방법 논문

광학 광자 재배치가 포함된 회전 디스크 공초점 디스크에 대한 DNA-PAINT를 통한 전세포 초해상도 영상

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DOI:

10.3791/69531

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2026년 1월 6일

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1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 광학 광자 재할당이 가능한 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 심층 전세포 단일 분자 위치 현미경(SMLM)을 수행하는 절차를 설명하여, 맞춤형 광학 장치나 복잡한 조명 없이 DNA-PAINT 이미징을 가능하게 합니다.

초록

단일 분자 위치 현미경(SMLM)은 세포 구조의 나노 규모 이미징을 가능하게 하지만, 전반사 내반 형광(TIRF)과 고경사 및 광 시트(HILO) 조명의 한계로 인해 일반적으로 커버슬립 근처의 이미징에 제한됩니다. 여기서는 광학 광자 재할당(SDC-OPR)이 장착된 회전 디스크 공초점 현미경을 활용해 전체 세포에서 SMLM(스핀 디스크 원반 전환 및 초점 현미경)을 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 DNA 포인트 축적을 이용해 나노스케일 지형(DNA-PAINT) 영상을 위한 고품질 단일 분자 영상을 맞춤형 광학 장비나 복잡한 조명 체계 없이도 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 회전 디스크 현미경(예: CSU-W1 SoRA)을 SMLM 이미징을 위한 구성 방법과 딥 이미징에 최적화된 획득 파라미터를 단계별로 안내합니다. DNA 결합 프로브로 세포내 표적을 표지하여 DNA-PAINT 이미징을 수행하는 샘플 준비 단계와 여러 표적의 다색 이미징 전략을 설명합니다. 이미지 획득 후에는 표준 소프트웨어 패키지를 이용한 단일 분자 위치 추적과 재구성이 이어집니다. 배경 최소화, 측면 해상도 최적화, 전 셀 깊이 전반에 걸친 영상 품질 보장에 관한 중요한 고려사항도 논의됩니다. 이 접근 가능한 프로토콜은 연구자들이 표준 공초점 장비를 사용하여 심층 전세포 SMLM 검사를 수행할 수 있게 하여, 단일 분자 영상으로 해결할 수 있는 생물학적 질문의 범위를 막 근근부를 넘어 확장합니다.

서론

단일 분자 위치 현미경(SMLM)1은 개별 형광체의 방출을 시간적으로 분리하여 고정밀도로 국소화함으로써 나노 규모 해상도를 달성하는 초고해상도 기법의 계열입니다. 성공적인 SMLM은 단일 분자 사건을 감지하기 위해 높은 신호 대 잡음비(SNR)를 요구하며, 이는 전통적으로 강렬하고 국소적인 여기를 제공하는 광학 장치에만 제한되어 왔습니다. 가장 일반적인 구성은 전반사 형광(TIRF)2 현미경과 고경사 적층 광학 시트(HILO) 조명3입니다. TIRF는 커버슬립에서 몇 나노미터 이내의 형광체를 선택적으로 여기시키는 에바네시트 필드를 만들어 초점 어긋난 조명을 억제하여 배경 형광을 줄입니다. 그러나 이러한 제한 때문에 TIRF는 세포외 영역으로 확장되는 소기관과 같은 더 깊은 생물학적 구조를 촬영하는 데 적합하지 않습니다. HILO 현미경은 더 깊은 관통 깊이를 제공하여 유리 기판 위 수백 나노미터 높이까지 영상을 촬영할 수 있게 합니다. 이는 시야각(FOV)4가 줄어들고, 평면이 점점 높아질수록 조명이 불균형해지는 대가를 치러야 하며, 이는 더 큰 세포 구조에 적용하기 어려운 결과를 낳습니다. 최근에는 격자 라이트시트 5,6,7과 단일 대물 단일 평면 조명 현미경(soSPIM)8과 같은 라이트시트 현미경(LSM) 기법이 SMLM을 체적과 조직 규모 영상으로 확장하였습니다. 여기 빔을 얇고 구조화된 광 시트로 성형함으로써, LSM은 배경 및 광독성이 낮은 광학 단면화를 달성합니다. SoSPIM은 단일 노출에서 검출 축에 직교하는 초점면을 포착하여 거의 등방성 해상도의 빠른 체적 영상을 가능하게 합니다. soSPIM 응용은 전체 세포 및 소형 소기관(깊이>20 μm)에서 40 nm 등방성 해상도와 최소한의 초점 어긋난 배경 9로 3D SMLM을 입증했습니다. 이러한 방법들은 장점에도 불구하고, 일반적으로 투명 시료, 특수 광학, 복잡한 정렬을 필요로 하며, 두꺼운 시료에서는 광학 수차와 산란에 민감합니다.

공초점 현미경은 검출기 앞에 핀홀을 설치하고 빔 스캐닝 거울을 결합하여 초점이 맞지 않은 빛을 차단하는 대안을제공합니다. 이 광학 단면 기능은 높은 SNR을 가진 딥 체적 영상을 가능하게 합니다. 특히, 회전 디스크 공초점(SDC) 현미경은 기존 영상의 속도와 광시야 검출과 포인트 스캐닝 시스템의 단면 능력을 결합합니다. 이는 기존 SDC에서 평행한 핀홀로 패턴이 있는 회전 디스크를 도입하여 달성되며, 종종 정렬된 마이크로렌즈 배열과 결합됩니다. 마이크로렌즈는 방출된 형광의 상당 부분을 수집하여 핀홀을 통해 초점을 맞추어 배경 신호를 줄입니다. 이 구성은 특수 광학 장비나 추가 샘플 마운팅 준비 없이도 빠른 광학 단면화를 가능하게 하여, 딥 부피 SMLM 이미지 획득11에 쉽게 구현하고 최적화할 수 있는 견고한 선택입니다.

본 연구에서는 광학 광자 재할당(SDC-OPR)이 장착된 CSU-W1 회전 디스크 공초점 스캐너 유닛을 사용한다. 표준 SDC와 달리, SDC-OPR은 방출된 광자를 보완적인 핀홀 패턴12에 투사하는 두 번째 마이크로렌즈 배열을 도입하여 산란을 줄이고 그렇지 않으면 버려질 광자를 회수합니다. 이 광자 재배치는 점 확산 함수(PSF)를 효과적으로 선명하게 하여 기존 SDC보다 측면 해상도를 향상시키면서도 초점이 맞지 않는 빛13을 배제합니다. 구체적으로, SDC-OPR 마이크로렌즈 배열은 축 외 광자를 가장 가까운 원점으로 재배치하여 표준 SDC에 비해 검출되는 형광 밝기를 효과적으로 증가시킵니다. 더 나아가, SDC-OPR의 해상도 이점은 이미지 디컨볼루션 을 통해 증폭될 수 있습니다. 반복적 디컨볼루션 알고리즘은 광학 구성을 변경하지 않고도 PSF를 계산적으로 정제하고, 배경 신호 대 신호 비율을 개선합니다. 이 결합된 접근법은 단일 분자 국소화 실험에서 표준 SDC보다 위치 정밀도 측면에서 상당한 이점을 제공합니다14.

여기서는 광학 광자 재할당(SDC-OPR)이 장착된 회전 디스크 공초점 현미경을 이용한 단일 분자 위치 현미경을 위한 견고하고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 DNA-PAINT의 나노 정밀도와 회전 디스크 이미징의 속도, FOV, 깊이 관통력을 결합합니다. DNA-PAINT는 나노스케일 지형학(PAINT)15 이미징을 위한 점 축적의 변형으로, 형광 표지된 '이미저' 가닥과 분자 표적에 고정된 상보적인 '도킹' 가닥의 일시적 혼성에 의존합니다. 이러한 가역적 결합 이벤트는 확률적 형광 신호를 생성하여 정밀하게 국소화할 수 있어 세포 초구조의 고해상도 재구성을 가능하게 합니다. DNA-PAINT는 고광안정성 형광포자 사용을 가능하게 하며, 영상 조건의 정밀한 제어를 위한 결합 동역학을 조절하고, 형광 이미저 가닥의 지속적인 보충을 통해 광표백을 완화합니다.

재현성과 특이성을 보장하기 위해 이 접근법은 도킹 가닥을 2차 항체와 연결하는 맞춤형 DNA-항체 결합체에 의존합니다. 항체-DNA 접합을 포함한 상세한 샘플 준비 단계가 강력한 실험 결과를 지원하기 위해 제시됩니다. 프로토콜은 핵 공복합체(NPCs) 와 고정 시료 내 미세소관 등 잘 특성화된 세포 구조에서 검증되어 재구성 정확도 추정에 참고점을 제공합니다. 해상도의 변동은 위치 정밀도를 대 리로 정량화하며, FOV와 영상 깊이에 따라 추가 평가됩니다.

또한, 이 다중화 영상 워크플로우의 효율성은 Exchange-PAINT18을 통해 입증되는데, 이 전략은 동일한 염료와 단일 레이저 소스를 기반으로 한 여러 표적을 순차적으로 시각화할 수 있게 합니다. Exchange-PAINT 워크플로우는 동일한 샘플 내 미토콘드리아, 미세소관, NPC의 다색 초해상도 영상에 적용됩니다.

이 프로토콜은 항체-DNA 결합, 샘플 준비, 영상 조건 및 데이터 분석에 관한 포괄적인 지침과 주요 적응성 노트를 제공하여 연구자들이 SDC-OPR에서 재현 가능한 DNA-PAINT 이미징을 수행할 수 있도록 합니다. TIRF 기반 접근법의 깊이 및 시야각(FOV) 한계를 넘어 고해상도 영상을 확장함으로써, 이 방법은 SMLM의 적용 가능성을 다양한 생물학적 맥락에 확장시켰습니다.

프로토콜

시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 완충제 준비

  1. 세포골격 완충기(CB) 준비:
    1. 10 mM MES(pH 6.1)를 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5 mM D-포도당, 5 mM MgCl2 를 1x 여과된 인산염 완충액(PBS)에 준비합니다.
    2. 4°C에서 보관하고 사용 전에 필터를 사용하세요.
  2. 40배 프로토카테추산(PCA) 육즙 준비:
    1. 154mg의 PCA를 10mL의 증류수, 정수된 물에 녹입니다.
    2. NaOH로 pH를 9.0으로 조절하세요.
    3. 알리코트를 만들어 -20°C에서 최대 6개월간 보관하세요.
      참고: 갈색으로 보이는 어떤 이별이 있으면 산화를 나타내므로 버리세요.
  3. 100배 프로토카테쿠아테-3,4-디옥시게나제(PCD) 육가공 제제:
    1. 50% 글리세롤 용액을 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 100 mM Tris 완충액으로 준비합니다.
    2. 2.2mg의 PCD를 3.4mL의 글리세롤 용액에 녹입니다.
    3. 분할 보관하여 최대 6개월 동안 -20°C에서 보관하세요.
  4. 100배 트롤록스 육수 준비:
    1. 50 mg 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산)를 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용해 화학 연기 후드 내에서 녹색할 때까지 녹여 녹여 있습니다.
    2. 증류되고 여과된 물 1.6mL를 추가하세요. 용액이 흰색으로 변하고 굳어지기 시작할 때까지 기다립니다.
    3. 175 μL 1M NaOH 1M을 추가합니다. 용액이 다시 액체로 변하기 시작할 때까지 기다려 두세요.
    4. 10 μL 용량에서는 용액이 완전히 정화될 때까지 1 M NaOH를 계속 첨가합니다(약 40 μL).
    5. 분할 보관하여 최대 6개월 동안 -20°C에서 보관하세요. 최종 용액은 노란빛을 띤다.
      참고: 최종 100배 용액의 pH는 11이지만, 1배로 희석하면 pH가 7-8이 됩니다.
  5. 버퍼 C+
    1. 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 0.02% 트윈-20 용액을 1x PBS에 준비합니다.
    2. 필요에 따라 HCl 및/또는 NaOH를 사용해 pH를 7.4로 조절하세요.
    3. 선택적 Trolox 보충제: PCA(40x), PCD(100x), Trollox(100x) 스톡을 필요한 양으로 추가하여 1배 희석을 만들고, 사용 전에 상온(23°C)에서 1시간 동안 용액을 평형으로 둡니다.
      참고: 매주 신선한 음식을 준비하세요. 트롤록스를 사용할 경우, 혼합 후 4시간 이내에 사용하세요.
  6. 면역염색 완충제(파라포름알데히드 PFA, 글리신, 트리톤):
    1. 10 mL 16% PFA 앰플에서 4% PFA 제제를 만들 경우:
      1. 화학 연기 후드 안에서 앰플을 조심스럽게 따세요.
      2. 16% PFA 10 mL를 50 mL 원뿔형 원심 튜브에 디캔트합니다.
      3. 1x PBS에 1:4 희석하여 4% PFA를 얻고, 디캔트된 16% PFA에 1x 필터링된 PBS를 ~30mL 정도 조심스럽게 첨가하여 최종 부피는 ~40 mL가 됩니다.
      4. 1 mL 마이크로 원심분리관에 분리하여 -20 °C에서 보관합니다.
    2. PBS 제제에서 60 mM 글리신을 투여하면:
      1. 50mL 원뿔형 원심관에 225mg의 글리신을 무게를 젬습니다.
      2. 1x 여과된 PBS 50mL를 추가하세요.
      3. 완전히 섞일 때까지 보텍스를 하고 필터링하세요.
      4. 필요할 때까지 4°C에서 보관하세요.
    3. 0.1% Triton X-100 제제액:
      1. 먼저, 100% Triton X-100 1mL를 1x 여과된 PBS 9mL에 희석하여 10% Triton X-100 작업 스톡을 준비하고(최종 부피 = 10 mL), 피펫으로 천천히 혼합하여 과도한 기포를 방지합니다. 필요할 때까지 4°C에서 보관하세요.
      2. 10% 작동 스톡에서 10% Triton X-100 0.1mL를 1x 필터링된 PBS 9.9mL에 넣어 0.1% 최종 스톡을 만들고, 다시 천천히 섞습니다. 필요할 때까지 4°C에서 보관하세요.

2. 항체-DNA 접합

  1. 100 kDa 초간여과 원심 여과 유닛을 사용해 항체를 농축합니다:
    1. 100 kDa 초여과 원심 필터 유닛을 100 μL 1x 여과된 PBS 100 μL, 14,000 g 4 °C에서 30분간 세척합니다.
    2. 100 μL 항체와 200 μL 1x 여과된 PBS를 이전에 세척한 100 kDa 초여과 원심 필터 유닛에 첨가하고, 14,000 x g, 4°C에서 30분간 회전시킵니다. 울트라여과 원심 필터로 농도를 측정한 후 항체 농도가 1.5 mg/mL 이상인지 확인하세요. 이 방법으로 초여과 원심 필터는 보통 항체를 ~3배 농축합니다.
    3. 100 kDa 초여과 원심 필터 유닛을 깨끗한 튜브로 뒤집고, 1000 x g, 4 °C에서 6분간 돌립니다. 이것이 PBS에 포함된 농축된 항체입니다.
    4. 농축된 항체의 부피(1 또는 2 μL)를 측정하여 새로운 농도를 계산하고, 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계로 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 실행합니다. 배경을 1x PBS로 설정하고 스펙트럼을 저장하세요.
  2. 티올화된 DNA 도킹 가닥을 줄이세요:
    1. 7.7mg의 미리 무게를 정한 DTT를 100μL의 여과수에 녹인 후 신선한 튜브로 옮깁니다.
    2. 원래 DTT 튜브에 1x PBS에 3 mM EDTA 100 μL 첨가, 소용돌이 및 2.2.1 단계와 동일한 튜브로 옮기면, 1.5 mM EDTA 1x PBS 튜브에 200 μL 250 mM DTT 200 μL가 생성됩니다.
    3. 티올화된 DNA 도킹 가닥을 1x 여과된 PBS에 용해하여 최종 농도는 1 mM으로 만듭니다. DNA 도킹 가닥 용액의 UV-Vis 스펙트럼(1x PBS에 10 μM으로 희석)을 기록한 후 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계를 사용해 저장합니다.
    4. 티올화 DNA 13 μL(1 mM)과 DTT 30 μL(250 mM)를 혼합하여 실온(23 °C)에서 2시간 동안 흔듭니다.
      참고: 남은 미사용 DNA 도킹 가닥은 -20°C의 13 μL 알리코트 용량에 보관하여 향후 반응을 대하세요.
  3. 가교체에 대한 항체 접합:
    1. 말레이마이드-PEG2-석시니미딜 에스터 가교결합자를 DMSO에 10 mg/mL(23.5 mM)로 용해합니다. 필요할 때까지 -20 °C에서 10 μL 알리쿼트에 보관하세요.
    2. 2.1단계에서 농축된 항체와 20배 몰 과잉 가교제를 혼합합니다. 4°C에서 90분간 진동하며 배양합니다.
  4. 크기 배제 수지(7 kDa 분자량 컷오프)를 포함한 7.0 KDa 스핀 탈염 컬럼으로 항체 가교 결합체 필터링을 정제합니다:
    1. 7.0 kDa 스핀 탈염 컬럼의 하단 닫힘부를 제거하고 캡을 느슨하게 만드세요. 단백질 결합이 낮은 미세원심분리관에 넣으세요. 1500 x g, 4 °C에서 1분간 원심분리기.
      참고: 첫 번째 회전 후 레진의 기울기를 표시하세요. 이후 컬럼을 사용할 때는 경사된 부분을 원심분리기 바로 바깥쪽을 향하게 하세요. 샘플과 워시를 중앙에 발라주고 레진 베드와의 접촉을 피하세요.
    2. 7.0 kDa 스핀 탈염 컬럼 필터에 1x 여과된 PBS 300 μL 첨가, 캡을 풀고 1500 x g, 4 °C에서 1분간 원심분리합니다. 두 번 더 반복하세요.
      참고: 항체-가교관 반응이 준비될 때까지 7.0 KDa 스핀 탈염 컬럼을 1x PBS 300 μL 상태로 두세요; 기둥이 마르지 않도록 하세요.
    3. 마지막 300μL PBS 세척액을 1500 x g, 4 °C에서 1분간 원심분리하여 제거합니다.
    4. 항체 가교 용액을 수지 베드 중앙에 드롭 방향으로 바릅니다. 7.0 kDa 스핀 탈염 컬럼을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고, 1500 x g, 4 °C에서 2분간 원심분리합니다. 항체 가교 생성물이 현재 마이크로 원심분리기 튜브에 들어갔습니다; 4°C에서 보관하거나 얼음에 보관하세요.
  5. 세파덱스 G-25(DNA 정제용 크기 배제 수지)로 스핀 컬럼을 탈염하여 DNA-DTT 혼합물을 정제합니다:
    1. DNA 정제(DNA 정제)를 소용돌이로 하여 수지가 고르게 분포되도록 합니다. 바닥 닫힘 부분을 제거하고 뚜껑을 느슨하게 한 뒤, 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 넣으세요.
    2. 원심분리기로 스핀 컬럼을 735 x g 에서 1분간 탈염(DNA 정제)하여 저장 완충제를 제거합니다.
    3. 탈염 스핀 컬럼(DNA 정제)을 신선한 마이크로 원심분리관에 넣고 DNA/DTT 혼합물을 천천히 수지 중앙에 첨가합니다. 원심분리기는 735 x g 에서 2분간 돌립니다. 정제되고 환원된 DNA는 이제 마이크로 원심분리기 튜브에 들어갑니다.
  6. DNA와 항체 가교 결합 제제:
    1. 환원된 DNA를 항체 가교 생성물에 10배 몰 초과 DNA와 항체를 첨가합니다. 정제 직후 정제된 DNA를 항체 가축 생성물과 혼합하세요. 이로 인해 DNA가 재결합하는 것을 막습니다.
    2. 4°C에서 하룻밤 동안 진동하며 배양하세요.
      참고: 늦은 오후에 DNA와 항체를 혼합하고 다음 날 아침 즉시 정제하세요. DNA와 항체의 장기간 배큐는 높은 DNA:항체 비율을 초래할 수 있습니다.
  7. 다음 날 아침 100 kDa 초여과 원심 필터 유닛으로 과잉 DNA를 제거합니다:
    1. 100 kDa 초여과 원심 필터 유닛을 1x 여과된 PBS 300 μL 용액으로 14,000 g 4 °C에서 30분간 세척합니다.
    2. 100 kDa 초여과 원심 필터 유닛에 300 μL 1x 필터링된 PBS와 함께 DNA-항체 혼합물을 넣고 14,000 g 4 °C에서 30분간 회전시킵니다.
    3. 초여과 원심 필터 유닛을 깨끗한 튜브에 뒤집어 1000 x g, 4 °C에서 6분간 돌립니다. 이것이 PBS에 포함된 농축 제품입니다.
    4. 제품을 1x 여과된 PBS에 100 μL로 희석합니다.
    5. 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계를 사용해 1x PBS 배경으로 제품의 UV-Vis 스펙트럼(1 또는 2 μL)을 기록하고 스펙트럼을 저장합니다.
    6. 스펙트럼에서 최종 농도와 DNA:항체 비율을 측정하세요. 항체의 흡수 피크가 280nm에서 260nm로 이동하는 것을 관찰하는데, 이는 DNA에서 얻은 추가 흡수력으로 인해 나타납니다. 2.8단계를 사용해 농도와 DNA:항체 비율을 결정하세요.
    7. 제품을 사용한 항체의 원래 보관 조건에 보관하세요. 냉동 중이라면 동결-해동 사이클을 피하세요.
  8. UV-VIS 스펙트럼에서 DNA:항체 비율을 계산하세요:
    1. 순수 DNA 스펙트럼(1x PBS 10 μM)에서 260 nm(방정식 1)와 280 nm방정식 2()에서 흡광도 값을 측정합니다. 이들을 DNA 농도(10 μM)로 나누어 DNA의 몰 흡수 계수를 구합니다(방정식 3 와 방정식 4).
    2. 항체 방정식 5 식은 6가 스펙트럼에 사용되는 항체 농도로 나누는 것을 기억하고 이 과정을 반복합니다.
    3. 제품 스펙트럼에서 260 nm와 280 nm에서의 흡수는 DNA와 항체의 흡수 양쪽에 따라 달라집니다:
      방정식 7
      방정식 8
      여기서 cDNA와 cAb는 각각 최종 생성물 내 DNA와 항체의 농도를 나타냅니다. 이 방정식들을 동시에 풀어 제품 내 DNA와 항체의 몰 농도를 구합니다. 이 농도를 이용해 DNA와 항체 비율을 계산하세요.
      참고: 첫 번째 스펙트럼에 대한 항체 농도는 100 kDa 초간여과 원심 여과 유닛으로 여과 후 남은 항체 부피를 측정하고, 이를 알려진 농도를 가진 원래 항체 부피와 비교하여 계산할 수 있습니다.

3. 세포 배양

  1. 헬라 교토 mEGFP-Nup107 세포.
    1. 세포 배양 배지인 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 보충하여 4°C에서 보관합니다. 사용 30분 전에 37°C 물에 담근 여지를 미리 데워주세요. 작업 환경에 따라 오염을 방지하기 위해 필요한 양을 분리하고 여과하는 것이 권장됩니다.
    2. 2 x 105 세포/mL 크기의 씨앗 세포를 7 mL의 예열된 보충 DMEM 배지에 T25 플라스크에 넣었습니다. 세포 플라스크를 적절한 인큐베이터에 37°C, 5%CO2 환경에 넣으세요.
    3. 과밀을 방지하기 위해 48-72시간마다 한 번씩 통과를 보장하세요.
      1. 합류 배양 및 흡입 배지를 담은 T25 플라스크를 가져와.
      2. 피펫에 1mL의 트립신 EDTA(TE)를 넣고, 플라스크를 부드럽게 기울여 완전히 덮이도록 합니다. 플라스크에서 세포가 분리될 수 있도록 37°C에서 7분간 배양하세요.
      3. 보충된 DMEM 배지 2mL를 추가하고 분쇄합니다.
      4. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 원심관에 옮기고, 추가로 7mL의 DMEM 배지를 추가로 투여합니다.
      5. 원심분리기를 400 x g 에서 5분간 돌립니다. 튜브 바닥에 펠릿이 형성되었는지 조심스럽게 확인하되, 튜브를 건드리지 마세요.
      6. 배지를 흡입하고 세포 펠릿을 보충된 DMEM 배지에 재현탁합니다.
      7. 7mL의 예열된 배지를 담은 새로운 T25 플라스크에 2 x 105 cells /mL를 씨앗 채웁니다. 37°C, 5%CO2에서 배양합니다.
        참고: 세포 밀도가 확실하지 않을 경우, 혈구계를 사용해 세포 수를 측정할 수 있습니다. 세기 전에 1 mL 펠릿 재현탁액부터 시작하는 것이 권장됩니다.
  2. U2OS CRISPR mEGFP-Nup96 세포
    1. 3.1.1단계에 따라 10% FBS와 1% P/S 보조 매체를 준비합니다.
    2. 2 x 105 cells/mL 크기의 씨앗 세포를 T25 플라스크에 7 mL 보조된 McCoy's 5A 배지에 분포합니다. 37°C, 5%CO2에서 배양합니다.
    3. 문화 성장 합류 80% 이하로 유지하려면 48시간마다 통과:
      1. 플라스크에서 배지를 흡입한 후 부착된 배양물을 2mL의 여과된 사전 예열(37 °C) 1x PBS로 부드럽게 세척합니다.
      2. PBS를 흡입하고 Accutase 2mL를 추가한 뒤, 플라스크를 천천히 기울여 완전히 덮을 수 있도록 한 후 37°C에서 7분간 배양합니다.
      3. 보충된 맥코이스 5A 배지 2mL를 추가하고 분쇄합니다.
      4. 세포 현탁액에 7mL의 배지를 추가한 후 원심분리를 위해 15mL 또는 50mL 원뿔형 원심관으로 옮깁니다. 400 x g 에서 원심분리기를 5분간 하고 튜브 바닥에 펠릿이 형성되는지 확인하세요.
      5. 세포 펠릿을 보충된 맥코이의 5A 배지에 재현탁했습니다.
      6. 2 x 105 cells/mL 크기의 씨앗을 새 T25 플라스크에 7 mL 미리 예열한 배지와 함께 시드를 넣습니다. 37°C, 5%CO2에서 배양합니다.
        참고: 세포에 첨가된 모든 용액은 물 또는 구슬 욕조에서 37 °C로 가열하십시오. Accutase의 경우, 분해를 방지하기 위해 2mL 알리코트만 5분 이상 데워야 합니다.

4. Nup96, 미토콘드리아 및 미세소관의 면역염색

  1. U2OS mEGFP-Nup96 세포 준비
    1. 3.2단계에서 설명한 단계에 따라 T25 플라스크에서 배지를 흡입한 후, 부착된 세포를 1x 여과된 PBS 2mL로 부드럽게 세척합니다.
    2. PBS를 흡입하고 Accutase 2mL를 추가한 뒤, 플라스크를 천천히 위아래로 기울인 후 37°C에서 7분간 인큐베이팅하여 세포 박리를 촉진합니다.
    3. 보충된 맥코이스 5A 배지 2mL를 추가하고 분쇄합니다.
    4. 보충된 맥코이스 5A 배지로 7mL 세포 현탁액을 넣고, 15 mL 또는 50 mL 원뿔형 원심관으로 옮긴 후 400 x g 에서 5분간 원심분리합니다. 다시 한 번, 튜브 바닥에 펠릿이 형성되어 있는지 확인하세요.
    5. 세포 펠릿을 보충된 맥코이의 5A 배지에 재현탁했습니다.
    6. 씨앗 세포를 1 x 105 cells/mL 크기의 8웰 마이크로슬라이드에 넣어 세포 인큐베이터(37 °C, 5%CO2)에서 하룻밤 배양합니다.
      참고: 씨앗 세포는 고정 및 면역 염색 절차 24시간 전에 부착하여 부착을 가능하게 합니다.
  2. Nup96 영상을 위한 U2OS mEGFP-Nup96 세포 면역염색
    1. 하룻밤 인큐베이션 후에는 8웰 마이크로슬라이드의 McCoy's 5A 매체를 1x 필터링된 PBS로 교체하세요. PBS를 빠르게 흡입한 후 미리 가열된 37°C 4% PFA 고정액을 화학 훈기 후드에 추가하세요.
    2. 셀을 상온(23 °C)에서 30분간 고정한 후 PFA를 세척하고 폐기물을 버리세요. 모든 단계는 별도의 언급이 없는 한 실온에서 수행할 수 있습니다.
    3. 4% PFA 고정액을 제거하고 슬라이드를 3분간 1x PBS로 세척하세요.
      주의: 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 훈기 후드에서 PFA를 사용하세요.
    4. 고정 후에는 1x PBS 용액에 0.1% Triton X-100을 첨가하여 세포막을 투과시킵니다. 5분간 두었다가 3분간 60 mM 글리신을 1x PBS에 넣어 3분간 세척해 잔여 PFA의 자가형광을 제거합니다.
      참고: 트리톤 투과화 용액은 매우 시간에 민감하며, 너무 오래 방치하면 세포 구조의 무결성을 변화시킬 수 있습니다.
    5. 1시간 동안 어둠 속에서 1x PBS에 5% BSA를 첨가하여 면역 염색 전에 세포를 차단하세요.
    6. 비특이적 결합 차단을 방지하기 위해 차단액 내 DNA 접합 항GFP 나노바디 20 nM(5% BSA in 1x PBS)을 준비합니다. 슬라이드를 나노바디 혼합물과 함께 실온(23 °C)에서 1시간 배양한 후, 분리된 DNA 가닥을 1x 필터링된 PBS로 3분간 3분간 세척합니다.
      참고: 일시정지: 고정, 차단, 항체 첨가 후 샘플은 4°C에서 하룻밤 보관할 수 있습니다. 이 일시정지는 프로토콜의 엄격한 필수 조건보다는 샘플 준비에 필요한 시간 때문에 주로 포함된다. 원한다면 이 단계들 직후 영상 검사를 진행할 수 있습니다.
  3. 미토콘드리아 및 미세소관 영상을 위한 U2OS mEGFP-Nup96 세포의 면역염색
    1. 하룻밤 배큐 후, 8웰 마이크로슬라이드의 DMEM 매체를 세포골격 완충제(CB)에 0.3% 글루타알데히드와 0.25% 트라이톤 X-100 200 μL 혼합물로 교체한 후 2분간 전고정 상태로 둡니다.
    2. 프리고정액을 2% 글루타알데히드를 보완한 세포골격 완충제(CB)로 대체합니다. 세포를 고정하기 위해 10분간 두고, 4.2.4 단계에 따라 60 mM 글리신을 PBS에 넣어 3분간 슬라이드를 세척합니다.
      주의: 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 연기 후드에 글루타알데히드를 사용할 수 있습니다.
    3. 3% BSA에 연어 정자 DNA를 1x PBS에 1시간 동안 어둠 속에서 첨가하여 면역 염색 전에 세포를 차단합니다.
    4. 미세소관 영상을 위해 위에서 설명한 결합 DNA 접합 항튜불린 5 μg/mL를, 미소관 영상을 위해 1:200 TOM20 항체를 2% BSA에 실온(23 °C)에서 2시간 첨가합니다. 3분에 걸쳐 1x PBS로 3분씩 세척하세요.
    5. DNA 결합 sdAb 항토끼 IgG 25 nM을 추가하고 실온(23 °C)에서 1시간 배양합니다. 3분에 걸쳐 1x PBS로 3분씩 세척하세요.
      참고: 일시정지: 고정, 차단, 항체 첨가 후 샘플은 4°C에서 하룻밤 보관할 수 있습니다. 이 일시정지는 프로토콜의 엄격한 필수 조건보다는 샘플 준비에 필요한 시간 때문에 주로 포함된다. 원한다면 이 단계들 직후 영상 검사를 진행할 수 있습니다.
  4. HeLa Kyoto mEGFP-NUP107 세포 제조
    1. HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 세포의 T25 플라스크에서 배지를 흡입한 후, 1x 여과된 PBS 2mL로 부드럽게 세척합니다.
    2. PBS를 흡입하고 2mL의 트립신 EDTA(TE)를 추가한 후 플라스크를 천천히 위아래로 기울인 후 37°C에서 7분간 배양합니다.
    3. 보충된 DMEM 배지 2mL를 추가하고 분쇄합니다.
    4. 세포 용액을 15mL 원뿔형 원심관에 추가하고, 추가로 7mL의 DMEM 배지를 넣고 400 x g 에서 5분간 원심분리합니다. 튜브 바닥에 펠릿이 형성되어 있는지 확인하세요.
    5. 세포 펠릿을 보충된 DMEM 배지에 재현탁합니다.
    6. 씨앗 세포는 1 x 105 cells/ mL 크기의 8웰 마이크로슬라이드에 배치되어 있습니다.
      참고: 씨앗 세포는 영상 촬영 24시간 전부터 검사해야 합니다.
  5. 미세소관을 위한 HeLa Kyoto mEGFP-NUP107의 면역염색
    1. 하룻밤 배큐 후, 8웰 마이크로슬라이드의 DMEM 매체를 세포골격 완충제(CB)에 0.3% 글루타알데히드와 0.25% 트라이톤 X-100 200 μL 혼합물로 교체한 후 2분간 전고정 상태로 둡니다.
    2. 전접착액을 CB에 2% 글루타알데히드로 교체하고 10분간 세포 고정을 위해 둡니다. 60 mM 글리신을 1x PBS에 넣어 3분간 3분씩 세척하세요.
      주의: 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 훈기 후드에 글루타알데히드를 사용하세요.
    3. 1시간 동안 어둠 속에서 1x PBS에 5% BSA를 첨가하여 면역 염색 전에 세포를 차단하세요.
    4. 5 μg/mL의 DNA 접합 항튜불린(위에서 설명한 접합 상태)을 추가하여 5% BSA 및 1x PBS 및 1x PBS 미세소관 영상을 실온(23 °C)에서 2시간 촬영합니다. 3분에 걸쳐 1x PBS로 3분씩 세척하세요.
      참고: 일시정지: 고정, 차단, 항체 첨가 후 샘플은 4°C에서 하룻밤 보관할 수 있습니다. 이 일시정지는 프로토콜의 엄격한 필수 조건보다는 샘플 준비에 필요한 시간 때문에 주로 포함된다. 원한다면 이 단계들 직후 영상 검사를 진행할 수 있습니다.
    5. 참고: 대체 항체나 세포주를 사용할 때는 제조사 권고에 따라 DNA 결합 항체나 나노바디의 희석 인자를 조정하세요.
  6. 영상 준비
    참고: 이 단계는 모든 면역염색 프로토콜에 공통적으로 적용됩니다.
    1. 각 우물에 탈이온수에 1:2 희석된 90nm 금 나노입자를 전체 부피를 사용해 직접 첨가합니다. 영상 촬영 중 향후 드리프트 교정을 위해 5분간 인큐베이팅하세요. 1x PBS로 3번 세척하세요.
    2. Nup96 이미징의 경우, C+ 버퍼에 1 nM 크기의 원하는 이미저 가닥을 추가하고, 1x Trolox, 1x PCA, 1x PCD를 보완합니다.
    3. 미토콘드리아 및/또는 미세소관의 교환-페인트를 위해, C+ 버퍼에 1 nM 간격의 첫 번째 원하는 이미저 가닥을 추가하세요. 첫 번째 이미징 후, 샘플을 철저하지만 조심스럽게 세척하여 샘플을 움직이지 않고 잔류 이미저 가닥을 모두 제거하세요. 보통 5번 세탁하고 30초 정도 기다리면 충분합니다. 그 다음 두 번째 이미징 라운드를 위해 C+ 버퍼에 1 nM 간격의 두 번째 이미저 스트랜드를 추가합니다.

5. 영상 설정 및 매개변수: 단일 분자 위치 현미경

참고: 이 프로토콜에서 표시된 이미지는 영국 유니버시티 칼리지 런던의 LMCB 초해상도 현미경 시설에서 상업적으로 판매되는 회전 디스크 공초점 현미경과 sCMOS 카메라를 사용해 NIS-Elements 소프트웨어를 통해 획득한 것입니다.

  1. 다초점 여기와 sCMOS 카메라가 있는 회전 디스크 공초점 시스템을 사용하세요.
  2. 영상 촬영 30분 전에 시스템을 시작하세요: 현미경, 카메라, 레이저를 켜고 컴퓨터를 켭니다. NIS-Elements 소프트웨어가 완전히 로드될 때까지 기다리세요.
  3. NIS-Elements에서 적절한 영상 모드를 선택하세요: 표준 회전 디스크 공초점 또는 SDC-OPR 초해상도 후, 획득 매개변수를 설정하세요.
  4. SDC 또는 SDC-OPR 이미징을 위해 60× Apo NA 1.49 오일 침수 대물렌즈를 선택하여 단일 분자 사건의 검출을 극대화하여 후처리 성능을 향상시키십시오.
  5. 대물렌즈, 카메라 설정, 연구할 샘플에 따라 적절한 배율(1×, 2.8×, 또는 4×)을 선택하세요. 카메라 빈 조정을 하세요: 1× 빈닝은 1× 배율, 2× 빈닝은 2.8×, 4× 빈닝은 4×. 이 구성에서 이는 1×(비닝 없음)에서 108 nm, 4×(4× 비닝), 2.8×(2× 비닝)의 유효 픽셀 크기에 해당합니다. 비닝은 SMLM에 적합한 픽셀 크기를 얻기 위해 필요하며, 이는 PSF 표준 편차(일반적으로 100-150 nm)와 대략 일치합니다19,20.
    참고: 더 높은 배율(2.8× 또는 4×)은 레이저 출력 밀도를 증가시켜 조명 균일성을 향상시킵니다. 이로 인해 FOV가 줄어들기 때문에, 픽셀 크기를 유지하기 위해 비례적으로 조정해야 합니다(예: 2× 비닝은 2.8× 배율; 4× 빈은 4× 배율).
  6. DNA-PAINT 획득 노출 시간을 설정하고, 회전하는 디스크 회전 속도(CSU-W1 패드에서 조절 가능)와 동기화하세요. 회전 속도가 노출 시간의 배수인지 확인하거나, 동기화 버튼을 누르면 가장 가까운 호환 rpm이 자동으로 맞춰집니다. 화면에서 스트라이프 아티팩트가 있는지 확인하세요. 이는 동기화되지 않은 설정임을 의미합니다. 여기서 제시된 실험들은 300ms 노출 시간을 사용했습니다.
    참고: SDC 유닛의 회전 속도는 빔 여기 프로파일에 영향을 주어 조명 영역 내 평균 전력 밀도 분포에 영향을 미칩니다. 이 때문에 TIRF 설치보다 더 긴 노출 시간이 필요할 수 있습니다.
  7. 레이저 파장, 파워, 필터 휠을 설정하세요(NIS-Elements가 적절한 필터를 제안합니다). 레이저 파장은 이미저 염료의 스펙트럼에 의해 결정됩니다.
    참고: 이 연구에서는 561nm 레이저로 최적의 여기 반응을 얻는 Cy3B가 사용되었습니다. Cy3B는 DNA-PAINT에서 신호 대 배경 비율이 가장 우수하여 이 응용 분야에 선호되는 선택입니다.
  8. 레이저 패드 를 통해 레이저 출력을 0%-100% 조정하세요. DNA-PAINT 이미징의 경우, 레이저를 최대 출력(100%)으로 설정하세요. 이 시스템의 경우, 대물렌즈 후 4× 배율에서 측정된 1.75 mW(≈ 65 W/cm2), 2× 경우 3 mW(≈ 50 W/cm2), 1× 경우 5 mW(≈ 15 W/cm2)에 해당합니다.
    1. 대물렌즈 후 파워를 기록하려면 보정된 레이저 파워미터를 사용하고, 센서를 샘플 평면에 최대한 가까운 현미경 스테이지에 배치하세요. 대물렌즈와 접촉하지 않도록 주의하세요. 각 구성의 전력을 기록하세요.
  9. 깨끗한 60× Apo NA 1.49 오일 대물렌즈에 침수 오일 한 방울을 바르세요.
  10. 준비된 샘플(4.2-4.5단계)을 스테이지 어댑터를 사용해 스테이지에 고정하세요. 이는 이미지 획득 중 드리프트를 최소화하고, 특히 다색 실험에서 버퍼 교환 시 이동을 방지하는 데 중요합니다.
  11. 선택한 영상 방법 내에서 밝은 영역 모드로 전환하고 나노입자를 기준으로 유리면에 초점을 맞추세요. 퍼펙트 포커스 시스템(PFS)을 활성화하세요. PFS 또는 유사한 시스템은 획득 시간 내내 초점을 유지하기 위해 매우 중요합니다. 왜냐하면 축 방향의 드리프트는 후처리로는 보정할 수 없기 때문입니다.
    참고: 니콘 PFS는 오프셋 렌즈와 라인-CCD 검출기를 사용해 고정된 기준면과 시료 초점면 사이의 거리를 지속적으로 모니터링하고 조정하여 시료를 선명한 초점 상태를 유지합니다. 이미지 획득과 독립적으로 작동함으로써 시스템은 초점 드리프트를 실시간으로 보정합니다(~밀리초).
  12. PFS가 활성화된 상태에서 관심 있는 영상 평면을 선택하세요. U2OS mEGFP-Nup96 세포 또는 HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 세포의 경우, GFP 표지된 NPC의 488 GFP 신호를 이용해 가장 평탄한 세포를 식별하고 최적의 초점면을 결정합니다. 이 단계에서는 광표백을 방지하기 위해 최대 레이저 출력의 ~10%를 낮게 사용하세요.
  13. 실험의 이름과 저장 경로를 정의하세요. 시간 박스를 체크하여 간격, 시간, 루프 수를 설정하세요. 연속 획득의 경우, 간격을 No Delay 로 설정하고 루프 수만 입력하는데, 이는 전체 프레임 수에 해당합니다.
    참고: 하단의 PFS 박스가 선택되었는지 확인한 후 실행(Run)을 누르세요. 소프트웨어는 자동으로 예상 실험 시간을 제공하며, 완료 시 데이터를 저장합니다. 실험을 끝내기 전에 중단하려면 현재 진행 상황을 저장하려면 Finish를 누르거나, 저장 없이 실험을 종료하려면 Abort를 누르세요.
  14. 첫 번째 단백질은 300ms 통합 시간에 17,000-20,000 프레임을 획득합니다.
    참고: 이 단계에서 이미저 가닥의 농도를 최적화하여 단일 분자 신호가 겹치지 않도록 하면서도 재구성을 위한 충분한 위치 측정을 제공합니다. 이 과정은 전형적인 SMLM 획득과 유사하며, 재구성에 충분한 이벤트 수를 맞추고 중복을 최소화하기 위해 이미저 농도를 조정합니다. 최적의 농도는 촬영하는 구조물에 따라 달라집니다. 예를 들어, 미세소관과 같은 고도로 표지된 구조는 일반적으로 더 낮은 이미저 농도(1 nM 미만)를 요구합니다.
  15. 다음 단백질의 영상 버퍼를 피펫으로 조심스럽게 제거하되, 샘플을 방해하지 않도록 주의하세요. 현미경 카메라로 샘플을 모니터링할 때, 이미저 없이 C+ 버퍼 200 μL를 조심스럽게 추가하여 첫 염료를 세척합니다.
  16. 이 과정을 첫 번째 DNA 영상기 용액에서 나오는 형광 신호가 감지되지 않을 때까지 반복합니다(보통 5번의 세척).
  17. 두 번째 이미저 용액을 추가하고 단일 분자 사건이 다시 감지되는지 확인한다.
  18. 두 번째 단백질은 300ms 통합 시간에 17,000-20,000 프레임을 획득합니다.
  19. 각 추가 단백질에 대해 5.14-5.18 단계를 반복합니다.
  20. 3D 영상 촬영을 위해서는 셀 높이 전체에 0.5-1 μm 간격의 z-스택을 획득하세요. 이는 획득 소프트웨어(NIS 요소)를 위해 설계된 특정 JOB 프로토콜21 을 사용하여 특정 z 위치에서 미리 정의된 프레임 수를 촬영하여 획득 시간 내내 PSF를 유지합니다.
    참고: 소프트웨어 패키지와 상세한 사용자 지침은 JOB 프로토콜21 내에 제공됩니다. 직무에 대한 전체 설명도 포함되어 있습니다. "MultiZ_DNAPaint.bin"라는 이름의 이 소프트웨어는 출판물의 자료 탭에서 다운로드할 수 있습니다. JOB을 실행하려면 이 파일을 다운로드하여 제공된 단계별 지침을 따라 NIS-Elements JOBS 탐색기에 가져오세요.

6. 이미지 처리 및 분석

참고: 이미지는 처음에 호환 소프트웨어를 사용한 디컨볼루션으로 처리되었고, 이후 융만 연구실16에서 개발한 피카소 소프트웨어를 이용한 단일 분자 위치 분석을 거쳤습니다.

  1. NIS-Elements AR 소프트웨어에서 ND2 이미지 스택 을 엽니다.
  2. 2D 이미지의 경우 2D 디컨볼루션을 선택하세요. 3D 이미지의 경우, 각 개별 z-스택에 대해 이 과정을 반복합니다.
  3. 블라인드 디컨볼루션(유효 핀홀 0.01)을 선택하고 노이즈 레벨을 노이즈(Noisy)로 설정하세요. 그 다음, 레이저 여기와 방출율을 입력하는데, 각각 560 nm와 571 nm입니다. 다른 매개변수들은 ND2 메타데이터에서 자동으로 얻어져 소스 이미지 점 확산 함수(PSF)의 대략적인 추정값을 제공합니다.
  4. 반복 횟수를 지정하고(여기서는 12회), Create New Document를 선택한 후 Deconvolve를 누르세요. 처리 후 생성된 파일을 저장하세요.
    참고: 이 알고리즘은 PSF를 수렴하거나 지정된 반복 횟수에 도달할 때까지 컨볼루션 연산을 수행하여 이미지 품질을 반복적으로 향상시킵니다. 디컨볼루션된 이미지를 육안으로 확인하는 것이 권장됩니다. 계산 제약과 이미지 품질에 따라 반복 횟수를 조정해야 합니다.
  5. 디컨볼루트된 이미지 스택을 Picasso Localize 모듈에 로드하세요.
  6. 메뉴 바에서 →'파라미터 분석'을 선택하고, 제조사 사양에 따라 카메라별 파라미터를 입력하세요. 이 연구에 사용된 sCMOS 카메라(하마마츠 ORCA-퓨전 BT)의 경우: EM 이득: 1, 기준: 100, 감도: 0.23 (변환 계수, 전자/계수), 양자 효율: 0.95 (사용된 여기 파장 다름).
    참고: Quantum Efficiency는 Picasso 버전 0.6.0 이후로 사용되지 않으며, 하위 호환성을 위해 유지됩니다.
  7. 박스 옆 길이를 7로 설정하세요. 박스 길이는 [6 × σPSF + 1]의 공식으로 결정되며, 여기서 σPSF 는 PSF의 표준편차입니다. 이 최적화는 위치 정밀성을 높여 재구성 이미지의 해상도를 향상시킵니다.
  8. 5.5절 단계에 따라 영상 구성에 맞는 적절한 픽셀 크기를 선택합니다.
  9. 다음으로, 적절한 최소 순 그라디언트(예: 샘플에 따라 ~1000)를 선택하고 미리보기를 활성화하여 감지된 위치 정보를 시각화하세요. 결과를 검사하고 배경 탐지를 최소화하고 정확한 위치 파악을 위해 필요에 따라 기울기 임계값을 조정하세요.
  10. 메뉴 바에서 ' 분석 → 로컬라이즈(식별 및 적합)'를 선택하여 모든 영화 프레임에서 스팟 식별과 적합을 시작합니다. 경쟁 후 이 과정은 자동으로 .hdf5와 .yaml 파일을 저장합니다.
    참고: .hdf5 파일은 각 가우시안 적합의 위치 및 기타 매개변수를 저장합니다. .yaml 파일은 영상과 분석 절차에 관한 정보를 저장하며, 텍스트 편집기를 통해 확인할 수 있습니다.
  11. Picasso Render 모듈에서 .hdf5 파일을 불러와서 재구성된 로컬라이제이션 맵을 시각화하고 드리프트 보정을 수행하세요.
  12. Picasso Render에서 RCC의 후처리→ Undrift 를 선택하세요. 1000부터 시작하는 세분화 값을 입력하세요. 완료 시 계산된 xy 드리프트 플롯이 나타납니다. 이 과정을 더 낮은 분절값(예: 500, 250)으로 순차적으로 반복하며, 시간적 이동이 점진적으로 개선되는 것을 관찰합니다.
    참고: 드리프트 보정은 나노입자를 기준 표지기로 사용해 수행할 수도 있습니다; 하지만 고상면을 촬영할 때는 나노입자 신호가 보이지 않을 수 있습니다. 이 경우 중복 교차상관(RCC) 드리프트 보정만 적용됩니다.
  13. 피카소 렌더 창을 닫기 전에 ' 파일 → 현지화 저장 '을 선택하고 드리프트 수정된 파일을 반드시 저장하세요.
  14. 6.13단계에서 드리프트 보정된 파일을 Picasso 필터 모듈에 불러와, 단일 분자 국소화 품질 지표에 임계값을 적용하여 추가 후처리 단계를 수행합니다. (i) 위치 정밀 (lpx, lpy); (ii) PSF 폭 (sx, sy); (iii) 광자 수; 그리고 (iv) 노이즈, 이상치, 또는 미완성 지점을 제거하는 추가 기준.
    참고: lpx와 lpy(x와 y에서의 위치 정밀도)는 x축과 y축을 따라 국소화된 스팟 위치의 불확실성을 추정하며, 크라메르-라오 하한(CRLB)을 기반으로 계산됩니다.
  15. 한 속성을 필터링하려면 테이블 헤더에서 해당 열을 선택한 후 메뉴에서 ' 히스토그램 → 플롯 '을 선택하세요.
    참고: 두 열을 선택하면 2D 히스토그램을 그립니다.
  16. 특정 속성 범위로 필터링하려면 1D 또는 2D 히스토그램 내에서 원하는 영역을 클릭하고 드래그하세요. 선택한 지역은 초록색으로 음영 처리되며, 이 범위를 벗어난 현지화 이벤트는 즉시 현지화 목록에서 제외됩니다.
  17. 광자, sx, sy, lpx, lpy로 데이터를 필터링하며, 각 매개변수 분포의 중심 부분 범위만 유지하여 가장 신뢰할 수 있는 국소화를 유지합니다.
    참고: PSF 폭 분포의 중앙 부분은 일반적으로 0.4에서 1.2 × 픽셀 사이입니다. 중복 신호나 잘 해명되지 않은 지점으로 인해 발생하는 2차 분포는 제외합니다.
  18. 필터링된 데이터를 저장하려면 메뉴에서 파일 → 저장 을 선택하세요.
  19. 각 이미저 솔루션에서 촬영한 모든 영상에 대해 6.1-6.18 단계의 과정을 반복합니다.
  20. Picasso Render 모듈에서 필터링된 파일을 열어보세요. 이 초해상도 이미지의 강도는 국소화 횟수를 나타냅니다. 대비는 ' 보기 → 디스플레이 설정 '을 선택하고 최대 밀도 값을 변경하여 변경할 수 있습니다.
  21. 단일 채널의 초해상도 이미지를 저장하려면 블러 섹션에서 "개별 위치 정밀도"를 선택하세요. 스케일 바 섹션에서 스케일 바를 추가할 수도 있습니다.
  22. 모든 채널의 초해상도 이미지를 저장하려면 처리된 모든 .hdf5 파일을 열어보세요. 각 채널의 색상은 메뉴에서 ' 파일 보기' 를 선택→ 변경할 수 있습니다.
  23. 모든 채널을 정렬하고 후처리를 선택하세요 → 채널을 정렬하세요.
  24. .png 이미지를 저장하려면 파일 → 완전 이미지 내보내 기를, 특정 확대 기능을 위해 현재 뷰 내보내기→ 선택하세요.
    참고: 재현성을 위해 일관된 파일 명칭과 문서 작성 방식을 사용하세요. 피카소 소프트웨어는 저장한 각 파일에 자동으로 접미사를 추가합니다. Cramer Rao 하한선 및 최근접 이웃 기반 분석(NeNA)22 지표는 메뉴에서 '보기 → 정보 보기'를 선택하여 추출할 수 있습니다. NeNA는 인접한 국소화 간 유클리드 거리를 평가하여 국소화된 형광체의 공간적 분포를 정량화합니다. CRLB가 광자 통계와 배경 잡음을 기반으로 한 이론적 하한을 제공하는 반면, NeNA는 데이터셋 자체에서 직접 도출된 실험적 위치 정밀도 추정치를 제공합니다. 이러한 이유로 NeNA는 이론적 한계뿐만 아니라 드리프트 보정, 적합 오차, 실험 변동성과 같은 실용적 영향도 포착하기 때문에 CRLB의 보완적 척도로서 SMLM에서 널리 사용됩니다. NeNA 메트릭은 Picasso Render 모듈에서 추출됩니다. 단일 분자 적합의 CRLB를 사용하여 위치 정밀도 값(σSMLM)을 결정합니다. 보고된 값은 모든 국소화에 대해 x와 σy σ사이의 평균값으로, 각각 x와 y에서의 국소화 정밀도 분포의 모드값입니다.

결과

SDC-OPR 시스템의 초해상도 영상 능력을 입증하기 위해(그림 1A), 핵 기공 복합체(NPC)에 대한 DNA-PAINT 영상 실험(그림 1B)을 수행하여 평면 내 해상도를 평가했습니다17. 그림 1C 는 U2OS 세포에서 단량체 강화 녹색 형광 단백질(mEGFPs)으로 태그되고 DNA 결합된 항GFP 나노바인으로 표지된 뉴클레오포린 96(Nup96)의 대표적인 DNA 페인트 SDC-OPR 이미지를 보여줍니다. 확대된 패널은 NUP 하위 구조를 드러내며, 그림 1D 는 핵 기공의 예상 8배 대칭성과 일치하는 쌍을 이룬 Nup96 단백질(화살표로 표시됨)을 보여줍니다. 그림 1E에서는 Nup96 쌍 간의 유클리드 거리를 정렬하고 합산 이미지의 단면 히스토그램(n = 16쌍)을 그려 측정했습니다. 분석 결과 피크 간 분리 거리는 (13 ± 2) nm(그림 1E)가 나타났으며, 이는 전자기(EM) 모델과 HILO 및 TIR 영상23의 결과와 일치하였습니다. 각 피크 맞춤은 4 nm의 표준편차를 보여주었으며, 이는 SDC-OPR에서 DNA-PAINT를 사용해 달성한 높은 위치 정밀도(σSMLM = 3.3 nm, NeNA = 4.4 nm)를 확인시켜 주었습니다. 특히, 이 정밀도는 53 × 53 μm² FOV 전체에서 유지되어 공초점 기반 시스템에서는 매우 예외적인 성과입니다.

다색 영상 능력을 입증하기 위해 Nup96, 미토콘드리아, U2OS 세포 내 미세소관을 DNA 표지하여 Exchange-PAINT18을 사용해 획득했습니다. 이 기술은 단일 형광체에 결합된 직교 DNA 이미저 가닥을 사용하여 동일한 레이저 광원으로 모든 표적을 여기시킬 수 있게 합니다(그림 2A). 신호를 동시에 획득하는 대신, 순차적인 영상 라운드에 걸쳐 신호를 분리하여 상업용 SDC-OPR 시스템에 쉽게 통합할 수 있게 합니다. 그림 2B 는 파란색으로 항GFP 나노바인으로 표지된 Nup96, 빨간색으로 미토콘드리아에 2차 항-TOM20 항체가 표시되어 있으며, 초록색 미세소관과 1차 항-α-튜불린 항체가 표시되어 있습니다. 특히, 단일 색상 Nup96 영상에서 얻은 뛰어난 단일 분자 위치 정밀도는 다중 표적 실험의 모든 표적에서 유지되어, NPC는 3.9 nm, α-튜불린은 4.0 nm, 미토콘드리아는 3.3 nm의 위치 정밀도를 얻었습니다(그림 2B 패널 1, 2, 3).

광야각(FOV) 이미징을 위해 HeLa 셀 내 미세소관은 SDC-OPR 시스템에서 제공하는 다양한 배율과 카메라 비닝 설정을 결합하여 78nm에서 108nm 사이의 픽셀 크기를 유지하도록 영상화했습니다(그림 3). 그림 3A는 10개의 HeLa 세포의 미세소관 세포골격을 보여주며, 색상은 위치 정밀성을 나타냅니다. 1× 배율에서는 평균 위치 정밀도가 높은 배율에 비해 눈에 띄게 떨어지며(그림 3B-D), 변동성이 더 큽니다. 이는 넓은 시야각에서 레이저 출력 밀도가 낮아지기 때문인데, 가우시안 조명 프로파일이 뚜렷해지면서 시야각 가장자리로 갈수록 정밀도가 떨어집니다. 그럼에도 불구하고, 광범위한 211 × 211 μm² FOV에서 평균 9.5 nm의 위치 정밀도를 달성한 것은 공초점 기반 시스템으로서는 인상적이며 생물학적 이질성에 대한 고해상도 조사를 가능하게 합니다.

마지막으로, 고정된 HeLa 세포의 미세소관 네트워크(공초점 두께 ~500 nm, z-단계 1 μm)를 시스템의 최고 배율(4×, 53 × 53 μm² FOV)으로 획득함으로써 전체 세포를 이미징할 가능성이 입증되었습니다. 그림 4A 는 각 z-평면의 단일 분자 재구성 이미지와 해당 국소화 정밀도 및 NeNA 값을 보여줍니다. 또한, 그림 4C에는 HeLa 세포 내 미세소관 네트워크의 3D 컬러 시각화가 제공되어 있습니다. 깊이가 증가할수록 산란과 광학 수차로 인해 검출되는 광자의 수가 감소하여, 크라메르-라오 하한(CRLB)(그림 4A, 오른쪽)에서 유도된 정지와 NeNA 지표로 계산된 위치 정밀도 모두 감소합니다. 그럼에도 불구하고 SDC-OPR 시스템이 가능한 높은 수준의 광자 수집 덕분에SMLM ≤ 최대 9 μm 깊이와 좁은 분포를 가진 10 nm σ 가능합니다. 실제로 이중 벽 필라멘트 미세소관 구조는 다양한 깊이에서 명확히 해명되었는데, 커버슬립-셀 경계면 근처, 중간 축 위치, 그리고 세포 상단에서 피크 투 피크 거리는 30 nm에서 40 nm 사이였으며(그림 4C), 보고된 값24와 일치한다. 이 결과는 SDC-OPR이 넓은 시야각과 셀 전체 높이에 걸쳐 고해상도 영상을 제공할 수 있음을 강조합니다.

그림 1
그림 1: 다양한 세포 샘플의 평면 내 단일 분자 위치 현미경 및 다색 초해상도 영상. (A) 광자 재배치를 위한 스피닝 디스크 공초점 및 광자 재할당(SDC-OPR) 시스템의 개략도, 광자 수집을 극대화하기 위해 설계된 마이크로렌즈 배열이 특징입니다. (B) DNA 페인트 개략: 형광 표지된 DNA 가닥인 이미저 가닥은 상보적인 DNA 서열(도킹 가닥)과 일시적으로 하이브리드화하여 해당 단백질을 표적으로 하는 항체/나노바디에 고정됩니다. 이러한 단명한 결합 이벤트는 확률적 깜빡임으로 나타나는 형광 신호를 생성합니다. (C) U2OS 셀의 NPC를 4× 배율로 SDC-OPR 시스템에서 대표적인 DNA-PAINT 이미지를 촬영한 것. 고해상도 기능은 삽입 영상에서 개별 NPC가 명확하게 드러납니다. (D) SDC-OPR 강화 DNA-PAINT는 단일 NPC를 시각화할 수 있게 하며, 흰색 화살표가 구멍 구조 내 특징적인 Nup96 단백질 쌍을 강조합니다. (E) 단일 NPC 대칭 단위 내에서 Nup96 다이머(n=16쌍) 간 거리 측정 분포. 이 수치는 Zaza 등14에서 수정된 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요. 

그림 2
그림 2: SDC-OPR 현미경을 이용한 다색 영상 교환 PAINT. (A) 순차적으로 이미징된 세 대상의 Exchange-PAINT 도식. 세 가지 단백질 표적은 DNA 기능화된 항체, Fab 조각 또는 나노바디로 표지되었습니다. Cy3B 이미저 가닥은 가닥 유형별로 순차적으로 촬영되었으며, 이미징 라운드 사이에 워시 단계가 있었습니다. (B) SDC-OPR 현미경(4×배율)을 이용한 U2OS 세포의 3색 교환-PAINT 영상, 미세소관(빨간색; DNA 결합 항α-튜불린으로 표기됨), 미토콘드리아(녹색; TOM20 표적 DNA 나노바디), 그리고 NPC(파란색; mEGFP 태그 Nup96과 항GFP DNA 나노바디)를 포함합니다. 스케일 바: 5 μm. 확대된 영역은 SDC-OPR 시스템에서 얻은 향상된 해상도를 강조하며, (1) 미토콘드리아, (2) 미세소관, (3) NUP에 초점을 맞춥니다. 스케일 바 = 1 μm. 이 수치는 Zaza 등14에서 수정된 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3
그림 3: SDC-OPR 현미경에서 광시야(FOV) 내의 DNA-PAINT 이미징. 마이크로튜뷸 DNA-PAINT 이미지(안티-α-튜불린 표지)는 여러 배율로 획득: (A) 1×배율 및 1번의 비닝(시야각 211 × 211 μm²), (B) 2.8× 및 2 비닝(시야각 76 × 76 μm²), (C) 4× 배율과 4 비닝(시야각 53 × 53 μm²). 색상은 1배 배율의 경우 0-16 nm, 나머지 경우에는 0-4 nm의 위치 정밀도를 나타냅니다. (D) FOV 중심에서 μm 단위로 측정한 위치 정밀도는 1×(빨강), 2.8×(노랑), 4×(초록) 배율. 이 수치는 Zaza 등14에서 수정된 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4
그림 4: 전세포 DNA-PAINT 이미징. (A) 왼쪽. SDC-OPR을 사용해 4× 배율로 획득한 HeLa 세포 내 체적 미세소관 영상으로, z = 0에서 9 μm(1 μm 단계)의 축 단면을 보여줍니다. 각 평면은 z 위치, 위치 정밀, NeNA 지표를 표시합니다. 스케일 바: 5 μm (xy). 맞아. 모든 비행면에 대한 위치 정밀도와 관통 깊이의 차이. (B) (A)에서 작성된 것과 동일한 HeLa 셀 위의 미세소관 네트워크의 3D 렌더링. 색상은 0에서 9 μm까지의 관통 깊이를 나타냅니다. (C) 각 관투 깊이에서 강조된 작은 영역의 확대 이미지. 이 수치는 Zaza 등14에서 수정된 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

초해상도 형광 현미경은 회절 장벽을 허물어 공간 해상도를 획기적으로 향상시켰습니다. 그러나 생물학 연구에서의 광범위한 채택은 지속적인 도전 과제에 직면해 있습니다. 특히 FOV, 해상도, 관통 깊이 간의 트레이드오프 때문에 세 가지 요소를 동시에 최적화하기가 어렵습니다. 이러한 도전 과제는 SMLM 및 광학 광자 재배치(SDC-OPR)로 강화된 회전 디스크 공초점 현미경의 결합 기능을 활용하여 해결되었습니다. 상업용 SDC-OPR 시스템이 가능하게 하는 표준 SDC 구성에 마이크로렌즈 배열을 통합함으로써 광자 수집량이 증가하고 유효 핀홀 크기가 줄어들어 해상도가 크게 향상되었습니다. 표준 SDC와 비교했을 때, SDC-OPR 시스템은 해상도 능력에서 현저한 향상을 보였으며, 표준 SDC는 초점면에서 14 nm 간격으로 분리된 특징을 성공적으로 구별할 수 있었다. 반면 표준 SDC는 20 nm11 이상의 거리만 해독할 수 있었다. 이러한 향상된 해상도 능력은 분자 규모 분리를 달성하는 데 있어 광자 재할당의 이점을 강조합니다. 구체적으로, 초점면에서 2nm 미만의 측면 위치 정밀도(z = 0 μm)를 달성했으며, 최대 9 μm 깊이에서는 10 nm 미만으로 측면 정밀도를 유지했으며, 53 × 53 μm² 또는 76 × 76 μm²의 매우 유연한 시야각을 갖추었다. 211 × 211 μm²의 큰 시야에서 시스템은 인상적인 9.5 nm 평균 평면 위치 정밀을 제공했습니다. 이 결과들은 전체 세포 전반에 걸친 고해상도 영상 구현 능력을 강조합니다.

사용되는 다양한 항체의 결합 반응에 관해서는, 최적의 항체-DNA 비율을 보장하기 위해 프로토콜을 신중히 따라야 합니다. 이 비율을 초과하면 위치 정밀도가 떨어질 수 있으며, qPAINT25와 같은 정량적 측정에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 DNA와 항체 간 최종 1:1 비율을 보장하는 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 비율을 확인하는 것이 매우 중요합니다.

미세소관의 고품질 초해상도 이미지를 얻기 위한 중요한 단계는 적절한 고정입니다. 고농도의 PFA에만 의존하는 기존 고정법은 종종 미세소관 구조를 파괴합니다. 대신 글루타알데히드(GA)를 단독으로 또는 PFA와 병용하면 구조 보존이 크게 개선됩니다26,27.

최적의 이미징을 위해서는 단일 분자 사건당 광자 수집을 극대화하기 위해 고수치 개구(NA) 대물렌즈가 필수적입니다. 상업용 SDC-OPR 시스템에서는 샘플 광표백을 최소화하기 위해 SMLM에 사용되는 기존 TIRF 현미경보다 레이저 출력이 의도적으로 낮게 설정되어 있습니다. DNA-PAINT는 광표백 문제를 없애고 이론적으로 더 높은 레이저 출력을 사용할 수 있지만, 현재의 상업용 시스템은 TIRF 조명에 비해 더 긴 노출 시간이 필요하다는 한계가 있습니다. 더불어, SDC-OPR의 조명은 공초점 조명이기 때문에 노출 동안 분자들이 연속적으로 여기되지 않습니다. 따라서 연속 TIRF 조명에 비해 더 긴 노출 시간이 필요하며; 본 연구에서는 300 ms의 노출 시간을 사용했습니다. 그러나 주어진 실험의 해상도 요구에 따라 더 짧은 적분 시간(예: 150-200ms)을 적용할 수 있으며, 해상도28의 손실은 최소화됩니다.

이미저 가닥의 농도를 최적화하는 것은 단일 분자 신호가 잘 분리되면서도 정확한 재구성을 위해 충분한 위치를 확보하는 데 매우 중요한 단계입니다. 이 조정은 이벤트 밀도와 신호 중복 간의 균형을 세밀하게 조절하는 표준 SMLM 획득과 유사합니다. 최적의 이미저 농도는 각 타겟별로 조절해야 합니다. 예를 들어, 미세소관의 경우 초기 이미저 가닥 농도는 1 nM 미만으로 권장되며, 필요에 따라 조정이 이루어집니다.

장시간 획득 시 안정적인 초점을 유지하는 것이 매우 중요한데, 축(z) 드리프트는 사후 처리에서 보정할 수 없기 때문입니다. 측면(xy) 드리프트는 RCC 또는 피듀셜 마커 를 통해 보상할 수 있습니다. 이 구성에서 현미경의 퍼펙트 포커스 시스템(PFS)은 수시간 동안 초점 안정성을 보장합니다.

요약하자면, SMLM과 SDC-OPR의 통합은 전체 셀 깊숙이 고해상도 영상을 촬영할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공하며, 해상도, 깊이, FOV 간의 전통적인 상충을 극복합니다. 그러나 시스템의 기능을 완전히 실현하려면 항체 접합 및 고정부터 획득 설정 및 데이터 처리에 이르기까지 실험 조건에 대한 세심한 주의가 필수적입니다. 샘플 준비부터 드리프트 보정까지의 각 단계는 신뢰할 수 있고 높은 정밀도의 데이터를 달성하는 데 중요한 역할을 합니다. 신중한 프로토콜 최적화를 통해 이 접근법은 복잡한 생물학적 샘플에서 정량적이고 나노스케일 영상을 위한 견고하고 다재다능한 솔루션을 제공합니다. 이 프로토콜은 단일 분자 위치 현미경 도입과 기존 TIRF 또는 HILO 조명으로는 접근하기 어려운 샘플 평면에서 초분해상 이미지를 얻는 데 커뮤니티가 지원하는 데 도움을 줄 것으로 기대됩니다. 두 목표 모두 전 세계 현미경 시설에서 일반적으로 구할 수 있는 상업용 현미경을 사용하여 달성됩니다.

다른 및 미래 응용 측면에서, 이 방법은이전 연구에서 입증된 바와 같이 더 복잡한 조직 샘플뿐만 아니라 더 깊은 영상 심도의 더 복잡한 조직 샘플에도 적용 가능합니다. 물리적 절편 절단이 필요한 접근법과 달리, 이 기술은 온전한 조직의 체적 영상을 가능하게 하여 원래 구조를 보존하고 물리적 절획으로 인한 인공물을 최소화합니다. 나노바디와 같은 작은 친화성 프로브의 사용은 전체 길이 항체에 비해 조직 침투를 더욱 강화하여 두꺼운 샘플 전반에 걸쳐 더 균일한 표지를 가능하게 합니다. 이 접근법은 세포 조직과 분자 분포를 현장에서 더 높은 정밀도로 연구할 수 있는 문을 열어줍니다. 이러한 응용 외에도, 이 전략은 나노구조와 생체분자 조립체의 고처리량 스크리닝에도 적합하여 구조 이질성과 기능의 체계적인 연구를 가능하게 합니다. 또한, 최근 DNA-PAINT의 발전으로 염료-소탕기 또는 염료-염료 상호작용 29,30,31을 기반으로 한 자가 소탕 이미저 프로브가 개발되어 배경 신호를 효과적으로 낮추고 형광 강도를 높이며 공간 해상도를 향상시켜 더 빠른 획득 속도를 가능하게 합니다. 이러한 형광생성 프로브를 SDC-OPR 프레임워크에 통합하면 영상 속도와 해상도를 더욱 향상시킬 잠재력이 있습니다. 이러한 발전과 SDC-OPR 시스템의 강점을 결합하면 더 복잡한 생물 표본으로의 적용 가능성을 확장하여, 다양한 조직에서 세포 및 분자 구조를 상세히 지도화할 수 있는 유연한 도구로 자리매김할 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 선언할 것이 없다.

감사의 글

이 연구는 인간 프런티어 과학 프로그램 기구(HFSP)의 학제간 박사후 연구원 지원을 받아 CZ(LT0025/2023-C)와 공학 및 물리과학 연구 위원회의 지원을 받아 M.T.(EP/R513143/1 및 EP/W524335/1)와 O.P.L.D(EP/R513143/1 및 EP/T517793/1)를 지원했습니다. S.S는 도로시 호지킨 펠로우십(DHF\R1\ 및 DHF\R\191019 251006)을 통해 왕립학회를 인정합니다. 이 작업은 또한 챈 저커버그 이니셔티브(2023-321188)와 BBSCR (BB/Y513064/1) 보조금의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(±)-6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산머크 238813-5G트롤록스
3,4-디하이드록시벤조산  머크 37580-25G-FPCA
60번; Apo NA 1.49 대물렌즈니콘
7.0 KDA 스핀 탈염 컬럼, 크기 배제 수지 포함  피셔 사이언티픽 주식회사898822.4단계 제바 스핀 탈염 기둥
Accutase - 효소 세포 박리 배지프로모션 셀C-41310
알파카 sdAb (1H1) 항GFP와 맞춤형 DNA 결합 (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')매시브 포토닉스맞춤 제품초파리용 안티GFP 나노바디
알파카 sdAb (1H1) 항GFP와 DNA를 결합한 것매시브 포토닉스대규모 태그-Q-FAST 안티-GFP - F3NUP용 항GFP 나노바디
항알파 튜불린 (YL1/2)써모피셔 사이언티브MA1-80017
항토끼 IgG매시브 포토닉스Massive-sdAB-FAST 2-Plex, 보조 SDAB F2
반 TCRζ (6B10.2)바이오레전드644102
소 혈청 알부민머크 A4503-10GBSA
원뿔형 원심관 15 mL피셔 사이언티픽 주식회사17705004
원뿔형 원심관 50 mLVWR 인터내셔널734-0448
CSU-W1 소라니콘SDC-OPR 현미경
세포 정제용 크기 배제 수지(Sephadex G-25)로 스핀 컬럼을 탈염 처리하며;피셔 사이언티픽 주식회사11743309브랜드: 시티바. 2.5단계 G-25 열
D-포도당머크 G8270-1KG
DMEM 미디어써모피셔 사이언티브11965092
DMSO, 무수성써모피셔 사이언티브D12345
DTT  (디티오스레이톨)써모피셔 사이언티브15976082
EDTA써모피셔 사이언티브15575020
EGTA마크324626
태아 소 혈청써모피셔 사이언티브A5256701
글루타알데히드세르바2311402
글리세롤머크 G5516-500ML 
글리신MP 생의학219482580
말레이미드-PEG2-석시니미딜 머크 746223-50MG
맥코이의 5A 미디어피셔 사이언티픽 주식회사16600082
MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산)머크M3671-50G
메탄올피셔 사이언티픽 주식회사32213-25L
MgCl2피셔 사이언티픽 주식회사10418464
마이크로 원심분리기 튜브 0.5 mL피셔 사이언티픽 주식회사11508232
마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL에펜도르프10509691 
마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계써모피셔 사이언티브ND-원-W나노드롭
NaCl2시그마-올드리치S6546-1L 
나노입자 90nm - 금세포 진단G-90-100
오르카 퓨전-BT CMOS 카메라하마마츠
페니실린-스트렙토마이신써모피셔 사이언티브15070063추신
인산염 완충 식염수 (1x 용액)피셔 사이언티픽 주식회사11530546PBS
피어스 16% 포름알데히드 (w/v), 메탄올 프리피셔 사이언티픽 주식회사11586711PFA
염화칼륨  머크 그리고 nbsp; P9541-500G
프로토카테츄에이트 3,4-디옥시시아제 & nbsp;머크 P8279-25UN PCD
나트륨과 nbsp; 수산화물피셔 사이언티픽 주식회사12963614
TOM20 항체앱캠Ab186735
트리스 버퍼VWR 인터내셔널A4577.1000
트리톤  X-100  그리고 nbsp;VWR 인터내셔널1086031000
트윈-20머크 P9416-50ML
초여과 원심 여과 장치, 100 kDa MWCO머크 UFC510024제조사: 아미콘 울트라
μ-슬라이드 8 웰 하이 유리 바닥이비디IB-80807
μ-슬라이드 VI 0.5 유리 바닥이비디IB-80607

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