 바이오필름의 공초점 염색(DAPI, 녹색)과 WGA(빨간색)로 박테리아 세포와 세포외 기질 구성 요소를 강조합니다. 이 수치는³⁷명에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4. 플랑크톤 및 바이오필름 분획의 시간 분해 정량 및 렙토스피라 바이오필름의 기능 평가. (A) 405nm 흡수로 측정된 바이오필름 형성의 동역학. 각 시점마다 전체 우물, 바이오필름 분획, 플랑크톤성 렙토스피어가 포함된 상청액에서 측정하여 부착 박테리아와 자유 유영 박테리아를 구분할 수 있었습니다. (B) 바이오필름 집합체, 플랑크톤성 렙토스피어, 또는 EMJH 대조군을 주입한 햄스터의 생존 곡선 예시. 바이오필름 주입된 동물은 병원성이 낮아 일부는 21일 생존하는 반면, 플랑크톤성 렙토스피르는 빠른 사망을 일으킵니다. (C-D) 바이오필름 무결성의 예비 검증: 주입 전(C) 주사 전에는 집합체가 보이고, 21G 주사기(D, 흰색 화살표)를 통과한 후에도 온전함을 유지하여 취급 중 바이오필름 구조가 보존됨을 확인한다. 이 수치는³⁶명에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

이 프로토콜은 렙토스피라 바이오필름 연구를 위한 모듈식 통합 워크플로우를 제시하며, 정량적 바이오매스(결정 바이올^렛)9,27, 역학(타임랩스 위상 대비), 3차원 조성(표적 프로브를 이용한 공초점 레이저 주사 현미경)³⁸, 초구조(주사 전자현미경), 기능 평가(햄스터 감염)를 통합합니다. 모듈 간 동일한 배양 시리즈를 사용하면 배치 효과를 최소화하고 실험 내 교차 검증이 가능해져, 특히 성장이 느리고 취약한 나선에 중요합니다. 각 모듈은 서로 보완합니다: CV는 "얼마나 많은지"를, 타임랩스는 "얼마나 빠른지"를, CLSM은 "내부에 무엇이 있는지"를, SEM은 "어떻게 만들어졌는지"를 해결하고, 생체 내 테스트는 "기능 증명"을 제공합니다. L. biflexa의 포함은 종 간 적응력을 보여주며, 더 빠르고 밀도 높은 바이오필름 형성과 방법론적 유연성을 강조합니다.

각 모듈의 성공은 접종 품질과 생리적 상태에 달려 있습니다. 중간 로그 플랑크톤 배양(3-5일)은 매우 이동성이 높고 집합체가 없으며, 재현성 있는 접착과 바이오필름 형성을 제공합니다. 견고한 바이오필름 형성과 재현성을 보장하기 위해서는 저통통 분리주만 사용해야 합니다.

CV 분석법은 속도, 확장성, 처리량 ^9,27로 워크플로우를 고정합니다. 돌연변이체, 배지 또는 항바이오필름 화합물의 신속한 스크리닝을 가능하게 합니다. 하지만 렙토스피라 바이오필름은 연약하고 이질적이기 때문에 부드러운 조작과 복제 검증이 필수적입니다. CV는 콤팩트한 구조와 다공성 구조를 구분하거나 매트릭스 조성을 감지할 수 없기 때문에, 더 심층적인 구조 분석을 위한 스크리닝 게이트 역할을 합니다.

타임랩스 영상은 실시간으로 바이오필름 운동학을 드러내어 그 간극을 메웁니다. 이 방법은 운동성 집합체의 출현, 응집, 정지 과정을 포착하여 종말 분석법이 놓치는 일시적 현상을 드러냅니다. 환경적 안정성(온도, 습도, 자동 초점)이 매우 중요합니다. 이 기록들은 CV 생체량이 안정적으로 보일 때조차도 동적 현상이 분화될 수 있음을 보여주었는데, 이는 더 깊은 층에서 구조적 재배열이나 생존 가능성 상실을 시사합니다.

CLSM은 탈수 인공물 없이 체적·화학적 통찰을 제공합니다³⁹. 생사/사망 염색은 바이오필름 내 세포 생존 구배를 드러내며, 이는 산소 확산 제한과 대사 층화 보고와 일치합니다 ^6,40. 렉틴과 핵산 염료는 풍부한 세포외 DNA와 특정 당당 모티프를 노출시켜 기질 성분의 정량화와 특성 분석이 가능하다^41,42. CLSM 데이터는 종종 내부 공허를 드러내며, 타임랩스³⁸에서 관찰된 집단적 재배열과 연관된다. 그럼에도 불구하고 프로브 특이성, 광표백, 회절 제한 축 해상도 등이 제한됩니다; 따라서 현미경 설정과 염료 성능은 실험 간 신뢰성 있고 비교 가능한 결과를 보장하기 위해 표준화되고 사전에 테스트되어야 합니다.

SEM은 보완적인 초구조 해상도⁴³을 제공합니다. 초기 단계에서는 초기 집합체를 분리합니다; 성숙(15-21일≈)에는 분극화된 구조를 보인다: 고정과 교환을 위한 거칠고 채널화된 기저층과 매끄러운 첨단 매트릭스 풍부한 표면³⁷. 신중한 고정, HMDS 건조, 공초점 데이터와의 상관관계는 탈수나 붕괴로 인한 인공물을 완화^합니다.

이 네 모듈이 함께 작용하면 내부 교차 검증이 가능해집니다: CV, CLSM, SEM이 수렴할 때 결론은 견고합니다; 이들이 갈라질 때, 그 불일치 자체가 유익합니다 — 예를 들어, 생체량은 증가했지만 생존 가능성은 감소하거나, 기질 조성은 변했음에도 생체량은 변하지 않았음을 보여줍니다.

몇 가지 내재적 한계가 남아 있습니다. 렙토스피라 바이오필름은 이질적이고 섬세하여 다루거나 탈수에 민감합니다. CV는 총 생체량을 통합하지만 생존 가능성은 통합하지 않습니다^. CLSM은 광학 한계³⁸을 초과할 수 없습니다; SEM은 준비 인공물을 위험에 빠뜨릴 수 있습니다. 산소 구배⁶로 인해 깊은 지층에서의 사망률이 예상되지만, 이 편향은 체계적이며 조건에 따라 유사합니다. 바이오필름 성숙은 약 15-21일에 정체에 도달하며, 이는 영양소 제한의 전사 신호와 연관되어 있습니다³⁶. 이후 단계들은 여전히 불완전한 특성화를 유지하고 있습니다.

생체 내 분석은 기능적 맥락을 제공합니다. 복막 내 응집체를 주입하면 바이오필름 유래 세포가 플랑크톤 세포와 병원성 또는 지속성 차이가 있는지 검사합니다. 복막 내 접종은 자연스러운 경로는 아니지만, 통제된 비교 모델³⁶을 제공합니다. 집계 이질성은 약간의 변동성을 초래하지만, 일관된 취급과 일치된 이백신 크기가 이를 완화합니다. 중요한 점은, 바이오필름 지속성 특성(예: ECM 매개 스트레스 내성)이 반드시 급성 병원성 증가로 이어지지 않는다는 점이며, 이는 바이오필름 형성의 생태학적 역할을 병원성이 아닌 생태학적 역할을 강조한다는 것이다²⁴.

모듈식 설계는 확장 가능한 사용을 가능하게 합니다. 빠른 심사를 위해서는 이력서와 타임랩스만으로도 충분합니다. 기계론적 통찰을 위해 CLSM과 SEM은 조성 및 구조적 해상도를 추가합니다. 모듈은 효소 또는 화학적 교란(DNase, 글리코시다아제), 글리칸 또는 핵산에 대한 대체 프로브, 또는 유동 반응을 테스트하는 마이크로유체 시스템을 통합할 수 있습니다. 동일한 접종구는 전사체 또는 단백질체 분석을 제공함으로써 바이오필름 표현형을 조절(예: c-di-GMP 신호, 기아 반응)과 직접 연결시킬 수 있습니다. 이 프레임워크는 돌연변이 선별, 환경 교란 검사, 항바이오필름 또는 항병원성 화합물 평가도 포함합니다.

이 통합 워크플로우는 고립된 관측 결과를 렙토스피라 바이오필름에 대한 일관된 다차원적 이해로 전환합니다. 처리량(CV), 동역학(타임랩스), 화학 및 깊이(CLSM), 초구조(SEM)를 결합함으로써, 이 접근법은 렙토스피라 군집의 이동성, 다공성, 편광성 특성을 정확하게 포착합니다. 이전 연구^{들 17, 35, 36}을 확장하여, 조정되고 모듈화된 실험이 단일 방법론 연구에서는 보이지 않는 현상—예를 들어 생존 가능성은 감소했음에도 생체량은 증가하거나, 종 간 동역학이 발달하는 현상—을 드러낸다. 궁극적으로 이 접근법은 종, 돌연변이, 상태 간에 비교적이고 재현 가능하며 기능적으로 적합한 분석을 지원하여, 기전적 미생물학, 생태학적 회복력, 그리고 안티바이오필름 전략 설계의 기초를 제공합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 & 마이크로; 무균 친수성 폴리카보네이트 막	IT4ip	1000M25/861N101/13
12mm 멸균 유리 커버슬립	SPL	330164
16% 파라포름알데히드 (PFA)와 nbsp;	써모 사이언티픽	28908
21G 바늘	BD 메디컬	304432
24웰 마이크로플레이트	NUNC	143982
35mm 유리 바닥 접시	이비디	81218-200
35mm 유리 바닥 Hi-Q4 접시	이비디	81156
96웰 마이크로플레이트	네스트	701001
안티페이드 마운팅 매체	바이오라드	29410
카본 코터	라이카 마이크로시스템	에미 ACE600
CFDA/SE 추적기	바이오레전드	423801
전도성 카본 접착제	전자현미경 과학	77816
크리스탈 바이올렛 (CV)	시그마	C3886
암시야 현미경	라이카 마이크로시스템	11888846	라이카 DM4000 B, 다크 필 콘덴서 장착 (cat n° 11505142)
에탄올	VWR 케미컬스	83813.36
FM4-64	인비트로젠	T3166
빙하 아세트산	수펠코	1.00063
글루타알데히드 용액	시그마-올드리치	G5882
헥사메틸디실라잔	아크로스 오가닉스	120581000
인큐베이터	멤머트	IN30
역방향 공초점 현미경	라이카 마이크로시스템	라이카 DMI6000 TCS SP8 X	공초점 현미경 SP8
위상 대비 광학 장치가 장착된 역현미경	니콘	셀-S2	바이오스테이션 IM-Q
렙토스피라 중간 기저 EMJH	벡턴 디킨슨	BD  279410	렙토스피라용 EMJH 배지
오스뮴 테트로사이드 (OsO4)와 nbsp;	시그마	BCCG9181
프로피디움 아이오다이드	바이오티움	40017
주사 전자현미경	제올	JSM-IT300
카코딜산 나트륨 버퍼 & nbsp;	열보 사이언티브 케미컬스	15453149
분광광도계 Varioskan Lux	써모 사이언티픽	VLBL00GD0
멸균 인산염 완충 식염수	바이오솔브(Biosolve)	0016232301BS
주사기 (1 mL)	치라나	CH03002L
SYTO9 녹색 형광 핵산 염색	인비트로젠	S34854