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방법 논문

CRISPR/Cas9 매개 Ent2*/CyO 초파리 흑개 균 균주의 생성 및 특성 분석

62 조회수

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DOI:

10.3791/69546

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2026년 8월 7일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

이 논문에서

요약

평형 뉴클레오사이드 수송체 2(ENT2)는 뉴클레오사이드 수송과 세포 대사에 관여하는 보존된 막관통 단백질입니다. 본 연구에서는 초파리 멜라노가스터에서 Ent2 표적 대립유전자를 생성하기 위해 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 워크플로우를 구축하였습니다. 균형 염색체 전략을 사용하여 안정적인 Ent2*/CyO 이형접합 계통을 구축하고 유지하였습니다. 이 연구는 돌연변이 계통의 설계, 생성 및 분자 검증과 다양한 온도 조건에서의 표현형 특성화를 설명합니다. 확립된 워크플로우와 돌연변이 균주는 동형접합 치명적 표현형을 가진 유전자 연구와 초파리의 온도 관련 표현형 변이를 연구하는 실용적 틀을 제공합니다.

초록

본 연구에서는 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 접근법을 사용하여 초파리 멜라노가스터의 평형 뉴클레오사이드 수송체 2(Ent2) 유전자에 돌연변이를 도입하였습니다. Ent2의 코딩 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA를 설계하여 Cas9 mRNA와 함께 w1118 배아에 주입하였습니다. 돌연변이 대립유전자는 생거 시퀀싱으로 확인되었고, 밸런서 염색체를 이용해 안정적인 Ent2*/CyO 이형접합 계통으로 유지되었습니다. 이후 우리는 각각 22°C와 25°C에서 초파리에서 체중, 등반 능력, 생존율, 그리고 슈퍼옥사이드 디뮤터제(SOD)와 카탈라아제(CAT)의 활성을 평가했습니다. 결과는 22 °C와 25 °C 모두에서 Ent2*/CyO 초파리의 체길이와 무게가 w1118에 비해 현저히 줄어들었고, 이로 인해 발달이 지연되었음을 보여줍니다. 22 °C에서 Ent2*/CyO 파리의 전체 수명은 w1118보다 약간 더 길었으며, 25 °C에서는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 운동 능력과 관련해서, 이형접합파리의 등반 성능은 두 온도 모두에서 w1118보다 현저히 낮았으며, 수컷이 더 심하게 영향을 받았습니다. 또한, Ent2*/CyO 초파리에서 CAT와 SOD의 항산화 효소 활성이 유의미하게 감소하여 항산화 능력의 명백한 저하를 나타냈다. 이 결과는 CRISPR로 생성된 Ent2 돌연변이 계통의 표현형 프로필을 설명하며, 초파리에서 게놈 편집과 밸런서 염색체 전략을 결합하는 것의 실현 가능성을 보여줍니다. 이 연구는 대사 및 환경 반응과 관련된 유전자 연구를 위한 방법론적 틀과 유전적 자원을 제공합니다.

서론

Drosophila melanogaster는 유전학 및 발생생물학에서 가장 널리 사용되는 모델 생물 중 하나로 남아 있습니다. 짧은 생애사, 빠른 번식, 확립된 유전자 조작 도구, 그리고 완전히 주석이 달린 게놈이 특징이다 2,3. 이 종은 유전자 기능, 대사 조절, 환경 적응성 연구에 광범위하게 적용된다 4,5. 뉴클레오사이드와 ATP와 같은 유도체는 초파리에서 세포 에너지 생성, 핵산 합성, 신호 전달에 중심적이며, 다세포동물 전반에 걸쳐 보존된 대사 조절을 반영합니다6. 초파리의 퓨리너성 신호 전달 경로는 세포외 아데노신과 뉴클레오사이드 수송 메커니즘에 의존하며, 세포막을 가로지르는 뉴클레오사이드 이동이 에너지 및 신호 전달 반응을 조정하는 기능적 역할을 강조합니다. 7. 이 과정들 중 뉴클레오사이드가 세포질막을 가로지르는 수송은 주로 평형 뉴클레오사이드 수송체(ENT) 계열에 의해 매개되며, DmENT2는 초파리8에서 기능적 수송 활동을 보입니다.

ENT 계열은 여러 아형으로 구성되며, 그중 ENT2는 광범위하게 연구된 막관통 뉴클레오사이드 수송체9입니다. 이 과정은 다양한 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오사이드의 에너지 독립적 막관통 수송을 촉진합니다10,11. 포유류에서 ENT2는 세포 내에서 널리 발현되는 양방향 수송체로, 세포가 퓨린과 피리미딘 핵클레오사이드 및 핵염기를 흡수하는 것을 돕습니다. 이 운반 활동은 뉴클레오타이드 회수에 기여하며 세포 대사 항상성 유지에 도움을 줍니다. ENT2는 또한 다양한 뉴클레오사이드 유래 약물의 수송을 매개하며, 내인성 뉴클레오사이드 이동을 넘어 기능적 중요성을 확장하여 그 광범위한 생리적·임상적 중요성을 강조합니다13. 더불어, ENT2는 인간에서 신경학적 질환14, 종양 대사15, 혈관 기능 장애16, 세포 에너지 대사17과 관련이 있습니다. 그러나 초파리에서 Ent2의 유기체 수준 역할을 다룬 연구는 여전히 제한적입니다.

ENT2가 성장 및 발달, 에너지 대사, 운동 수행 능력, 다양한 온도 조건에서의 항산화 능력에서 차지하는 역할은 아직 완전히 탐구되지않았습니다. 온도는 초파리의 기초 대사율과 수명에 큰 영향을 미치며, 높은 양육 온도는 일반적으로 대사 활동을 증가시키고 수명을 감소시킵니다19. 이러한 온도 의존적 유전자 발현 변화는 생리학적 경로에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 특정 유전자 돌연변이의 표현형 효과를 조절할 수 있습니다20.

클러스터드 규칙 간격 짧은 회문 반복 복제/CRISPR 관련 단백질 9(CRISPR/Cas9)는 초파리에서 부위 특이적 녹아웃, 결실, 치환, 태그 도입 등 다양한 유전체 변형 작업에 널리 적용되어 왔으며, 그 효율성과 신뢰성을 입증했습니다 21,22,23. 최신 진전은 CRISPR 기반 염기체 편집기가 초파리에서 더 세밀한 부위특이적 염기 변형에도 사용될 수 있음을 보여주며, 이는 점 돌연변이와 정밀한 표현형 제어를 위한 새로운 도구를 제공한다는 것입니다. 전통적인 돌연변이 유발 방법, 즉 화학적 및 방사선 돌연변이 유발, 그리고 트랜스포존 매개 스크리닝은 유전적 돌연변이를 유발할 수 있습니다25. 이러한 접근법은 종종 낮은 효율성과 돌연변이 사건의 높은 무작위성으로 인해 제한됩니다. 따라서 연구자들은 관심 있는 특정 대립유전자를 분리하기 위해 많은 개체를 선별해야 합니다26. CRISPR/Cas9는 지정된 DNA 서열에서 프로그래밍된 가이드 RNA(gRNA) 지향 절단을 가능하게 합니다. 이로 인해 발생한 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 결합 또는 상동성 지향 수리를 통해 복구되며, 정의된 유전 가능한 돌연변이를 생성하고 표현형 분석을 혼란스럽게 할 수 있는 배경 돌연변이를 크게 줄인다 27,28. CRISPR/Cas9로 생성된 돌연변이 대립유전자는 Curly O (CyO)29와 같은 밸런서 염색체와의 연관을 통해 이형접합 상태를 유지할 수 있습니다. 이 전략은 초파리 유전학에서 동형접합 형태의 치명적 대립유전자 손실을 효과적으로 방지하는 것으로 입증되었습니다. 그 결과, 다양한 온도 또는 환경 조건에서의 기능적 연구를 포함한 장기적이고 체계적인 표현형 평가를 지원합니다29,30. CRISPR/Cas9의 단순한 설계와 높은 효율성은 균주 구성 주기를 크게 단축하고 유전적 배경의 안정성을 높였습니다. 이는 온도 반응과 발달 항상성과 같은 장기 환경 요인을 연구하는 데 특히 중요합니다.

이 기반 위에 CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 초파리 멜라노가스터의 Ent2 유전자가 제거되었고, 안정적으로 유전된 Ent2*/CyO 이형접합 돌연변이 균주가 확립되었습니다. 항산화 효소 SOD와 CAT의 발달 주기, 체중, 운동 능력 및 활성을 체계적으로 평가하였다. w 1118과 돌연변이 파리의 다차원 표현형을 다양한 온도 조건에서 비교함으로써, 본 연구는 CRISPR 유래 돌연변이 계통을 생성하고 유지하는 재현 가능한 전략을 제시하고, 결과 표현형에 대한 기술적 특성화를 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 대사 및 환경 반응에 관여하는 유전자를 조사하는 미래 연구를 위한 방법론적 틀과 유용한 유전학 자원을 제공합니다.

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프로토콜

1. Ent2 유전자의 CRISPR/Cas9 표적 설계

  1. CHOPCHOP (v3)31과 CCTop (v1.0)32를 사용하여 Ent2의 엑손 2와 5(FlyBase ID: FBgn0263916)에서 후보 CRISPR 부위를 선택합니다.
  2. 기준 유전체는 Drosophila melanogaster Release 6 (dm6)(RefSeq 조립 번호: GCF_000001215.4)로 정의되었습니다. 그 후 후보 gRNA 부위가 확인되었습니다. 마지막으로, 확인된 부위를 필터링하여 최적의 gRNA를 얻었습니다.
  3. MIT 특이성 점수 ≥ 80(CHOPCHOP), CFD 점수 0.1(CCTop), GC 함량 40%–60%, 최소 PAM 거리 ≤ 필터 타겟.
  4. 가중 점수(효율성 50%, 특이성 30%, GC 최적화 20%)로 표적을 순위 매기고, 두 개의 gRNA를 선택합니다.
  5. 각 gRNA의 5′ 말단에 T7 프로모터 요구사항을 충족시키기 위해 한 개의 "G"를 추가하세요. 다음 gRNA 특이적 포워드 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR에 의해 전체 길이 sgRNA 전사 템플릿을 생성합니다:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT(타타크캑트)
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTAGAGCTAGAAAATAGC
    엔트2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAAATAGC
  6. 남은 sgRNA 스캐폴드 서열은 PCR 중 보편적인 역올리고뉴클레오타이드에 의해 제공된다.

2. sgRNA 전사 주형 준비

  1. sgRNA 전사 템플릿의 준비
    1. 제조사 지침에 따라 이중 올리고뉴클레오타이드 어닐링–PCR 방법33을 사용하여 60 μL PCR 반응 혼합물을 조립합니다. gRNA 특이적 전방 올리고뉴클레오타이드(Ent2-sg1-F 또는 Ent2-sg2-F)와 sgRNA 스캐폴드를 암호화하는 범용 역올리고뉴클레오타이드를 결합하여 시험관 내 전사를 위한 전장 dsDNA 주형을 얻습니다.
    2. 열사이클러 프로그래밍: 95 °C 3분; 95 °C 30초, 55 °C 30초, 72 °C 20초의 35주기; 그 후 72°C 10분; 12°C에서 멈춰.
  2. 전사 템플릿을 정제하세요
    1. 60 μL PCR 제품에 100 μL 아모늄 아세테이트( 재료표 참조)를 첨가합니다; 혼합. 400 μL 무수 에탄올을 첨가; 뒤집어 혼합 후 -20 °C에서 20분간 배양합니다.
    2. 4 °C, 20,000 x g 원심분리기 15분간 사용; 상정액을 버리세요.
    3. 튜브를 열어둔 상태로 펠릿을 10분간 자연 건조하세요. 펠릿을 뉴클레아제 프리 ddH₂O 10 μL 용량에 재현탁합니다.
  3. in vitro gRNA 전사
    1. 키트 지침에 따라 10 μL T7 시험관 내 전사 반응을 설정하세요( 재료표 참조).
    2. 37 °C에서 35분간 배양합니다. 전사 키트에 포함된 0.5 μL DNase I를 추가하고 37 °C에서 15분간 배양합니다.
  4. gRNA 정제
    1. 전사 혼합물을 뉴클레아제 무첨가 ddH₂O로 60 μL로 희석. 60 μL 수분 포화 페놀/클로로포름을 첨가합니다(재료표 참조); 소용돌이 잠시 발생하고 4°C, 16,000 x g 에서 5분간 원심분리기를 사용했습니다.
    2. 수용상 45 μL을 새로운 1.5 mL RNase 없는 튜브로 옮깁니다. 5 μL 아세테이트 나트륨을 추가하고; 믹스.
    3. 125 μL 사전 냉각된 무수 에탄올을 추가하고; 혼합하여 -20 °C에서 20–30분간 배화합니다. 4 °C, 20,000 x g 원심분리기 15분간 사용; 상정액을 버리세요.
    4. 펠릿을 70% 에탄올(RNase 무첨가) 200 μL로 세척합니다; 4°C, 20,000 x g 에서 5분간 원심분리기; 상정액을 제거하세요.
    5. 펠릿을 37°C에서 말려 에탄올이 완전히 증발할 때까지 유지합니다. 20 μL ddH₂O에 재현탁; 분할 단위로 만들어 -80 °C에서 보관하세요.
    6. 나노드롭 분광광도계를 사용해 gRNA 농도를 측정하고 주입 시 농도를 250 ng/μL로 조절합니다. A260/A280 비율이 약 2.0인 gRNA의 순도를 보장합니다.
      참고: RNase 보호를 위해 전 과정 내내 장갑을 착용해야 함을 강조합니다. 사전 냉각된 RNase 없는 원심분리관과 피펫 팁을 포함한 모든 소모품은 절차 중 일관되게 사용해야 합니다. 운영 중 발생한 유기 시약 폐기물은 종류에 따라 지정된 폐기물 용기에 별도로 수집되어야 하며, 적절한 취급을 위해 인증된 유해 폐기물 처리 시설로 정기적으로 운송되어야 합니다.

3. Cas9 mRNA의 준비

  1. 전사 템플릿 준비
    참고: RNA 관련 단계에서는 RNase가 없는 팁과 튜브를 사용하세요.
    1. Cas9 발현 플라스미드 MLM3613(재료 표 참조)을 얼음 위에서 해동하세요. RNase 없는 튜브에서 20 μg 플라스미드 DNA, 7.5 μL 10배 제한 완충제, 1 μL PmeI(10,000 U/mL), 뉴클레아제 프리 ddH₂O를 75 μL로 결합합니다.
    2. 37°C에서 30분간 배큐하세요. 120V 1% 아가로스 겔에 5 μL을 30분간 투여하여 완전한 선형성을 검증합니다.
  2. 전사 템플릿의 정제
    1. 70 μL의 효소액에 23 μL 2% 도데실 황산나트륨(SDS, 자세한 내용은 재료표 참조)과 0.5 μL 단백질효소 K(재료 표 참조) 를 첨가합니다; 50°C에서 30분간 배양하세요.
    2. 클로로포름 45 μL와 트리스 포화 페놀 45 μL 첨가; 소용돌이; 원심분리기 13,800 x g, 5분.
    3. 90 μL 수상 상을 새 튜브로 옮깁니다. 키트에서 제공하는 10 μL 아세트산 나트륨과 200 μL 사전 냉각 무수 에탄올을 추가; 믹스; −20 °C에서 30분 배양합니다.
    4. 원심분리기 20,000 x g, 4 °C, 15분; 상정액을 버리세요. 펠릿을 100 μL 70% 에탄올로 두 번 세척합니다; 원심분리기 20,000 x g, 각각 2분; 자연 건조.
    5. DNA를 20 μL 무핵효소 ddH₂O에 용해; >500 ng/μL을 확인하세요.
  3. 공동 캡핑을 이용한 시험관 내 전사
    1. 제조사 지침에 따라 캡핑이 포함된 T7 시험관 전사 키트 (재료표 참조)를 사용해 반응을 설정하세요.
    2. 37°C에서 2시간 배양하여 캡이 된 Cas9 mRNA를 생성합니다.
    3. 전사 반응이 완료된 후, 키트에 포함된 1 μL DNase(농도 2 U/μL)를 첨가하고 완전히 혼합한 후 37°C에서 15분간 배큐하여 DNA 주형을 분해합니다.
  4. 폴리(A) 꼬리 추가하세요
    1. RNA를 14 μL ddH₂O로 끌어올립니다.
    2. 2 μL 10x 대장균 폴리(A) 중합효소 버퍼, 2 μL ATP(10 mM), 1 μL RNase 억제제, 1 μL 폴리(A) 중합효소를 추가합니다.
    3. 37°C에서 45분간 배양하세요.
  5. mRNA를 정제하세요
    1. 반응을 스핀 컬럼 총 RNA 키트에 적용합니다(재료표 참조). 샘플을 2mL 실리카 막 스핀 컬럼에 적재합니다; 원심분리기 8,000 x g, 15초; 버려지는 흐름 통과.
    2. RNeasy 컬럼에 500 μL RPE 버퍼를 추가하고, 8000 x g 에서 15초간 원심분리한 후 잔류 액체를 버립니다. 이 과정을 한 번 반복한 후 2분간 원심분리기로 돌려 남은 액체를 버리세요.
    3. RNeasy 컬럼을 새로운 1.5mL 원심분리관에 넣으세요. RNase 프리 ddH₂O 30 μL 첨가, 8000 x g 에서 1분간 원심분리하여 RNA를 희출합니다. 주입을 위해 mRNA 농도를 500 ng/μL로 조절합니다. 용출된 RNA는 -80 °C에 보관합니다.

4. 초파리 배아의 미세주입

  1. 주입 샘플 준비
    1. 15 μg Cas9 mRNA와 7.5 μg 이중 가닥 gRNA를 2:1 부피비로 혼합합니다.
    2. DEPC 처리된 RNase 없는 물과 함께 30 μL로 조절; 얼음 보관하세요.
  2. 초파리 사육
    1. 주입된 초파리 균주 를 증폭을 위해 대형 식품관에 옮깁니다. W1118 파리는 균형 관련 효과 없이 기저 생리학적 상태를 나타내는 기준 대조군으로 사용되었습니다.
    2. 파리를 25°C, 습도는 60%–70%, 12:12 밝-어둠 주기로 설정한 인공 기후 챔버에서 14일간 보관하세요.
    3. 14일간의 사육 다음 날인 15일차 다음 날 17:00에 성충 파리를 수집하여 타이머에 맞춘 배아 산란을 동기화합니다. 이 특정 채취 시기는 주입에 사용되는 배아가 일정한 발달 단계에 있음을 보장합니다. 하루 중 시간을 조절하는 것은 배아 발달과 생식 행동에 미치는 일주기 리듬 효과를 최소화하여 실험적 재현성을 보장하고 배치 간 생리학적 변동성을 줄이는 데 중요합니다.
  3. 초파리 미세주입
    1. 성충 파리를 채취해 파리 우리에 주입하며, 한 우리당 약 400마리의 성충을 배치합니다. 효모 코팅된 한천 플레이트에 배아를 채집하고; 난자 낳기 후 60분 이내에 배아를 채취하여 커버슬립에 씻어내세요. 주사 전에는 소코리오네이션이 시행되지 않았습니다.
    2. 배아를 커버슬립에 올려 뒤쪽 극이 바깥쪽을 향하도록 위에서 아래로 질서 있게 정렬하세요. 주사 바늘이 배아 길이의 약 5분의 1 정도 깊이로 후극을 관통하여 세포질 전달이 일관되게 하도록 해야 합니다. 총 300개의 배아가 이 연구에서 사용되었습니다.
    3. 입체 현미경으로 바늘 끝과 배아를 같은 평면에 초점을 맞추세요.
    4. 주입 기구를 사용해 후미 극을 뚫고 각 배아에 0.001 μL의 혼합물을 주입합니다.
    5. 주사된 배아를 식품 바이알로 옮기고; 25°C, 상대습도(RH)~70%에서 배양하여 P₀ 생성(주입된 성체가 자손을 낳는 개체)을 얻습니다.

5. 초파리에서 안정 발현 균주 구성

  1. P₀를 Bc/CyO 플라이와 교차 밀폐합니다.
    1. 관심 유전자를 표적으로 하는 gRNA와 Cas9 단백질 혼합물을 w1118 초파리 균주 300개의 배아에 미세주입합니다. 주사 후에는 총 30마리의 생존 가능하고 생식 가능한 P0 성체를 얻습니다. 각 P0 성체(모자이크)를 w1118 균주의 파리와 개별적으로 교배하면 16개의 단일 쌍 교배(8개의 병에서 P0 수컷이 처녀 암컷과 교배), 8병에 P0 암컷이 수컷과 교배됨). 모든 교배자는 일정한 배양 조건에서 25°C로 유지하세요.
    2. F1 유충이 나타나면 P0 부모파리를 제거하세요. F1 자손에서 유전체 DNA를 추출하여 PCR 분석에 적용하여 F1 성체 유전자형(Ent2/+)을 결정합니다.
    3. Bc/CyO 파리 간의 단일 교배로 F2 자손을 생성합니다. 개별 F2 성체를 선택하여 Ent2/CyO 유전자형을 가진 파리를 식별하기 위해 유전자형 분석합니다.
    4. 인터크로스 F3 플라이(Ent2/CyO)는 동형접합 돌연변이의 존재를 평가합니다. 동형접합 파리가 발견되지 않으면, 동형접합 유전자형이 치명적인지 추가 확인하기 위해 Ent2/CyO 간 간 교배를 한 세대 더 진행합니다.
  2. 초파리 유전체 DNA 추출
    1. 성체 파리 1마리 또는 두 마리를 1.5mL EP 튜브에 모아 110 μL 식물 DNA 추출 버퍼 PA를 추가하세요.
    2. 조직 분쇄기를 사용해 최소 3분간 샘플을 완전히 균질화하세요.
    3. 균질체를 65°C 금속 욕조에서 최소 30분간 배양합니다.
    4. 클로로포름 100 μL를 추가하고, 혼합물을 부드럽게 뒤집어 혼합한 후 10초간 소용돌이로 돌립니다. 샘플을 14,000rpm으로 10분간 실온에서 원심분리합니다.
    5. 약 65μL 이상(또는 그 이상)의 상청액을 새 튜브에 조심스럽게 옮기고, 미리 냉각된 절대 에탄올 2부피(최소 10분 이상 4°C에서 미리 배양)를 추가한 뒤, 부드럽게 뒤집어 혼합한 후 -20 °C에서 최소 15분간 배양합니다.
    6. 원심분리기는 14,000rpm에서 4°C에서 10분간 샘플링한 후 상원액을 조심스럽게 버립니다.
    7. DNA 펠릿은 상온이나 인큐베이터에서 완전히 건조될 때까지 자연 건조한 후 적절한 양의 PB 완충제에 재현탁합니다. 여성(f) 샘플의 경우 PB 버퍼 50 μL를, 남성(m) 샘플의 경우 15 μL를 추가합니다.
  3. PCR 증폭과 생거 시퀀싱
    1. gRNA 표적 부위의 상류 및 하류 영역을 감싸도록 설계된 특정 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다.
    2. PCR 산물을 정제하고 생거 시퀀싱에 노출시킵니다. SnapGene 소프트웨어34 를 사용해 시퀀싱 크로마토그램을 분석하고, 비교 분석을 위해 야생형 참조 서열과 일치시킵니다.
    3. gRNA 표적 부위 근처의 피크 플롯에서 인델 돌연변이를 나타내는 겹치는 피크를 확인하라. 피크 스플리팅을 수행하여 혼합 신호를 해소하고 돌연변이 유형을 확인하며, 표적 부위의 삽입 또는 결실을 포함합니다.
    4. Ent2/CyO를 확립하기 위해 4세대에 걸쳐 BC/CyO 수컷과 백교배했습니다.
      참고: Ent2*/Ent2* 및 CyO/CyO 는 초기 발달 단계에서 치명적이라는 것이 관찰되었습니다; 따라서 Ent2*/CyO 이형접합체가 유지됩니다.
  4. Ent2*/CyO 이형접합체를 확립한 후, 같은 배치의 Ent2*/CyO 이형접합체에서 입체현미경으로 샘플을 채취합니다.
  5. 무작위로 20마리의 성체 파리를 선택해 0.001g 해상도의 정밀 저울로 무게를 재세요. 표본을 사진으로 촬영하여 표현형 특성을 문서화하세요.

6. 기술적 표현형 특성화

  1. 후미 120마리의 수컷과 120마리의 암컷(각 그룹당 3개의 바이알, 각 바이알에 20마리의 파리를 포함)을 각각 22°C와 25°C에서 수행했습니다.
  2. 매주 사망자 수를 기록하고 생존 곡선을 그려보세요.
  3. 그룹당 30쌍의 무작위 짝짓기 쌍을 설정하세요; 24시간 교미 허용;
  4. 성체는 신선한 튜브로 옮기세요; 자손 후손.
  5. 폐쇄 후 7일째에 각 그룹당 6회 복제하여 등반 성공률(≥8 cm 상승)을 평가합니다.
  6. 모든 관찰은 돌연변이 계통의 기술적 특성으로 기록되었으며, 유전자 기능 추론에는 사용되지 않았다.

7. 항산화 효소 활성 측정

  1. 300마리의 수컷 성체와 300마리의 암컷 성체(각 그룹당 3개의 바이알을 테스트하며, 각 바이알에 100마리의 파리를 포함함)를 수집하여 이들 생리적 성숙도와 유사한 연령을 확보합니다.
  2. 음식 없이 빈 관으로 날아가 2시간 동안 굶어 대사 상태를 표준화한 후 생화학적 분석이 진행됩니다.
  3. 강철 비드/튜브 하나를 추가하세요; 60Hz에서 균질화, 2분.
  4. 원심분리기 4°C, 161 x g, 10분; 상액을 채취하세요.
  5. 키트 설명서에 따라 총 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD, 재료 표 참조)와 카탈라아제(CAT, 재료 표 참조)를 측정하세요.

8. 데이터 통계 및 분석

  1. 모든 데이터를 평균의 표준오차(± SEM)figure-protocol-1± 평균으로 표현합니다.
  2. 일방향 ANOVA를 사용해 효소 활성 데이터를 비교하고; 체중, 등반 능력, 체장에 대해 유전자형, 온도, 성별의 세 가지 변수 ANOVA를 적용하세요. 적절할 때 Tukey's HSD 사후 검사를 수행하세요.
  3. 모든 통계적 검정에서 유의성을 P < 0.05로 정의하라.
  4. 생존 곡선을 이용해 수명 데이터를 분석하고, 실험 코호트 간 생존 경로에 유의미한 차이가 있는지 평가하는 로그-랭크(Mantel-Cox) 검정을 수행한다36.
  5. 모든 분석 및 플롯은 GraphPad Prism 9.5.0 소프트웨어에서 소프트웨어 지침37에 따라 수행하세요.
  6. 모든 통계 분석은 인과관계 확립을 위한 것이 아니라 기술적 비교만을 목적으로 수행되었습니다.

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결과

Ent2 유전자 표적 부위의 설계 및 효과성 검증 분석
Ent2 유전자의 후보 표적 부위는 CHOPCHOP과 CCTop 플랫폼을 사용하여 설계되었습니다(그림 1). 특이성과 효율성 기준에 따라 엑손 2와 엑손 5 영역을 표적으로 하는 두 개의 gRNA가 선정되었습니다. 유전체 편집 성공을 검증하기 위해, 확립된 Ent2*/CyO 계통의 무작위 선별 개체의 유전체 DNA를 증폭하여 생거 시퀀싱에 적용하였습니다. 시퀀싱 크로마토그램에서는 표적 부위 근처에서 겹치는 피크가 나타나 삽입/결실(indel) 돌연변이와 일치하였다. 추가 서열 분석 결과, 조기 종결 코돈으로 이어지는 프레임 이동 돌연변이가 발견되었습니다(그림 2). 이 결과는 CRISPR/Cas9 시스템이 표적 Ent2 유전자좌에서 돌연변이를 성공적으로 도입했으며, 게놈 편집 워크플로우의 실현 가능성을 입증합니다.

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토론

엔트는 여러 생물학적 과정에 영향을 미치는 진화적으로 보존된 단백질입니다38. Xenopus laevis 난자에서 발현될 때, Ent2는 뉴클레오사이드 수송 활성8을 보입니다. 연구에 따르면 Ent2의 동형접합 돌연변이는 유충 후기나 번데기초기 10단계에서 치명적임이 입증되었습니다. 본 연구에서는 초파리 멜라노가스터에서 Ent2 표적 대립유전자를 생성하기 위해 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 워크플로우가 구축되었습니다. 균주 확립 과정에서 관찰된 동형접합 돌연변이체의 치명성은 이전 보고들과 일치하여 유전체 편집 전략의 타당성을 뒷받침합니다. 이 틀 안에서, 본 연구에서 생성된 Ent2*/CyO 이형접합 계통은 ...

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공개 사항

모든 저자들은 이해 상충을 신고할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 지린성 과학기술개발프로그램(프로젝트 번호 20230505044ZP)의 지원을 받아야 합니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
암모늄 아세테이트Sigma A1542
카탈라아제 (CAT) 분석 키트 (가시광 방법) (암모늄 몰리브데이트 방법)난징 건청 생물 공학 연구소A007-1-1
도데실 설페이트SigmaL3771
주입 장치Eppendorf FemtoJet 4i
선형화된 플라스미드: MLM3613Addgene42251
현미경OLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 키트Thermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 전사 키트Thermo FisherAM1344
PmeI 제한 효소NEB R0560S
폴리(A) 폴리머라제NEBM0276S
프로테아제 KThermo FisherEO0491
RNeasy 미니 키트QIAGEN74104
T7 RiboMAX Express 대규모 RNA 생산 시스템Promega P1320
T7 RiboMAX 키트Promega P1320
총 과산화물 분해효소 (T-SOD) 분석 키트 (하이드록실아민 방법)난징 건청 생물 공학 연구소A001-1
w1118 드로소필라 팡징 바이올로지
수포화 페놀/클로로포름SigmaP2069
```

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