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방법 논문

LC-MS/MS를 이용한 1차 ALL 세포 내 빈크리스틴 세포내 정량을 위한 외부 체외 미세법 개발 및 표준화

499 조회수

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DOI:

10.3791/69535

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2026년 1월 23일

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1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Mass Spectrometry Laboratory, Boldrini Children's Center, 3Boldrini Children's Center

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 소아 1차 ALL 세포에서 빈크리스틴 축적의 상대적 정량화를 위한 LC-MS/MS 방법을 확립하고 최적화하는 것을 목표로 했습니다.

초록

소아 급성 림프구성 백혈병(ALL) 원발 세포에서 빈크리스틴(VCR)을 정량화하는 것은 샘플별 약물 흡수 차이를 이해하고 희소한 환자 자료를 이용한 실험 연구를 지원하는 데 필수적입니다. 여기서는 환자 유래 이종이식(PDX)을 통해 얻은 1차 세포에 최적화된 간소화된 LC-MS/MS 미세방법을 제시하며, 제한된 세포 가용성, 작은 세포 크기, 다중 세척 후 재현 가능한 회복 필요성 등 주요 과제를 해결합니다. 1시간에서 5시간의 시간 실험 결과, 3시간의 잠복 기간이 가장 높고 일관된 세포내 VCR 농도를 제공하며, 복제 간 변동성이 낮음을 보여주었습니다. 방법 최적화 결과, 조건당 2.5 × 106 셀을 사용할 때가 반복 실험에서 더 큰 분산을 보인 1×6 셀보다 분석적 견고성이 향상됨이 입증되었습니다. 추가적인 중요한 개선으로는 단백질 침전 효율을 높이기 위한 냉메탄올 사용과 절차적 변동을 모니터링하고 최소화하는 내부 표준 도입이 포함되었습니다. 이 방법은 관련 농도 범위 내에서 세포 내 VCR 의 민감하고 정밀한 정량화를 가능하게 하지만, 3시간 배양 후에는 최소 시험 용량(0.01 μM)을 정량화할 수 없었습니다. 전반적으로 이 미세방법은 1차 ALL 샘플에서 세포 내 VCR 측정을 위한 실용적이고 재현 가능하며 확장 가능한 접근법을 제공합니다. 이 설계는 비교 분석, 체외 모델 검증, 그리고 세포 내 약물 정량화를 더 넓은 약리학적 평가에 통합하는 미래 방법론적 응용을 지원합니다.

서론

급성 림프구성 백혈병(ALL)은 전체 소아암의 약 25%를 차지하며, 여전히 가장 흔한 소아 악성 종양입니다 1,2. 치료법의 발전으로 생존율이 현저히 향상되어 현재 90%를 넘었지만, ALL의 생물학적 복잡성은 세포 수준에서 질병을 더 잘 특성화하는 도구 개발을 위한 노력을 계속 촉진하고 있습니다.

빈카 알칼로이드, 특히 VCR은 모든 치료 프로토콜의 핵심 구성 요소입니다. VCR은 세포 내 세포 내 세포독성 효과를 발휘하기 때문에, 백혈병 세포에서 그 흡수와 축적을 이해하는 것은 약물 반응, 약리역학, 세포 행동 등 체외 시스템에서 연구하는 데 필수적입니다. 그러나 대부분의 세포 내 약물 농도 평가 방법은 간접 측정이나 반정량적 방법에 의존하여 재현성과 민감도를 제한합니다 5,6,7.

동시에 많은 연구가 여전히 백혈병 세포주에 크게 의존하고 있는데, 이는 환자 유래 1차 세포의 생물학적 이질성과 임상적 관련성이 부족합니다. 1차 샘플은 세포 수가 제한되고, 샘플 품질이 다양하며, 세포 내 화합물을 감지할 수 있는 고민도 분석 기법의 필요성 등 종종 도전 과제를 제시합니다8.

액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)은 화학요법제의 정밀한 정량화에 필요한 특이도와 민감도를 제공하지만, 원발성 백혈병 세포에서 직접 세포내 VCR을 측정하는 표준화된 프로토콜은 여전히 드물다. 제한된 환자 물질과 호환되는 견고한 마이크로 방법을 구축하는 것은 약리학적 프로파일링, 약물-세포 상호작용 평가, 질병 아형 또는 치료 조건 간 비교 연구 등 광범위한 응용을 촉진할 수 있습니다.

본 프로토콜에서는 LC-MS/MS를 사용하여 원발성 백혈병 세포에서 세포내 VCR의 체외 정량을 위한 미세방법 개발 및 최적화를 설명합니다. 방법 개발에 필요한 충분한 재료를 얻기 위해 환자 샘플을 면역결핍 NSG 마우스에 이식하여 PDX 모델9를 생성하였다. 생 체 내 증식 후, 인간 백혈병 세포가 분리되어 냉동 보존되었습니다. 그 후 해동, VCR로 배양, 세척, 용해, LC-MS/MS로 분석하여 세포 내 약물 농도를 측정했습니다.

이 방법은 몇 가지 장점을 제공합니다: 소수의 세포(250만 개)를 필요로 하고, 민감하고 빠르며, 임상적으로 중요한 1차 샘플과 호환됩니다. 세포 내 약물 함량을 직접 측정하기 때문에, 약물 흡수, 화학요법에 대한 세포 반응 또는 혈액학적 악성 종양의 기타 약리학적 질문을 연구하는 연구자들에게 신뢰할 수 있는 정량적 도구를 제공합니다.

전반적으로 이 프로토콜은 소아 ALL 연구를 위한 분석 도구 키트를 확장하며, 다른 약물이나 샘플 유형에 쉽게 적용할 수 있어 백혈병 생물학, 약물 작용 및 정밀 약리학에 대한 향후 연구를 지원합니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 백혈병 샘플은 Centro Infantil Boldrini에서 치료받은 환자들의 바이오뱅크 바이알에서 채취되었으며, 이들은 동의서를 통해 세포 사용을 허용했습니다. 이 프로젝트는 기관 윤리 위원회(CAAE 34601120.7.0000.5376)의 승인을 받았습니다. 동물에서 PDX 생성을 위한 프로토콜은 Centro Infantil Boldrini(CEUA/Boldrini 0011-2020) 산하 동물윤리위원회(Comissão de Ética no Uso de Animais)의 규정과 윤리 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 샘플 준비 및 약물 배양 (1일차)

  1. 재고 및 작동 용액 준비
    1. 빈크리스틴 황산염 2.5mg(분자량: 923 g/mol)을 무게로 2.0 mL 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 녹여 2.0 mL 마이크로튜브에 녹여 1.354 mM 스톡 용액을 만듭니다. 완전히 녹을 때까지 소용돌이.
      주의: DMSO는 자극제입니다; 장갑을 끼고 화학 연기 구역에서 다루세요.
    2. 100 μM 작업 용액을 147.71 μL VCR 기본 용액과 1,852.28 μL DMSO를 2.0 mL 마이크로튜브에 혼합하여 준비합니다. 완전히 소용돌이.
    3. 작업 용액 500 μL을 4개의 0.6 mL 마이크로튜브에 분포하여 -20 °C에서 최대 수개월간 보관합니다. 알리콥트를 세 번 이상 해동하지 마세요.
    4. 1.1 mM 스톡 용액 181.81 μL (빈블라스틴 황산염 1 mg/mL, 분자량: 909.07 g/mol)과 1,818.19 μL 멸균 초순수수를 2.0 mL 마이크로튜브 내에 혼합하여 100 μM 빈블라스틴(VINB) 작업 용액을 준비합니다. 소용돌이가 균질화될 때까지 이어집니다.
    5. VINB 작동 방식을 VCR과 똑같이 분리하세요.
    6. 50 mL 튜브 내에서 49.95 mL의 메탄올과 50 μL VINB 작업 용액을 혼합하여 메탄올 + 0.1 μM VINB 용액을 준비합니다. 소용돌이가 균질화될 때까지 이어집니다. -20°C에서 최대 3개월간 보관하세요.
      주의: 메탄올은 독성이 있고 가연성입니다; 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용한 채 흡기 후드에서 다루세요.
    7. 50mL 튜브 안에 49.95mL의 초순수수와 50 μL 개미산을 혼합하여 물 + 0.1% 개미산 용액을 준비합니다. 소용돌이 현상. 실온(RT)에서 보관하세요.
      주의: 개미산은 부식성이 있습니다; 장갑과 눈 보호구를 착용해 다루세요.
  2. 1차 세포 해동 및 세척
    1. 37 °C 증류수 15mL가 담긴 비커에서 바이알을 부드럽게 돌려 완전히 해동할 때까지 해동합니다.
      참고: 세포 채취 및 냉동 프로토콜에 관한 정보는 이전 출판물 9,10에서 확인할 수 있습니다.
    2. 바이알 내용물을 멸균 일회용 파스퇴르 피펫으로 10-15 mL 멸균 1x PBS가 든 50 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 원심분리기를 300 × g에서 5분간 RT 온도로 돌립니다.
    3. 튜브를 뒤집어 상청액을 버리세요.
    4. 일회용 파스퇴르 피펫으로 10mL AIM V 배지에 펠릿을 재현탁하세요. 자동 계수기를 사용해 생존 가능한 세포를 세고 평균 세포 크기를 측정합니다.
      참고: 총 세포 수에 비해 생존율이 최소 80% 이상인 세포를 사용하는 것이 권장됩니다.
    5. 측정된 농도를 바탕으로 단순 비율로 2.5× 10개의 6개 생존 가능한 세포를 수집하는 데 필요한 부피를 계산합니다. 예를 들어, 농도가 5 ×10 6 cells/mL라면 필요한 부피는 0.5 mL입니다.
      참고: 데이터 재현성을 위해 각 처리를 3배로 수행하세요. 자동 셀 카운터에 제공되는 배지 크기를 저장하세요; 셀의 부피를 계산하는 데 사용하세요.
  3. 약물 치료 장비
    1. 총 2.0 mL 부피 중 최종 농도가 1 μM에 도달하는 데 필요한 VCR 작업 용액의 부피를 계산합니다. 피펫팅 전에 스톡 용액을 보일게 하세요.
    2. AIM V 배지를 추가한 후6× 10개의 2.5 6 셀을 넣고, 마지막으로 VCR 용액을 2.0 mL 마이크로튜브에 넣습니다. 잠시 소용돌이를 하고 가볍게 5초를 돌려 튜브 캡에서 액체를 모으세요.
    3. 개방된 튜브는 37°C, 5%CO2에서 3시간 동안 인큐베이팅하세요.
    4. 배양 후에는 뚜껑을 닫고 300 × g 에서 5분간 RT 원심분리합니다.
    5. 피펫으로 상원액을 조심스럽게 버린 후, 튜브에 RT로 1mL의 PBS를 추가하세요.
    6. 원심분리를 300 × g에서 5분간 RT로 반복하고, 상정액 제거와 PBS 세척을 두 번 더 하여 총 세 번 세척합니다.
    7. 피펫을 사용해 모든 상원액을 조심스럽게 제거하고, 100 μL PBS에 펠릿을 재현탁한 후 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 소용돌이로 돌립니다.
    8. 샘플에 400 μL 차가운 메탄올 + 0.1 μM 빈블라스틴(-20 °C)을 직접 첨가하여 튜브 벽과 접촉하지 않도록 합니다.
    9. 샘플은 -80 °C에서 하룻밤 보관하세요.
      참고: 샘플은 -80 °C에서 몇 주간 보관할 수 있습니다(안전 중단).

2. LC-MS/MS 샘플 처리 (2일차)

  1. 샘플 추출
    1. -80 °C 냉동고에서 샘플을 꺼낸 후 원심분리기를 4 °C로 미리 냉각하세요.
    2. 냉동고에서 샘플을 채취한 직후 13,000 × g 에서 4 °C에서 20분간 원심분리합니다.
    3. 상원액 300 μL를 1.5 mL 마이크로튜브에 옮깁니다.
    4. 진공 농축기를 사용해 40-45°C에서 1시간 40분 동안 샘플을 완전히 건조합니다.
      참고: 건조 펠릿은 -20°C에서 몇 주간 보관할 수 있습니다(안전 중단).
    5. 각 펠릿을 400 μL 물+0.1% 개미산(미리 준비해둔)에 재현탁합니다. 펠릿이 완전히 녹을 때까지 부드럽게 소용돌이를 돌립니다.
    6. 샘플을 13,000 × g 에서 4 °C에서 20분간 다시 원심분리합니다.
    7. 300 μL 상청액을 2.0 mL 나사 뚜껑 바이알에 옮겨 LC-MS/MS 분석합니다.

3. LC-MS/MS 설정 및 데이터 수집

  1. 이동상 준비 및 컬럼 조절
    1. 용매 A는 초순수수와 0.1% 개미산을 혼합하여 준비합니다.
    2. 용매 B는 아세토니트릴과 0.1% 개미산을 혼합하여 준비합니다.
      주의: 아세토니트릴은 독성이 있고 가연성이 있습니다; 화학 훈기 후드에 손잡이가 있어.
    3. 각 용매를 초음파 세척에 5분간 소파 처리하세요. 병을 펌프 모듈에 연결하고 고유량으로 시스템을 세척하여 오염 물질을 제거하세요.
    4. 위상 반대 BEH C18 컬럼(1.7 μm, 2.1 mm × 50 mm)을 설치하세요.
      참고: 분석을 수행하기 위해 본 연구는 Acquity H-Class 크로마토그래피 시스템을 Xevo TQS-Micro 삼중사중극자 질량분석기와 결합하여 사용했습니다.
    5. 용매 A와 B로 구성된 이진 구배를 사용하며, 두 가지 모두 미리 준비되어 있습니다.
    6. 첫 2분 동안 용매 B의 5%에서 95%까지 크로마토그래피 구배를 돌리고, 이어서 컬럼 세척과 재평형을 위해 용매 A를 2분간 사용하세요.
    7. 4분 동안 유량을 0.2mL/min로 설정하세요. 컬럼 온도를 40°C로 유지하고 각 샘플당 10μL을 주입합니다.
  2. LC-MS/MS 방법 설정
    1. LC-MS/MS 소프트웨어를 열어보세요. 새 메서드를 시작하려면 파일 > > MS 메서드 를 클릭하세요.
    2. 기능 탭으로 가서 기능 유형을 다중 반응 모니터링(MRM)으로 설정하세요. VCR 및 VINB(내부 표준)에 대해 표 1에 나열된 이온 전이와 매개변수를 입력하세요.
    3. 획득 시간을 4분으로 설정하세요. 저장하려면 '지원하기'를 클릭하세요.
      참고: 주입 사이에 컬럼 재평형을 보장하기 위해 4분을 초과하지 마십시오.
    4. Inlet 메서드 > LC 메서드 편집 항목에서 UHPLC 매개변수를 설정하고 .mth 파일로 저장하세요 (표 2).
    5. 표 3에 따라 Tune 탭에서 소스 파라미터를 설정하세요. .tun 파일로 저장하세요.
    6. 전체 저장 방법: 파일 > 다른 이름으로 저장하고, .mth 파일 로 내보내세요 .
  3. 샘플 리스트 생성과 실행 시작
    1. 소프트웨어 홈 화면에서 샘플 리스트 를 열고 샘플 이름, 주입 부피, 바이알 위치, 사용 방법 목록을 생성하세요.
    2. 초순수한 물이 담긴 바이알을 오토샘플러 트레이에 넣고 빈 상태로 지정합니다. 블랭크는 3회 주사 사이마다 사용해서 이월을 방지하세요.
      참고: 런을 시작하기 전에 컬럼 압력(ΔP)이 안정적이고 10 psi 미만인지 확인하세요.
    3. 샘플 목록에서 원하는 행을 선택하고 '확인 실행'을 클릭> 데이터 수집을 시작하세요.

4. 데이터 분석

  1. 데이터 시각화 및 내보내기
    1. 검사가 끝난 후, 샘플을 선택하고 상단 메뉴 바에서 크 로마토그램 을 클릭하여 크로마토그램을 확인하세요.
    2. 홈 화면에서 TargetLynx를 클릭하고 방금 실행된 파일을 선택한 후 Process > VCRISTINE 메서드 선택> OK를 클릭하여 출력 테이블을 생성합니다.
    3. 보고서 > 내보내기 테이블을 클릭하고 처리된 데이터를 .csv 또는 .xlsx 파일로 저장하세요.
      참고: 분석물과 내부 표준 모두에 대해 원시 피크 영역을 내보내세요.
  2. 데이터 조직 및 비율 계산
    1. 내보낸 파일을 열고 다음 열을 만드세요:
      1. 샘플: 샘플 또는 바이알의 이름을 추가하세요.
      2. 실행: 해당 값이 대응하는 복제 위치를 표시합니다.
      3. VCR 영역: 봉우리 아래 영역에 빈크리스틴을 입력하세요.
      4. VINB 영역: 빈블라스틴 피크 아래 영역을 입력하세요.
      5. VCR/VINB 비율: 각 VCR 값을 해당 VINB 값으로 나누어 정규화합니다.
    2. 각 3중 세트별로 VCR 면적, VINB 면적, VCR/VINB 비율의 표준편차 값을 추가하세요.
      참고: 내부 표준체를 이용한 정규화는 추출량 또는 주입량 변동을 보정할 수 있습니다.
  3. 플롯 결과
    1. 선호하는 그래프 소프트웨어를 열고 그룹드 테이블 형식을 선택하세요.
    2. ' 입력 또는 새 테이블에 데이터를 가져오기 '를 선택한 후, 옵션 항목에서 나란히 정렬된 하위 열에서 ' 3 복제 값 입력 '을 선택하세요.
    3. 각 샘플의 정규화된 VCR/VINB 비율만 표시하고, 원시 면적 값은 생략합니다.

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결과

VCR과 VINB를 함께 배양한 1차 ALL PDX 세포를 이용한 세포 내 축적 분석 후 얻은 대표적인 크로마토그래피 결과는 그림 1에 나와 있습니다. 샘플은 조건당 2.5× 10개의6셀을 사용해 준비되었습니다. 기술된 크로마토그래피 조건 하에서 VCR은 2.85분으로 일관되게 유지되며 매트릭스 효과가 최소화되었고, 피크 형태는 대칭적이고 잘 해명되었습니다. 이 프로파일들은 프로토콜이 올바르게 실행되었을 때 VCR과 VINB의 예상되는 크로마토그래피 거동을 보여줍니다.

이 프로토콜을 원발성 백혈병 세포에 적용하기 전에, 방법의 선형성, 검출한계(LOD), 최적 세포 수 및 배양 시간을 결정하기 위한 예비 분석이 수행되었습니다. 이 단계들은 본 프로토콜에 자세히 다루어져 있지 않으나, 보정 곡선의 대표적인 결과가 방법 검증의 일부로 아래에 제시되어 있습니다.

...

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토론

원발성 백혈병 세포에서 세포내 약물 농도를 정확히 평가하는 것은 세포 수준에서 약물 취급을 이해하고 분자 프로파일링을 보완하는 기능적 분석법 개발을 지원하는 데 필수적입니다. 기존의 분석 방법은 종종 많은 수의 세포를 필요로 하거나, 긴 처리 단계를 포함하거나, 화학요법제의 실제 세포 내 가용성을 반영하지 않는 간접 수치에 의존합니다 5,6. 이러한 한계는 환자 유래 샘플에서 세포내 약물 축적을 직접 정량화할 수 있는 빠르고 민감하며 확장 가능한 방법의 필요성을 강조합니다.

이 프로토콜은 LC-MS/MS를 사용하여 소아 급성 림프모세포(ALL) 세포에서 세포내 VCR의 상대적 정량을 위한 미세방법을 설명합니다. 이 방법은 세포 내 약물 성분을 직접적이고 민감하게 평가하기 위해 개발되었으며, 종종 대량 세포 물질, 반...

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공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

Centro Infantil Boldrini와 연구에 샘플을 기증해 주신 모든 환자분들께 감사드립니다. 아드리엘리 C. 소아레스는 브라질 니벨 수페리얼 페스소알 코르데나상 아페페이소아멘토(CAPES)와 상파울루 연구 재단(FAPESP, 2023/18389-3)으로부터 펠로우십을 받았습니다. 호세 A. 유네스는 국가기술과학개발위원회(CNPq, 308399/2021-8)로부터 생산성 펠로우십을 받았습니다. 이 연구는 브라질 보건부의 PRONON 프로그램(Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45)의 연구 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2.0 mL 나사 뚜껑 바이알유량 공급8-2400같은 회사의 스프링이 달린 유리 인서트(5 x 29 mm)와 함께 사용됨 (카탈로그 5-29015)
2.0 mL 나사 뚜껑 바이알유량 공급8-2400같은 회사의 스프링이 달린 유리 인서트(5 x 29 mm)와 함께 사용됨 (카탈로그 5-29015)
아세토니트릴머크 (시그마-알드리치)100030
아세토니트릴머크 (시그마-알드리치)24010152
목표 V써모피셔 사이언티브12055091
크로마토그래피 시스템 Acquity UPLC H-클래스워터스 컴퍼니https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW
백작부인 3 FL써모피셔 사이언티브A49892
DMSO머크 (시그마-알드리치)D 8418
팔콘 50 mL사르스테트62.547.254
개미산머크 (시그마-알드리치)F0507
유리병머크 (시그마-알드리치)41121800
인큐베이터PHCBIMCO-50M-PE
메탄올머크 (시그마-알드리치)34860
마이크로튜브 1.5 mL에펜도르프41121702
마이크로튜브 2.0 mL에펜도르프30120094
PBS머크 (시그마-알드리치)PPB006
Speevac miVac피셔 사이언티브56340
데이터 수집용 소프트웨어워터스 컴퍼니매스링크스
삼중 쿼드러폴 질량분석기 Xevo TQ-S 마이크로워터스 컴퍼니https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW
초음파 음파기퀴미스Q335D
빈블라스틴 1 mg/mL립스https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/빈블라스틴 황산염
빈크리스틴케이맨 케미컬스11764

참고문헌

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  3. Gaudichon, J., et al. Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues. Blood Rev. 36, 40-56 (2019).
  4. Dhyani, P., et al. Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine. Cancer Cell Int. 22, 206(2022).
  5. Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations. Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).
  6. Chien, H. C., et al. Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells. Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).
  7. Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).
  8. Richter, M., et al. From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines. Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).
  9. Borgmann, A., et al. Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  10. Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia. J Vis Exp. (224), e68797(2025).
  11. Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid. J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).
  12. Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).
  13. Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations. Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).

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