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방법 논문

동일한 식도암 환자로부터 종양 오가노이드, 암 관련 섬유아세포 및 대응 섬유아세포의 형성

532 조회수

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DOI:

10.3791/69548

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2026년 4월 3일

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1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 식도 편평세포암(ESCC) 환자에서 동일한 환자에서 암세포, 암 관련 섬유아세포(CAFs), 비종양 관련 섬유아세포(CF)를 동시에 분리하는 방법을 설명합니다. 이러한 환자 맞춤형 자료의 활용은 환자 간 변동성 문제를 피하고 ESCC 연구에 적합한 실험 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

초록

식도 편평세포암(ESCC)에서는 치료 내성 획득과 종양 재발이 여전히 주요 임상적 도전 과제로 남아 있습니다. 암 관련 섬유아세포(CAFs)는 종양 미세환경의 핵심 구성 요소로, ESCC 진행과 치료 반응에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 종양 악성종양에서 CAFs의 역할에 대한 많은 측면은 아직 알려지지 않았으며, 이는 ESCC 환자의 환자 간 변동성 때문으로 추정됩니다. 연구에 사용되는 다양한 인간 ESCC 세포주가 인간 암의 본질을 부분적으로 모방하는 것으로 여겨집니다. 또한 수년, 수십 년 동안 페트리 접시에서 시험 관 내에서 증식하여 배양 조건에 적응합니다. 더불어, 인간 ESCC 세포주는 원래 환자들 사이에 독특한 유전적 및 후생유전학적 변이를 가지고 있어 환자 간 변이가 발생합니다. 그럼에도 불구하고, 장기 배양된 암세포주는 환자와 일치하지 않는 CAFs에 대한 실험을 위해 대부분의 이전 연구에서 사용되어 왔습니다. 따라서 각 암세포주 내, 그리고 암세포와 CAF 간의 환자 간 변동성은 재현성과 결과의 신뢰성을 감소시킬 수 있습니다. 환자 간 변이성을 제거하기 위해 동일한 환자로부터 세 가지 뚜렷한 세포 유형을 분리하였는데, 외과적으로 박리된 ESCC 영역에서 나온 암 오가노이드와 CAF, 그리고 인접한 비종양 영역에서 온 대응 섬유아세포(CF)를 환자별 대조군으로 사용했습니다. 암 오가노이드, CAFs, CF를 동시에 분리할 수 있는 상세한 프로토콜이 제시되었습니다. 암 오가노이드는 3차원 조건에서 잘 성장했다. CAFs와 CF는 섬유아세포 표지 중 하나인 비멘틴에 대해 양성 염색을 보였으며, 이는 섬유아세포 계통에서 이들 세포의 풍부함을 지지합니다. 이 프로토콜은 ESCC 오가노이드와 환자 간 섬유아세포를 확립할 수 있게 하여, 종양-기질 상호작용 연구에서 환자 간 변동성을 배제하는 귀중한 실험적 플랫폼을 제공합니다.

서론

식도암은 전 세계적으로 높은 발생률과 사망률과 관련이 있습니다. 이 질환은 크게 두 가지 주요 조직학적 아형으로 분류됩니다: 식도 편평세포암(ESCC)과 식도 선암(EAC)2. ESCC는 EAC보다 더 흔하며, 특히 동아시아와 아프리카에서 더 높은 발생률을 보입니다. ESCC 치료 전략은 비교적 확립되어 있습니다 4,5. 점막층에 국한된 초기 병변의 경우, 내시경 절제술이 치료적이고 최소 침습적인 선택지로 권장됩니다. 국소적으로 진행되었으나 절제 가능한 질환이 있는 환자에서는 신보조 화학방사선요법과 식도 절제술의 병행이 임상적 효능을 입증했습니다. 절제가 불가능하거나 전이성 환자의 경우, 전신 화학요법이 치료의 주된 수단으로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 치료 내성과 질병 재발은 여전히 주요 임상적 도전 과제로 남아 있습니다.

종양은 암세포뿐만 아니라 다양한 기질 세포 유형으로 이루어진 복잡한 종양 미세환경도 포함합니다. 그중 종양 미세환경의 주요 세포 구성 요소인 암종 관련 섬유아세포(CAFs)는 종양 진행과 치료 반응성에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다 6,7,8,9. ESCC에서는 CAF가 종양 악성 및 치료 내성에 관여하는 것도 증가하고 있습니다10, 11, 12. 그러나 ESCC 악성 종양의 기저에 작용하는 CAFs의 정확한 분자 기전은 여전히 대부분 불분명합니다.

대부분의 이전 연구에서는 CAF가 암세포에 미치는 영향이 페트리 접시에서 수년, 심지어 수십 년간 증식된 다양한 ESCC 세포주를 사용해 평가되었습니다. 이러한 세포주는 배양 조건에 적응하여 원래 종양과는 거의 닮지 않았다13. 더불어, ESCC 세포주는 서로 다른 환자에서 유래하며, 다양한 유전적·후생유전학적 변이를 가지고 있는데, 이는 각 ESCC 세포에서 명백히 구별되어 환자 간 변이로 작용합니다. 한 암세포주의 실험 결과는 다른 암세포주와 종종 일치하지 않을 수 있습니다. 따라서 서로 다른 ESCC 세포주와 환자 간 불일치 CAFs를 사용하는 실험은 이러한 세포들의 상호작용을 재현 가능하고 신뢰성 있게 정확히 다루는 데 어려움을 초래할 수 있습니다.

이러한 한계를 해결하기 위해, 동일한 ESCC 수술 표본에서 환자 일치 종양 오가노이드(CAFs)와 비종양 섬유아세포(CF)를 동시에 분리하는 프로토콜이 개발되었습니다. 환자 유래 오가노이드는 일반적으로 원발 종양의 주요 구조적 및 표현형 특징을 재현하면서도 분자 이질성을 유지합니다. 기존 오가노이드는 3차원(3D) 배양 조건 하에서 구형체를 형성하며 안정적인 증식 능력을 보였다. CAFs와 CF 모두 섬유아세포 표지자인 비멘틴이 양성인 섬유아세포 집군에 대해 풍부하게 공급되는 것으로 확인되었습니다.

이 프로토콜은 조직 처리, 효소 해리, 오가노이드 시딩, CAF/CF 분리, 통과 및 냉동 보존에 대한 상세하고 재현 가능한 단계를 제공합니다. 연구자들이 구현 전에 적용 가능성을 평가할 수 있도록 실용적인 정보가 포함되어 있습니다: 오가노이드는 보통 3–5일 이내에 형성되고, 7–10일 내에 통과 준비 단계에 도달하며, 10회 이상 안정적으로 확장될 수 있습니다. CAFs와 CF는 최소 8세대 이상 통과될 수 있습니다. 오가노이드와 섬유아세포는 약 20일 이내에 냉동 보존할 수 있습니다. 오가노이드의 정착 성공률은 약 70%, CAF와 CF의 경우 약 80%에 달합니다. 더 나아가, CAF 또는 CF 조건 배지를 이용한 검증된 조건 배지 분석도 포함되어 있어 기질 세포가 종양 오가노이드 행동에 미치는 파라크린 효과를 평가하는 견고한 접근법을 제공합니다. 이 매칭된 종양 오가노이드-기질 플랫폼은 ESCC 종양-기질 상호작용을 연구하고 정밀 치료 전략 개발을 지원할 수 있는 실험적으로 접근 가능하고 생물학적으로 적합한 모델을 제공합니다.

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프로토콜

인간 조직을 사용하는 모든 절차는 적절한 기관의 생물안전 승인 하에 인증된 생물학적 안전 캐비닛 내에서 수행되어야 합니다. 환자는 서면 동의서를 제출했고, 이 프로젝트는 준텐도 대학교 의과대학 연구 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 프로토콜 2부터 6까지의 절차 개요는 그림 1에 나와 있습니다. ESCC 오가노이드 배지(Eso_v1) 내 각 성분의 조성과 농도는 Kijima 등14 및 기타 연구15, 16, 17을 기반으로 소폭 수정만 거쳐 결정되었다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 시약 및 조직 준비

  1. 시약과 장비를 준비하세요.
    1. 시술을 시작하기 전에 가위, 겸자, 피펫을 포함한 모든 기구를 소독하세요.
    2. 15mL 튜브에 인산염 완충 생리식염수(PBS) 10mL를 준비합니다.
    3. 부착이 적은 15 mL 튜브를 준비하고 샘플 출처에 따라 라벨링하세요(예: 종양 세척관(A), 종양 소화 튜브(B), 비종양 세척관(C), 비종양 소화 튜브(D)).
    4. 피펫을 2–3번 흡인하여 태아 소 혈청(FBS)을 투여하여 처리 중 세포 부착을 줄여야 합니다.
      참고: FBS 코팅은 기계적 해리 과정에서 조직 조각이 플라스틱 표면에 달라붙는 것을 방지합니다.
  2. 효소 용액을 준비합니다
    1. 종양 소화용 효소 용액 I 을 준비하는데, 2.7 mL의 Dulbecco's 변형 이글스 배지(DMEM)와 10% FBS 및 1x 페니실린-스트렙토마이신(PS)(이하 DMEM/10% FBS), 0.3 mL 10 mg/mL 콜라게나제, 0.15 mL 10000 PU/mL 분산 물질, 0.03 mL 2.5 μg/mL 암포테리신 B 0.03 mL를 혼합하여 준비합니다. 37 °C로 데웁니다.
    2. 비종양 소화를 위해 2.7 mL DMEM/10% FBS, 0.3 mL 1 mg/mL 콜라겐제, 0.03 mL 2.5 μg/mL 암포테리신 B 0.03 mL를 혼합하여 효 소 용액 II 를 준비합니다. 37 °C로 데웁니다.
      참고: 콜라게나제와 분산은 종양 조직의 해리를 촉진합니다.
  3. 오가노이드 배양 배지 준비
    1. ESCC 오르가노이드 배지(Eso_v1 배지)를 준비하는데, 여기에는 60% 오가노이드 기저 배지, 40% L-WRN 조절 배지18 (1.4단계 참조), 50 ng/mL EGF(성장 인자), 1 mM N-아세틸-L-시스테인(항산화제), 5 mM 니코티나마이드(수용성 비타민), 500 nM A83-01(섬유아세포 성장 방지 억제제), 1개의 B-27(혈청 무첨가 배양 보충제), 1개의 N-2(무혈청 배양 보충제), 10 μM Y-27632(ROCK 억제제)가 포함됩니다.
    2. 사용 전에 매지를 37°C로 평형으로 맞추세요.
      참고: L-WRN 조절 배지(L-WRN 세포의 상원액)는 오가노이드 시작에 필수적인 WNT, R-스폰딘, 노긴 신호를 제공합니다. Y27632는 배양 기간 내내 배지 내에 포함되어 있습니다.
  4. L-WRN 조건화 배지를 준비합니다
    1. L-WRN 세포 바이알을 해동한 후 100mm 접시에 10mL DMEM/10% FBS와 함께 씨앗을 넣고 1–2일간 배양합니다.
    2. 배지를 G418(최종 500 μg/mL)과 하이그로마이신 B(최종 500 μg/mL)를 포함한 10 mL DMEM/10% FBS로 교체하고, 세포가 80% 합류 지점에 도달할 때까지 배양합니다.
    3. 세포를 100mm 접시에 10mL DMEM/10% FBS(G418 및 하이그로마이신 B 포함)와 함께 두 개의 100mm 접시에 전달하여 세포가 100% 합류할 때까지 배양합니다.
    4. 세포를 150mm 접시 5개에 20mL DMEM/10% FBS(항생제 없음)를 투여하여 100% 융합할 때까지 배양합니다.
    5. 각 150mm 접시에서 매체를 흡입하고 버리세요.
    6. 수집 배지(오가노이드 기저 배지에 5% FBS 보충)를 접시당 25mL를 추가합니다.
    7. 24시간 동안 부화하세요.
    8. 다섯 개 접시 모두에서 배지를 모으세요(25 mL × 5 = 125 mL)을 멸균 유리병에 담습니다.
    9. 총 8회의 채취(목표 통합 부피: ~1,000 mL)를 위해 1.4.6–1.4.8단계를 반복합니다.
    10. 병뚜껑 필터를 사용해 고인 CM을 멸균하세요.
    11. 40mL를 멸균된 50mL 튜브 25개에 분할 투여하세요.
    12. 알리코트는 −80 °C에 보관하세요.
  5. 섬유아세포 배양지를 준비하세요
    1. 섬유아세포 중체 1을 준비하세요.
    2. 사용 전에 매지를 37°C로 평형으로 맞추세요.
  6. 휴지 취급 접시 준비하세요
    1. P1000 팁을 이용해 FBS 여러 방울(3방에서 5방울)을 두 개의 100mm 접시에 투여하여 코팅을 만듭니다(종양 조직은 Dish T, 비종양 조직은 Dish N).
      참고: FBS 코팅은 기계적 다진 과정을 더 부드럽게 촉진하고, 작은 조직 조각이 접시 표면에 부착되는 것을 방지합니다.
  7. 조직 취급 및 표본 식별
    1. 종양 및 비종양 표본이 얼음 위에서 운반되는지 확인하세요.
    2. 휴지를 소량의 DMEM/10% FBS가 포함된 60mm 접시에 올려 얼음 위에 보관하세요. 수술 후 16시간 이내에 처리를 시작하여 생존 가능성을 유지하세요.
    3. 종양 조직은 단단한 질감과 불규칙한 표면 형태로 구분하는데, 이는 비종양 조직과 다릅니다.

2. 조직 처리, 세척 및 효소 소화

참고: 이 단계는 다양한 효소 용액으로 다진 종양 및 비종양 조직 절편을 소화하기 위해 수행됩니다.

  1. 종양과 비종양 조직을 다져서
    1. 각 조직 표본(약 5 mm × 5 mm)을 해당 FBS 코팅 접시(종양 조직용 Dish T , 비종양 조직용 Dish N )로 옮깁니다.
    2. 멸균 메스를 사용해 각 조직을 ~0.5mm 조각으로 잘게 만듭니다.
      참고: 더 작은 조각은 효소 접근성을 높이고 소화 효율을 향상시킵니다.
  2. 다진 휴지를 씻어.
    1. 조직 부착을 막기 위해 10mL 피펫에 FBS를 코팅하세요.
    2. FBS 코팅된 피펫을 사용해 각 접시에 5mL의 PBS를 추가하고, 다진 조직을 부드럽게 재현탁합니다.
    3. 현탁액을 해당 종양 세척관(관 A) 또는 비종양 세척관(관 C)으로 옮깁니다.
    4. 2.2.2와 2.2.3 단계를 반복합니다 (총 용량: 10 mL).
    5. 튜브를 실온에서 2분간 두세요; 상청액을 제거하면서 약 0.5–1 mL의 PBS와 조직을 바닥에 남깁니다.
    6. 새 피펫으로 신선한 PBS 10mL를 추가하세요; 피펫에 FBS 코팅을 한 후, 기포 형성을 피하면서 서스펜션을 강하게 피펫 세척하세요.
      참고: 강제 피펫팅은 기계적 해리와 혈액 및 점액 제거를 돕습니다. 기포를 피하면 전단에 의한 세포 해열을 방지할 수 있습니다. 모든 세척 단계는 이물질을 제거하는 데 목적이 있습니다.
    7. 튜브를 실온에서 2분간 두세요; 상청액을 제거하면서 약 0.5–1 mL의 PBS와 조직을 바닥에 남깁니다.
    8. 세척 절차를 두 번 반복하여 총 세 번의 세척을 반복합니다(2.2.6 및 2.2.7 단계).
  3. 조직을 소화관으로 옮기세요.
    1. 새 피펫으로 신선한 PBS 10mL를 추가하세요; 피펫에 FBS를 코팅한 후, 종양 조직은 종양 소화관(튜브 B)으로, 비종양 조직은 비종양 소화관(튜브 D)으로 옮깁니다.
    2. 튜브를 실온에서 2분간 두고, 상원액을 제거하면서 약 0.5mL의 PBS와 조직을 바닥에 남깁니다.
  4. 효소 소화를 수행하세요.
    1. 종양 조직 소화
      1. 효 소 용액 I (콜라겐제 + 분산)의 전체 부피를 종양 소화관(튜브 B)에 추가하세요.
      2. 37°C에서 2시간 동안 부드럽게 돌려 배양하세요.
    2. 비종양 조직 소화
    3. 효 소 용액 II (콜라겐제만 한정)의 전체 부피를 비종양 소화관(D 튜브)에 추가하세요.
      1. 37°C에서 4시간 동안 부드럽게 돌려 배양하세요.
    4. 샘플 출처에 따라 3단계(종양 샘플 처리) 또는 6단계(상대 섬유아세포 시딩)로 진행하세요.
      참고: 종양 및 비종양 조직을 소화하는 데 사용되는 효소 종류와 처리 시간은 사전 실험 최적화를 바탕으로 결정되었습니다. 종양 조직은 종종 밀도가 높은 세포외기질을 포함하고 있습니다; 콜라게나제와 함께 분산되면 소화 능력이 향상됩니다.

3. 오가노이드 및 CAF 분리를 위한 종양 샘플 처리

참고: 이 단계는 동일한 소화된 종양 샘플에서 오가노이드 형성을 위한 상피 종양 세포와 기질 섬유아세포(CAFs)를 분리하기 위해 수행됩니다.

  1. 종양 유래 세포를 걸러내고 수집하세요.
    1. 100 μm 세포 체를 50 mL 원뿔 튜브에 올려놓습니다.
    2. 체에 3mL의 DMEM/10% FBS를 미리 적셔서 적셔야 합니다.
      참고: 사전 습윤은 건조한 메시 섬유에 부착되는 것을 막아 세포 손실을 줄여줍니다.
    3. 종양 소화관(튜브 B)의 모든 내용을 FBS 코팅된 P1000 팁을 사용해 체에 옮겨 소화되지 않은 조직 조각을 제거합니다.
    4. 남은 덩어리를 체에 씻어내기 위해 DMEM 6mL/10% FBS를 추가하세요.
    5. 체를 제거하고 여과수를 튜브 B로 돌려놓으세요(새로운 저부착 15 mL 튜브도 사용 가능).
  2. 여과액을 세척하고 농축하세요.
    1. 튜브를 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
    2. 일회용 피펫으로 상정액을 제거하세요.
    3. DMEM 10mL/10% FBS를 넣고, 부드럽게 역전하여 300 × g에서 5 분간 원 심분리합니다.
    4. 펠릿을 유지한 채 상정액을 조심스럽게 흡입하세요.
    5. 남은 부피를 P200 피펫을 사용해 40 μL로 줄입니다.
  3. 세포를 오가노이드 및 CAF 배양에 할당합니다.
    1. 오가노이드 씨앗을 위해 30 μL을 할당합니다.
    2. CAF 시딩을 위해 10 μL을 할당하세요.
      참고: 이 비율은 경험적으로 병행 확장을 위한 충분한 상피 및 섬유아세포 개체군을 제공합니다.

4. 오르가노이드 씨앗 형성(3D 배양)

참고: 이 단계는 종양 유래 세포 현탁액에서 ESCC 오가노이드를 확립하기 위해 수행됩니다.

  1. 지하실 멤브레인 매트릭스 돔을 준비하세요.
    1. 표준 24웰 플레이트를 37 °C로 예열합니다.
      참고: 판을 예열하면 기저막 매트릭스 돔의 굳화가 가속화됩니다.
    2. 종양에서 유래한 현탁액 30 μL과 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스 90 μL(1:3 비율)을 혼합합니다.
    3. 각 돔당 4개의 우물에 30 μL를 투여합니다.
    4. 돔을 CO₂ 인큐베이터에서 15분간 굳히세요.
  2. 오가노이드 배양지 첨가
    1. 오르가노이드 배지를 미리 혼합한 보충제(FGF10, SB202190 및 항생제(예: 1× 암포테리신 B 및 100 μg/mL 프리모신 사용 시)를 준비하세요.
      참고: 웰 1: Eso_v1; 우물 2: Eso_v1 + 10 μM SB202190; 웰 3: Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10; 웰 4: Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (최종 농도).
    2. 벽을 따라 각 웰에 1mL씩 부드럽게 넣으세요.
    3. 표준 CO₂ 배양 조건에서 배양하세요.
    4. 매체는 3–5일마다 교체하세요.
      참고: 보충제를 미리 혼합하면 소량을 약한 베이스먼트 멤브레인 매트릭스 돔에 직접 피펫 투입할 필요가 없습니다. 항생제는 오가노이드 형성 후 첫 6일 동안에만 추가됩니다. 배양 조건(FGF10 +/-, SB202190 +/-)은 성장 속도와 형태(가능하면 구형)를 기준으로 결정됩니다.
  3. 오가노이드 형성을 모니터링하세요.
    1. 매일 역현미경으로 돔을 관찰하세요.
      참고: 예상 형태: 3일째부터 5일째까지→ 구체가 보이는 것; 7일차부터 10일→ 조밀한 구형 이동 준비.
    2. 오르가노이드가 약 100–200 μm 크기에 도달하거나 돔 밀집이 90% 이상일 때 통과합니다.

5. CAF 파종

참고: 이 단계는 종양에서 유래한 세포 현탁액에서 CAF를 형성하기 위해 수행됩니다.

  1. 콜라겐이 코팅된 접시에 CAF를 씨앗으로 뿌립니다.
    1. 1.5mL의 섬유아세포 배지-1을 담은 콜라겐 코팅 60mm 접시를 준비합니다.
    2. CAF 시딩용으로 할당된 종양 여과액 10 μL를 추가합니다.
    3. 암포테리신 B 1×와 프리모신 100 μg/mL 같은 항생제를 추가하세요.
    4. 표준 CO₂ 배양 조건에서 배양하세요.
    5. 매체는 3–5일마다 교체하세요.
      참고: 경험적으로 섬유아세포 배지-1이 CAFs와 CF의 초기 형성 및 성장에 다른 배지보다 더 적합한 경우가 많습니다. 항생제는 처음 6일 동안에만 추가됩니다.
  2. CAF 성장 모니터링
    1. 3일째에서 5일째 무렵부터 섬유아세포 유사 방추 형태의 출현을 모니터링하세요.
    2. 통과 섬유아세포는 90%–100% 합류율에서 발생합니다.
      참고: 상피세포 오염이 발생할 경우, 섬유아세포는 통과 과정에서 상피세포보다 더 빠르게 분리되므로 트립신화 시간을 조절하여 선택적으로 분리할 수 있습니다.

6. CF 시딩

참고: 이 단계는 인접한 비종양 조직에서 환자 일치 CF를 얻기 위해 수행됩니다.

  1. 비종양 소화제를 세척하고 준비하세요.
    1. 비종양 소화관(튜브 D)을 300 × g에서 5 분간 원 심분리합니다.
    2. 일회용 피펫으로 상정액을 제거하세요.
    3. DMEM 10mL/10% FBS를 넣고, 부드럽게 반전시켜 혼합한 후 300 × g에서 5 분간 원 심분리합니다.
    4. 펠릿을 유지한 채 상청액을 조심스럽게 흡입하세요.
    5. 6.1.3과 6.1.4 단계를 한 번 더 반복합니다.
  2. 콜라겐 코팅된 접시에 CF를 씨앗 뿌립니다
    1. 전체 현탁물을 1.5mL 섬유아세포 배지-1이 들어 있는 콜라겐 코팅된 60mm 접시에 옮깁니다.
    2. 암포테리신 B 1×와 프리모신 100 μg/mL 같은 항생제를 추가하세요.
    3. 표준 CO₂ 배양 조건에서 배양하세요.
    4. 매체는 3–5일마다 교체하세요.
      참고: 항생제는 처음 6일 동안에만 추가됩니다.
  3. CF 성장을 관찰하세요.
    1. 3일에서 5일째부터 섬유아세포와 유사한 방추 형태가 관찰됩니다.
    2. 통과 섬유아세포는 90%–100% 합류율에서 발생합니다.

7. 오가노이드 통과 및 냉동 보존

  1. 오르가노이드 통과.
    참고: 이 단계의 목적은 오가노이드가 적절한 밀도에 도달하면 확장하는 것입니다.
    1. 기존 배지를 흡입한 후 각 매체를 1mL PBS로 세척하세요.
    2. 각 웰에 오가노이드용 미리 가열된 트립신 0.5mL를 첨가합니다.
    3. P1000 팁으로 피펫을 강하게 세척하며, 팁 가장자리를 이용해 베이스먼트 멤브레인 매트릭스 돔을 파괴합니다.
      참고: 기계적 전단은 밀도가 높은 기저막 매트릭스를 분해하여 효소 접근성을 향상시킵니다.
    4. 모든 젤 덩어리가 녹을 때까지 CO₂ 인큐베이터에서 10–15분간 배양합니다. 오가노이드를 20–50개의 세포 덩어리로 분리합니다.
      참고: 완전한 단일 세포 해리를 피하세요. 이는 생존력을 저하시킵니다.
    5. 현탁액을 저부착 용량의 15mL 튜브에 모으세요.
    6. 0.5mL DMEM/10% FBS로 웰을 네 번 세척한 후 모든 세척액을 같은 저부착 튜브로 옮깁니다.
    7. 튜브를 300 × g 에서 5분간 원심분리합니다.
    8. 상원액을 제거하고 펠릿을 최소 DMEM/10% FBS로 재현탁합니다; 서스펜션 부피를 80 μL로 조절하세요.
    9. 오가노이드 현탁액 80 μL과 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스 240 μL(1:3 비율)을 혼합합니다.
    10. 혼합물을 미리 가열한 6웰 플레이트(37 °C) 위에 도금하며, 웰당 4–6개의 돔을 설치합니다.
    11. 돔을 15분간 고체시킨 후, 각 웰당 4.2단계에서 최적이었던 배지(Eso_v1 배지 3mL를 추가합니다.
    12. 매체는 3–5일마다 교체하세요.
      참고: 오가노이드는 직경이 약 100–200 μm에 도달하거나 돔 혼잡이 90%를 초과할 때 통과합니다. 세포 세기는 수행되지 않습니다. 일상적인 아함배양에서는 오가노이드가 1:4에서 1:10의 비율로 나뉩니다. 구체의 빠른 재형성은 48시간에서 72시간 이내에 일어날 것으로 예상됩니다.
  2. 오르가노이드 냉동 보존
    1. 각 제품을 3mL PBS로 세척하세요.
    2. 각 웰에 오르가노이드 트립신 1.5mL를 추가하고, 피펫을 세게 피펫 채취한 후 10분간 배양합니다.
    3. 전체 현탁액을 저부착 15mL 튜브에 모아 웰을 네 번 헹구세요.
    4. 튜브를 300 × g에서 5 분간 원 심분리한 후 상원액을 제거하세요.
    5. 펠릿을 90% FBS/10% DMSO가 섞인 2mL에 재현탁합니다.
    6. 각 크라이오비아에 0.5mL씩 넣으세요.
    7. 바이알을 냉동 용기에 넣고 -80°C에서 하룻밤 보관하세요.
    8. 바이알을 액체 질소로 옮겨 장기 보관하세요.
      참고: 오르가노이드는 직경이 약 100–200 μm에 도달하거나 돔 혼잡이 90%를 초과할 때 저장됩니다.
  3. 동결된 오가노이드 회수
    1. 37°C 물욕에서 크라이오비얼을 빠르게 해동하세요.
    2. 내용물을 5mL DMEM/10% FBS 15mL 튜브에 옮깁니다.
    3. 튜브를 300 × g에서 5분간 원심분리하세요.
    4. 상청액을 제거하고 펠릿을 40–60 μL DMEM/10% FBS에 재현탁합니다.
    5. 현탁액을 얼음처럼 차가운 베이스먼트 멤브레인 매트릭스와 1:3 비율로 섞으세요.
    6. 혼합물을 미리 가열한 6웰 플레이트(37 °C)에 웰당 4–6개의 돔으로 도금합니다.
    7. 돔을 15분간 고체시킨 후, 각 웰당 4.2단계에서 최적이었던 배지(Eso_v1 배지 3mL를 추가합니다.

8. 섬유아세포 통과 및 냉동 보존

  1. CAF와 CF 통과
    참고: 이 단계의 목적은 섬유아세포가 적절한 밀도에 도달하면 확장하는 것입니다.
    1. PBS 2mL로 접시를 씻으세요.
    2. 0.25% 트립신 0.4mL를 추가하세요.
    3. CO₂ 인큐베이터에서 5분간 배양하고, 분리 현미경으로 관찰하세요.
    4. 트립신을 DMEM/10% FBS로 중화시키고, 전체 세포 현탁액을 100mm 배지가 들어 있는 100mm 접시에 옮깁니다.
      참고: 섬유아세포는 90%–100% 합류에 도달할 때 통과됩니다. 일상적인 하위문화의 경우, 1:3의 비율로 나뉩니다. 경험적으로 세포 밀도가 낮을 때 섬유아세포 증식은 느려지거나 중단됩니다.
  2. 섬유아세포 냉동 보존
    1. 세포를 5mL PBS로 세척하세요.
    2. 0.25% 트립신 1mL를 추가한 후 CO₂ 인큐베이터에서 5분간 배양합니다.
    3. 트립신을 DMEM/10% FBS로 중화시키고 전체 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
    4. 300 × g에서 원심분리기를 5분간 돌립니다.
    5. 세포 펠릿을 90% FBS/10% DMSO 2mL에 재현탁합니다.
    6. 각 크라이오비아에 0.5mL씩 넣으세요.
    7. 바이알을 냉동 용기에 넣고 −80°C에서 하룻밤 보관하세요.
    8. 바이알을 액체 질소로 옮겨 장기 보관하세요.

9. 조건 배지 분석

참고: 이 단계의 목적은 조건배지(CM)를 사용하여 ESCC 종양 오가노이드에 대한 섬유아세포의 파라크린 효과를 평가하는 것입니다. 이 분석법은 직접 공동 배양이 아직 최적화되지 않은 상태에서 연질-종양 상호작용 모델을 재현 가능하게 합니다.

  1. CAF/CF 가공 배지 준비
    1. 60mm 접시에서 3mL DMEM/10% FBS에서 같은 수의 CAFs나 CF를 80%–90% 융합률까지 배양합니다.
    2. PBS 2mL로 세포를 한 번 세척하세요.
    3. DMEM 3mL/2% FBS를 추가하세요.
    4. CO₂ 인큐베이터에서 48시간 배양하세요.
    5. 상청액을 15mL 튜브에 모으세요.
    6. 세포 이물질을 제거하기 위해 2000 × g 에서 5분간 원심분리기를 사용하세요.
    7. 상청액 2.5mL를 새로운 15mL 튜브에 채취하세요.
    8. 조절된 배지를 100–500 μL 단위로 나누어 -80 °C에서 보관합니다.
  2. 오가노이드 분석 배지 제조
    1. 1.3단계에서 설명한 ESCC 오가노이드 배지를 준비합니다.
    2. 오가노이드 배지와 조절 배지를 1:1 비율(50% v/v)으로 혼합합니다.
  3. 오가노이드 분석액을 이용한 암 오가노이드 배양.
    1. 7단계에서 설명한 오르가노이드 통과 후, 오르가노이드를 각 웰당 20 μL 기저막 돔 하나로 씨앗 처리하여 미리 가열된 48웰 플레이트(37 °C) 위에 위치시킵니다.
    2. 돔 고화 후에는 각 웰에 0.3mL의 오가노이드 분석액을 첨가합니다.
    3. 오가노이드 분석액은 3일에서 7일마다 교체합니다.
    4. 암 오가노이드의 형태와 크기를 평가하세요.
      참고: 모든 인간 유래 물질은 잠재적으로 감염될 수 있는 것으로 간주됩니다. 장갑, 마스크, 보호 안경 등 적절한 개인 보호 장비를 항상 착용해야 합니다. 콜라게나아제, 디스퍼즈, 디메틸설폭사이드(DMSO)는 피부, 눈, 호흡기 자극을 일으킬 수 있으며; 따라서 직접 접촉과 흡입은 피합니다. 인간 조직을 이용하는 모든 효소 시술은 기관 생물안전 지침에 따라 수행됩니다. 인간 조직이 포함된 액체 폐기물은 밀봉된 생물학적 위험 용기에 수집되어 폐기 전에 오토클레이빙됩니다. DMSO와 효소 용액을 포함한 화학 폐기물은 기관의 유해 폐기물 지침에 따라 처리됩니다. 재사용 가능한 모든 기기는 70% 에탄올로 세척한 후 오토클레이션으로 재사용됩니다.

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결과

조직 샘플은 종양 부위와 종양에서 3cm 떨어진 인접한 비종양 부위에서 채취되었으며, 신보조 화학요법을 받지 않은 ESCC 환자로부터 외과적으로 적출하였습니다. 암 오가노이드와 CAFs는 종양 부위에서 분리되었고, CFs는 비종양 부위에서 분리되었습니다. 수술 조직은 약 0.5mm 크기의 조각으로 잘게 된 후(그림 2A), 효소 치료가 이루어졌고, 이후 암 오가노이드와 섬유아세포를 별도로 분리했습니다. 오가노이드와 섬유아세포는 성장하고 냉동 보존을 위해 세포 재고로 준비하는 데 약 18일에서 21일이 소요되었습니다.

암 오가노이드는 3일에서 5일 동안 눈에 띄는 구체를 형성했고, 7일에서 10일 사이에 유로 준비 상태에 도달했습니다. 종양 조직에서 유래한 오가노이드는 안정적인 형태를 보였으며, 위상 대비 영상 하에서 ≥10회 성공적으로 통과되어 일관된 구형 구조를 형...

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토론

이전 보고서들은 암 오가노이드와 환자 매칭 CAFs를 사용하여 인간 대장암, 유방암, 췌장암, 두경부암에서 CAFs가 증식과 약물 내성에 미치는 역할을 조사했습니다 20,21,22,23,24. 이 연구들은 CAF가 증식과 약물 내성에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 반면, 현재 알려진 바로는 암 오르가노이드와 환자 매칭 CAF를 ESCC 실험에 사용한 사례를 설명한 공식 보고서는 없습니다.

본 연구에서는 동일한 ESCC 환자로부터 암 오가노이드, CAFs, CF를 동시에 분리하여 CAFs의 환자별 대조군 역할을 하는 프로토콜...

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공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 준텐도 대학 젊은 연구자상(2024년과 2025년)과 일본 문부문화체육과학기술성의 과학연구보조금(23K07362, 21K08693)의 지원을 받았습니다. 병리학 및 종양학과, 그리고 식도 및 위장병외과 모든 구성원 여러분께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100mm 접시TPP93100
100배 페니실린-스트렙토마이신 (PS)나칼라이26253-84
15ml 튜브패스트진FG2001
24웰 세포 배양 플레이트TPP92024
48웰 세포 배양 플레이트TPP92448
50ml 튜브패스트진FG2004
60mm 접시TPP93060
6웰 세포 배양 플레이트TPP92006
A83-01케이맨9001799
고급 DMEM/F12 깁코12634010오가노이드 기저 배지 = 고급 DMEM/F12 + 글루타MAX + 1배 PS
Alexa488 항마우스 IgG인비트로젠A11029
암포테리신 B서모피셔15290018
항비멘틴 항체 (V9)산타크루즈SC-6260사용 시 1/500 희석
B-27서모피셔17504044
병뚜껑 필터사르토리우스180F15
셀 스트레이너, 100 및 마이크로; m 모공BD 팔콘352360
콜라게나아제, 제1형시그마C0130
콜라겐 코팅 60mm 디셰이와키4010-010
디메틸 설폭사이드 (DMSO)와코043-07216
디스파스 I고도 슈세이386-02271
둘벡코의 변형 독수리 미디엄(DMEM)나칼라이08459-64
이클립스 Ti2니콘
태아 소 혈청 (FBS)세라나S-FBS-CO-015
섬유아세포 성장 배양체 2프로모션셀C-23020섬유아세포 배양지-1 = 섬유아세포 성장 배양체 2
G418인비보젠앤트-GN-1
글루타맥스 깁코35050061
HFDM-1KSK87-160섬유아세포 매체-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 × PS
Hoechst33342 나칼라이04929-82
하이그로마이신인비보젠앤트-HG-1
IncuCyte 시스템에센 바이오사이언스
L-WRN 세포ATCCCRL-3276
마트리젤코닝354234저저막 매트릭스 = 마트리젤
N2서모피셔17502048
N-아세틸-L-시스테인와코017-05131
니코티나마이드TCIN0078
인산염 완충 식염수(PBS)나칼라이14249-24
프리모신인비보젠ANT-PM-05
재조합 인간 EGFPEPROTECHAF-100-15
재조합 인간 FGF-10PEPROTECHPEP-100-26
SB202190셀렉S1077
메스, 11호깃털8-3086-02
스템풀스미토모 베이클라이트MS-90150저부착 15 mL 튜브 = STEMFULL
트립LE 익스프레스깁코12605028오르가노이드 포 트립신 = TrypLE Express
트립신나칼라이35556-44
Y-27632셀렉S1049

참고문헌

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Abbas, G., Krasna, M. Overview of esophageal cancer. Ann Cardiothorac Surg. 6 (2), 131-136 (2017).
  3. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  4. Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
  5. Lordick, F., et al. Oesophageal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 27 (suppl 5), v50-v57 (2016).
  6. Chhabra, Y., Weeraratna, A. T. Fibroblasts in cancer: Unity in heterogeneity. Cell. 186 (8), 1580-1609 (2023).
  7. Caligiuri, G., Tuveson, D. A. Activated fibroblasts in cancer: Perspectives and challenges. Cancer Cell. 41 (3), 434-449 (2023).
  8. Mezawa, Y., Orimo, A. The roles of tumor- and metastasis-promoting carcinoma-associated fibroblasts in human carcinomas. Cell Tissue Res. 365 (3), 675-689 (2016).
  9. Mezawa, Y., Orimo, A. Phenotypic heterogeneity, stability and plasticity in tumor-promoting carcinoma-associated fibroblasts. FEBS J. 289 (9), 2429-2447 (2022).
  10. Qiu, L., et al. Cancer-associated fibroblasts: An emerging target against esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 546, 215860(2022).
  11. Xue, M., Tong, Y., Xiong, Y., Yu, C. Role of cancer-associated fibroblasts in the progression, therapeutic resistance and targeted therapy of oesophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 13, 1257266(2023).
  12. Dunbar, K. J., Wong, K. K., Rustgi, A. K. Cancer-associated fibroblasts in esophageal cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 17 (5), 687-695 (2024).
  13. Pimkhaokham, A., et al. Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: Possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon. Jpn J Cancer Res. 91 (11), 1126-1133 (2000).
  14. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  15. Fuchino, T., et al. Characterization of residual cancer by comparison of a pair of organoids established from a patient with esophageal squamous cell carcinoma before and after neoadjuvant chemotherapy. Hum Cell. 37 (2), 491-501 (2024).
  16. Shen, S., et al. Advancing precision medicine in esophageal squamous cell carcinoma using patient-derived organoids. J Transl Med. 22 (1), 1168(2024).
  17. Zhang, S., Wang, C. Protocol to establish patient-derived xenograft and organoid for radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma. STAR Protoc. 5 (4), 103273(2024).
  18. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  19. Mashima, Y., et al. KIF24 depletion induces clustering of supernumerary centrosomes in PDAC cells. Life Sci Alliance. 5 (11), e202201470(2022).
  20. Hogstrom, J. M., et al. Simultaneous isolation of hormone receptor-positive breast cancer organoids and fibroblasts reveals stroma-mediated resistance mechanisms. J Biol Chem. 299 (8), 105021(2023).
  21. Schuth, S., et al. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 312(2022).
  22. Farin, H. F., et al. Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses. Cancer Discov. 13 (10), 2192-2211 (2023).
  23. Zapatero, M. R., et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 187 (25), 7335-7349 (2024).
  24. Rademaekers, M., Johansson, E. O., Johansson, E., Roberg, K., Wiechec, E. Tumor-matched and unmatched cancer associated fibroblasts exhibit differential effect on proliferation and FMOD and MMP9 gene expression in head and neck squamous cell carcinoma cells when co-cultured in spheroids. Cancer Cell Int. 24 (1), 190(2024).

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