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방법 논문

렌티바이러스 유발 선관절 병리학을 폴리글루타민 척수소뇌 운동증의 전임상 모델로 활용하다

426 조회수

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DOI:

10.3791/69550

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2026년 3월 13일

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1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

이 논문에서

요약

폴리글루타민 척수뇌 운동실조증은 CAG 확장으로 인해 응집 가능성이 높은 단백질이 생성되어 발생합니다. 이 프로토콜은 벡터 생성, 입체적 전달, 포함물 및 신경 마커 손실 분석을 설명하여, 신경퇴행성 질환의 기전 조사와 표적 치료제를 평가할 수 있는 통제된 플랫폼을 제공합니다.

초록

폴리글루타민 척수뇌 운동실조증은 각 원인 유전자의 코딩 영역 내 트리뉴클레오타이드 CAG 요로의 돌연변이로 인해 발생하는 여섯 가지 신경퇴행성 질환군입니다. 이 돌연변이는 단백질 내 폴리글루타민 확장을 비정상적으로 증가시켜 응집에 취약해지고, 신경 내 포함물이 형성되는 원인이 이 질환들의 특징입니다. 이 질병들의 발병 기전을 이루는 분자적 메커니즘은 복잡하며 완전히 이해되지 않았습니다. 지금까지 이 질병들은 치료가 불가능합니다. 취약한 뇌 영역에서 분자 메커니즘을 이해하는 것은 치료 개발에 필수적입니다. 선택적 취약성을 해결하지는 않더라도 여러 개의 형질전환 라인을 생성하는 시간과 비용 없이 신속하게 메커니즘과 개입을 시험할 수 있는 유연하고 지역별 특이적인 실험 플랫폼이 필요합니다. 최근 몇 년간 저희와 다른 연구자들은 특정 뇌 영역에서 확장된 단백질 발현의 영향을 연구하기 위해 여러 렌티바이러스 기반 모델을 개발했습니다. 이 모델들은 일부 질병 특징을 모방하는 신경병리학적 및 행동적 특징을 보여주며, 발병 기전 이해와 새로운 치료 전략 개발에 중요한 역할을 합니다. 이 논문에서는 SCA2를 예로 삼아 선조체 모델 개발을 설명합니다. 렌티바이러스 벡터 개발 및 생성, 그리고 확장된 아탁신-2(질병 유발 단백질)를 발현하는 벡터의 입체주입을 강조합니다. 마지막으로, 우리는 두 가지 주요 신경병리학적 특징을 특징지어지는데, 포함물의 형성과 신경 마커의 손실입니다. 이러한 주요 병리학적 특징을 재현하는 통제된 플랫폼을 제공함으로써, 이 모델은 신경퇴행의 특정 영역별 기전을 해부하고 표적 치료 중재를 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서론

폴리글루타민 척수뇌 운동실조증(polyQ SCAs)은 CAG 트리뉴클레오타이드 반복 반복 확장으로 인해 다양한 원인 유전자에서 발생하여 암호화된 단백질 내에 독성 폴리글루타민(polyQ) 요로가 형성되면서 발생하는 6개의 상염색체 우성 신경퇴행성 질환 그룹입니다. 그중 가장 흔한 polyQ SCA는 SCA3/마차도-조셉병과 SCA22입니다. 이 질환들은 주로 소뇌와 뇌간을 포함한 특정 뇌 영역뿐만 아니라 선조체 및 기타 부위의 신경세포에 영향을 미칩니다. 그 결과, 점진적인 운동 조정 장애, 보행 장애, 심한 신경퇴행, 조기 사망을 초래합니다3.

폴리큐 SCA를 연구하고 치료 접근법을 시험하기 위해 여러 동물 모델이 개발되었습니다. 형질전환 마우스, 노크인 라인, 조건부 발현 마우스 모델을 사용하여 질병 진행의 분자적 기초와 관련된 세포 경로를 밝히는 데 사용되었습니다 4,5. 그러나 새로운 질병 동물 모델을 생성하는 것은 시간과 비용이 많이 들며, 질병 발병 기전에서 뇌 영역 관여를 연구하는 데는 적합하지 않은 경우가 많습니다6.

렌티바이랄(LV) 기반 마우스 모델은 비용 절감과 뇌의 특정 영역을 연구할 수 있는 보완적 대안을 제공합니다 7,8. 렌티바이러스 벡터는 최대 8 kb의 대형 형질전환유전자를 전달할 수 있게 하여, 생식계 변형 없이도 정의된 뇌 영역에서 병리를 빠르게 유도할 수 있으며, 다양한 연령대의 동물에게도 사용할 수 있습니다. 렌티바이러스 벡터를 표적 뇌 영역에 직접 주입하면 다른 바이러스 벡터에 비해 면역원성이 낮은 병원성 또는 치료 유전자의 영역 특이적 발현을 달성할 수있습니다. 더불어, 산후 분만은 인간 발병9와 더 유사한 조건에서 질병 기전을 조사하기 위해 발달 보상을 피합니다. 발현 수준은 바이러스 용량을 조절하여 조절된 심각도의 표현형을 생성하고 병의 진행 단계별 모델링을 용이하게 하여 조절할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 선택한 프로모터에 따라 세포 유형 특이적 발현을 허용합니다 4,7.

여러 연구에서 다큐 SCA 모델링에 LV 기반 마우스 모델의 실용성과 유용성이 입증되었습니다10, 11, 12, 13. 저희와 연구진은 SCA111, SCA212, SCA311,12, SCA714에 대한 LV 기반 모델을 개발하여, 신경병리학의 핵심 측면을 재현하면서 질병 유전자를 빠르고 영역별로 특이적으로 발현하거나 침묵시키는 플랫폼을 형성했습니다.

요약하자면, 여기서 설명된 렌티바이러스 접근법은 polyQ SCA의 병인 기전을 모델링하는 데 다재다능하고 효율적인 도구를 제공합니다. 현재 동물 모델의 주요 단점을 극복함으로써 이 방법은 개념 증명 연구를 가속화하고 질병 발병, 국소화, 중증도를 더 잘 통제할 수 있게 하여 치료 스크리닝과 분자 기전 연구에 매우 적합한 특징입니다. 여기서는 폴리글루타민 척수뇌 운동실조증의 선조체 렌티바이러스 모델을 생성하고 특성화하는 재현 가능한 방법을 설명하여, 초기 병원성 사건의 상세 분석과 후보 치료제 평가를 가능하게 합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 동물 연구: 생체 내 실험 보고(ARRIVE) 지침과 국립보건원(NIH)의 실험동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 본 연구는 Direção-Geral da Alimentação e Veterinária(DGAV)의 승인을 받았습니다. 이 연구에서는 C57BL/6J 쥐를 사용했으며, 표준 우리에 12시간 빛/12시간 어둠 주기 하에 그룹으로 키워졌으며, 음식과 물을 자유롭게 제공했습니다.

참고: 이 프로토콜에서 사용된 재료는 재료표에 더 자세히 설명되어 있습니다.

1. 렌티바이러스 벡터 포장

참고: 렌티바이러스 매개체와 관련된 모든 절차는 기관의 안전 지침을 따라 BSL-2 실험실에서 수행되어야 합니다. 우리는 4-플라스미드 트랜스펙션 시스템을 사용했는데, 이는 다른 렌티바이러스 생성 시스템에 비해 생체안전성이 더 높기 때문입니다(전송 플라스미드에 대한 자세한 내용은 그림 1 참조).

  1. HEK 293T 세포를 물욕에서 해동한 후, Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 사용해 T75 플라스크에 2 mM L-글루타민, 10% FBS, 1% 펜-연쇄상구균을 보조하여 씨를 채웁니다. 이 완전한 DMEM 매체는 프로토콜의 모든 단계에서 사용되었습니다. 통과 번호 ≤10번의 세포를 사용하여 높은 바이러스 역가와 일관된 결과를 보장합니다.
    참고: 진행 전에 항상 마이코플라즈마 오염 여부를 확인하세요.
  2. 세포가 80%-90% 융합률에 도달하면, 초기 배양물을 1:2로 나누어 2개의 T175 플라스크로 확장합니다. 각 배양 접시당 3.8 x 10x 6 세포(최종 부피 10 mL)를 100mm 배양 접시 20개, 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 배양합니다. 노이바우어 혈구계를 이용해 트리판 블루 배제법으로 세포 수를 세는 방법.
    참고: 세포 스트레스를 줄이고 결과적으로 세포 형질전환을 극대화하기 위해 배지에서 펜-스렙을 제외하는 것을 고려하세요.
  3. 다음 날, 표 1에 설명된 대로 형질전환 혼합물을 준비합니다. 소용돌이로 잠시 회전하며 균질 화합을 합니다. 혼합물을 상온에서 10–20분간 배양하여 DNA: PEI 복합체가 형성되도록 합니다.
  4. DNA: PEI 복합체를 상온에서 15분간 형성한 후, 완전한 DMEM으로 혼합물을 5mL로 조절했습니다.
    각 배양 접시에서 5mL(전체 부피의 절반)를 제거하고, 5mL의 형질전환 혼합물로 교체합니다. 이 방법은 형질전환 중 최종 배양 부피를 10mL로 유지합니다.
  5. 표 1에 설명된 대로 세 가지 포장 플라스미드와 전이 플라스미드를 세포에 트랜스펙트합니다.
    참고: 렌티바이러스 생산에 사용되는 모든 플라스미드는 내독소가 없는 정제 키트를 사용해 준비해야 합니다. 또한, 형질전환 전에 LTR 영역과 형질전환 카세트의 정확성을 확인하기 위해 제한효소 분석을 통해 플라스미드 무결성을 확인해야 합니다.
  6. 각 플레이트에 5mL의 형질전환 혼합물을 점차 추가하고 6시간 배양합니다. 모든 배지를 흡입하고 신선한 배지 10mL로 교체하세요. 48시간 동안 부화하세요.
    참고: 바이러스 역가를 높이려면 48시간에 배지를 채취하고, 각 플레이트에 신선한 배지를 10mL 추가한 뒤 24시간 후에 다시 채취하세요. 이전에 채취한 배지는 4°C에서 최대 24시간 동안 보관할 수 있습니다. 이렇게 하면 농도가 두 배로 늘어나고 바이러스 역가가 증가할 수 있습니다.
  7. 렌티바이러스 벡터가 포함된 모든 조절 배지를 0.22 μm 필터 유닛으로 여과합니다.

2. 렌티바이러스 벡터의 정제 및 적정

  1. 여과된 상청액을 적절한 원뿔형 초원심분리관으로 옮기고, 예를 들어 스윙잉 버킷 로터를 사용하여 65,000 x g 압력으로 4 °C에서 1시간 30분 동안 원심분리합니다.
  2. 상청액을 조심스럽게 버리고 각 펠릿을 1% BSA 1x PBS에 희석한 400 μL 용액에 재현탁하여 기포 형성을 방지합니다. 얼음 위에 최소 1시간 정도 부화하세요.
  3. 1시간 배양 후에는 각 튜브를 부드럽게 섞어 펠릿이 완전히 재현탁되고 균질하도록 한 후, 모든 재현탁된 펠릿을 하나의 튜브로 모으세요.
  4. 원심분리 중 붕괴를 방지하기 위해 튜브를 최소 3분의 2 정도 채울 때까지 1% BSA/PBS로 채우세요.
  5. 65,000 x g 에서 4°C에서 1시간 30분간 원심분리하여 렌티바이러스 벡터를 펠릿으로 분포합니다. 상원액을 조심스럽게 버리고 튜브 가장자리를 멸균 종이로 말리세요.
  6. 렌티바이러스 벡터가 포함된 펠릿을 1% BSA/PBS 45 μL에 재현탁하여 기포를 피합니다. 튜브를 투명 필름으로 밀봉하고 4°C에서 24시간 배양하세요.
  7. 다음 날에는 렌티바이러스 벡터 10 μL 알리코트를 준비합니다. 적정을 위해 10 μL 알리코트를 유지하세요: p24 ELISA 키트는 5 μL, qPCR 키트는 2 μL 제조사 지침에 따라 ELISA와 qPCR을 사용해 렌티바이러스 벡터를 조절하세요.
    참고: 적정 방법의 선택은 감염 단위의 신속한 평가나 정밀한 정량 등 실험적 필요에 따라 달라집니다. p24를 기반으로 한 ELISA는 캡시드 단백질을 정량하여 총 물리적 입자를 측정합니다; 이 방법은 빠르고, 다른 방법보다 비용이 적게 들며, 재현성이 매우 높습니다. 하지만 감염성 입자와 비감염성 입자를 구분하지 못해 기능 역가가 과대평가될 수 있습니다. qPCR을 기반으로 한 적정은 입자에 포장된 바이러스 게놈(vg) 수를 측정하여 유전체 내 바이러스 바이러스 수에 대한 보다 정확한 추정을 제공하고 벡터 제제 간 직접 비교를 가능하게 합니다. 하지만 바이러스 입자의 효과적인 감염력을 평가할 수는 없습니다. 마지막으로, 형광 벡터의 유세포 검사나 항생제 내성 군락 형성과 같은 감염성 기반 분석법은 기능적 전달 단위(TU/ml)를 직접 측정하며 생물학적으로 가장 관련성이 높지만, 더 많은 노동 집약적이고 세포 유형에 의존하며 시간이 많이 소요되고 비용이 더 많이 듭니다15,16.

3. 마우스 선형체에서 양측 렌티바이러스 전달을 위한 입체주술

  1. 동물 조리
    1. 동물의 무게를 재고 필요한 마취 용량을 계산하세요. 복강 내 마취를 10 μL/g 체중 용량으로 레디믹스 용액을 사용해 투여합니다. 이 용액은 0.9% NaCl 7.5 mL, 메데토미딘 500 μL(1.0 mg/mL), 미다졸람 1.0 mL(5.0 mg/mL), 펜타닐 1.0 mL(0.05 mg/mL)를 혼합하여 최종 부피 10 mL를 만듭니다. 마취 유도를 위해 약 10분을 두세요.
    2. 마취 깊이(예: 발가락 집는 반사)를 확인하세요. 양쪽 눈에 안과 연고를 바르고 두피를 면도하세요.
    3. 동물을 입체 택시 프레임 안에 가열 패드 위에 놓으세요. 귀 막대와 바이트 바를 이용해 머리를 위치시키세요.
      참고: 주입할 동물 수와 일정은 실험에 따라 다르며, 특정 가설과 예상 효과량을 바탕으로 사전 통계적 검정력 분석으로 결정되어야 합니다. 예를 들어, 이전 연구인12에서는 주입된 뇌를 주사 후 4주, 8주, 12주에 분석하여 신경병리학적 변화의 진행 여부를 평가했습니다.
  2. 주사기 준비 및 바이러스 부하
    1. 장전할 때는 표준 해밀턴 바늘을, 주사할 때는 26G 둔끝 바늘을 사용하세요. 렌티바이러스 벡터 용액 2 μL을 주사기에 주입하세요. 주사 부위당 바이러스 용량은 p24 항원당 400 ng, 또는 5 x 109 IU/mL10, 12, 17이어야 합니다.
    2. 주사기를 자동 마이크로인젝션 펌프(예: Stoelting)에 장착하세요. 주사기를 주입 모드로 준비해 바늘 끝에 액체 한 방울이 나올 때까지 준비하세요. 베벨이 앞을 향하는지 확인하세요.
    3. 펌프 매개변수를 설정하세요 - 속도: 0.25 μL/분, 반구당 부피: 2 μL, 주사기 종류: 사용 대상에 적합.
      참고: 주입할 양은 설치류 종과 전달할 목표 뇌 부위에 따라 달라집니다. 1 μL 주사는 국소 발현을 유도하며, 최대 10 μL의 더 큰 용량은 매우 느린 주입 속도가 필요하며 조직 파열이나 역류 위험이 더 큽니다.
  3. 선형체 표적 지정과 주입
    1. 두피를 70% 에탄올로 소독하세요. 멸균 메스 칼날로 귀 사이에서 눈까지 중앙선 절개(~1–1.5 cm)를 만듭니다.
    2. 두개골을 노출시키고 세척하며, 면봉으로 골막을 제거하세요. 브레그마를 찾아 입체 제로 포인트를 수동으로 또는 디지털로 기록하세요.
    3. 주입 좌표를 브레그마에 상대적으로 결정하세요(생후 8-12주 생후 약 18-20g의 마우스): 전후(AP) +0.6 mm; 중측(ML) ±1.8 mm; 배배 배 배(DV): –3.3 mm.
    4. 표시된 AP/ML 좌표에서 조심스럽게 연습하세요. 뇌를 침투하지 않도록 천천히 진행하세요. 또는 뼈가 충분히 얇아지면 중단하는데, 이는 두개골을 통과하는 경막 내 혈관을 시각화하는 것으로 나타난다. 작은 바늘로 경막을 조심스럽게 천공하세요.
    5. 주입 바늘을 낮춰 구멍이 올바른 위치에 있는지 확인하세요. 바늘 막힘 여부를 검사해 용액의 일부를 주입해 방울이 뚜렷하게 보일 때까지 검사하세요.
    6. 주사 바늘을 DV 좌표에 천천히 내립니다. 각 반구당 0.25 μL/분에 2 μL 바이러스 용액을 주입하세요. 주사 후에는 5분간 기다렸다가 천천히 바늘을 빼서 역류를 방지하세요.
    7. 야생형 단백질(ATXN2WT형 또는 ATXN3WT형)을 한쪽 반구에, 돌연변이/확장 단백질(ATXN2MUT 또는 ATXN3MUT)을 암호화하는 렌티바이러스를 반대쪽(무작위 또는 미리 정의된 형태)에 주입한다12,13.
      참고: 마우스 뇌 아틀라스18을 사용하면 피질, 해마, 흑질, 소뇌를 포함한 거의 모든 뇌 영역을 입체적으로 표적으로 표적화할 수 있습니다. 소뇌는 SCA에서 병리의 주요 부위이기 때문에, 벡터 전달에 특히 중요한 표적입니다. 이 소뇌 SCA3 마우스 모델 개발을 위해 좌표는 1.6mm 앞쪽에서 람다까지, 중앙선에서 0mm, 복측 1mm로 두개골 표면까지 위치했으며, 입바는 −3.3으로 설정하여 소뇌 피질을 정밀하게 조준할 수 있도록 했습니다.
  4. 수술 중 모니터링
    1. 수염의 움직임과 반사 신경을 모니터링하세요. 움직임이 관찰되면 보충 마취 용량(초기 용량의 3분의 1)을 투여합니다.
  5. 상처 봉합 및 회복
    1. 절개 부위를 3–5개의 중단된 5-0 나일론 봉합사로 봉합하세요. 초기 마취제의 효과를 되돌리기 위해 10 μL/g 체중 용량의 길항성 약물 혼합물을 피하에 투여합니다. 이 용액은 0.9% NaCl 1.5mL, 아티파메졸 500 μL(5.0 mg/mL), 플루마제닐 5.0 mL(0.1 mg/mL), 날록손 3.0 mL(0.4 mg/mL)를 혼합하여 최종 용량 10 mL를 만듭니다.
    2. 동물을 깨끗한 회복 케이지에 넣고 온열 패드 위에 올려놓고 밤새 관찰하세요.
      참고: 주입실에는 이상적으로 벡터 취급을 위한 생물학적 안전 캐비닛이 갖춰져 있어야 합니다. 연구자는 실험복, 장갑, 안구 보호구를 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 모든 폐기물(예: 주사기, 주사기, 오염된 물질)은 기관 및 국가 규정에 따라 생물학적 위험 용기에 폐기되어야 합니다.

4. 조직 채취, 준비 및 처리

  1. 준비
    1. 생쥐 안락사 및 조직 채취를 위한 모든 해리 기구와 필요한 용액(예: 마취, PBS에 4% 파라포름알데히드 [PFA])을 준비하세요.
    2. 미리 4% PFA를 준비하고, 냉동 상태로 보관하며, 사용 24시간 이내에 해동하세요. 관류 전에 용액이 충분히 냉각되도록 하세요.
      주의: PFA는 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비(PPE)와 훈련을 갖춘 훈기 후드 안에서만 다루세요.
    3. 동물을 마취하기 위해 펜토바르비탈(100–200 mg/kg, 복막 내 투여)을 치명적인 용량으로 투여합니다. 발가락 꼬집는 반사가 없으면 깊은 마취를 확인하고; 반사가 계속되면 추가 용량을 투여하세요.
  2. 경심관 관류
    1. 동물을 해부 장치에 위치시키고 고정하세요. 겸자를 사용해 복부 피부를 들어 올리고 가위로 오르는 수직 절개를 합니다(그림 2A, 분홍색 화살표).
    2. 표면 근막을 들어 올리고 간이 보이도록 상부 절개를 하여 복부 장기 손상을 피하세요.
    3. 횡격막을 수평으로 자른 후 절개 부위를 겨드랑이 쪽으로 확장합니다(그림 2A, 흰색 화살표). 흉벽을 반사하고 고정하세요.
    4. 관류 바늘을 좌심실 꼭대기에 삽입하여 심실벽을 관통하지 않도록 합니다. 오른쪽 심방에 가위로 작은 절개를 하세요(그림 2B).
    5. 1-2 mL/분의 유량으로 50 mL의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 경심 관류를 시작합니다.
      참고: 차가운 용액은 종종 뒷부분이 말려 들어가고 근육이 떨리는 현상을 유발하는데, 이는 좋은 관류 상태를 나타냅니다.
  3. 뇌 해리
    1. 뇌를 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 PFA 4%가 들어간 튜브를 준비하세요. 큰 가위로 쥐의 목을 베어라. 시신은 밀봉된 생물학적 위험 가방에 담아 소각됩니다.
    2. 두피를 반사해서 두개골을 드러내세요. 대공을 확인하고, 뇌와 평행하게 가위로 옆으로 절단하여 두개골을 제거하기 시작한다(그림 2C).
    3. 반대쪽에서도 반복한 후, 후각 구구 위 눈 사이 두개골을 절단합니다.
    4. 두개골을 소뇌에서 후각 쪽으로 들어 올려 뇌를 노출시킵니다. 주걱을 사용해 뇌를 뒤쪽에서 앞쪽으로 조심스럽게 제거하고 4% PFA에 4°C에서 24시간 이상 담그지 않습니다.
    5. 침윤액을 20%-30% 자당으로 교체하여 침윤이 완료될 때까지 4 °C에서 배양합니다. 뇌는 처음에 떠 있다가 완전히 침투되면 보통 24시간 이내에 가라앉습니다. 만약 떠 있다면, 배양 기간을 연장해 튜브 바닥에 가라앉게 하세요.
      참고: 이 냉동 보호 단계는 조직의 수분 함량을 줄여 인공물의 동결을 최소화합니다.
      뇌와 튜브를 부드럽게 건조한 후 -80 °C에서 보관하다가 다시 사용할 때까지 보관하세요.
  4. 냉동 절부 및 자유 부유 조직 채취
    1. 절단 전에 냉동조절기를 -20 °C와 원하는 두께로 설정하세요.
      참고: 선조체의 경우, 두께 20-25 μm의 코로나 단면은 구조 보존과 항체 침투 사이에서 이상적인 절충점을 제공하며, 높은 염색 품질과 공간 해상도를 유지하면서도 다루기에 충분한 단면을 만듭니다. 최적의 두께는 세포 구조에 따라 달라질 수 있으므로 다른 뇌 영역에 대해서도 냉동절부 조건을 명시해야 합니다. 소뇌의 경우, 소뇌 피질의 층 구조를 보존하기 위해 25–35 μm 두께의 시상 절면이 일반적으로 권장됩니다.
    2. 뇌를 드라이아이스에 담아 운반하고, 냉동체에서 5-10분 동안 평형을 맞춥니다. 이 단계는 조직 손상을 예방하는 데 중요합니다.
    3. 메스로 후각구를 제거하세요; 부드럽고 자르기 쉬워야 합니다. 완두콩 크기의 신선한 O.C.T. 방울을 표본 디스크에 바르고 소뇌를 접촉시키세요(그림 1D). 뇌를 코로나 절개 수술을 위해 위치를 잡으세요. 동결 후에는 추가로 O.C.T.를 추가해 뇌 전체를 삽입하세요.
      참고: O.C.T.는 상온에서는 투명하지만 완전히 얼면 불투명한 흰색이 됩니다; 반짝이면 냉동체에 더 오래 머물게 하세요.
    4. 표본 원판을 홀더에 장착하고, 각 반구에 있는 두 개의 흰 원이 보일 때까지 다듬습니다. 반구에 다른 치료를 받았다면, 방향을 유지하기 위해 바늘로 한쪽 반구를 찔러 주세요. 나중에 분석할 수 있도록 기록해 두세요.
    5. 섹션 모드로 전환하여 48웰 플레이트에 고운 붓이나 불로 닦은 유리 파스퇴르 피펫을 사용해 자유 부유 조각을 채취하세요.
      참고: 자유 부유 방법은 항체 침투를 개선하고, 배경 침투를 줄이며, 장기 저장을 가능하게 하고, 균일하게 간격을 두고 선공관절을 완전히 덮도록 보장합니다.
    6. 우물에 0.05% 아지드 나트륨을 함유한 PBS를 채우세요.
      주의: 아지화나트륨은 독성이 있으니 PPE를 착용하고 폐기물은 적절히 처리하세요.
    7. 첫 번째 구간은 A1 우물에, 두 번째 구간은 A2에 배치한 뒤 순차적으로 진행하세요. 플레이트가 가득 차면 새 플레이트를 계속 넣거나 웰 A1로 돌아가 전체 선조체가 절단될 때까지 진행합니다(~3개의 완전한 48웰 플레이트). 플레이트를 투명 필름으로 밀봉하고 사용 전까지 4°C에서 보관하세요.
      참고: 전체 선조체 분석의 경우, 판에서 한 개의 열을 선택하면 전체 영역을 대표하는 균등한 간격의 단면이 나옵니다.

5. DAB 염색을 이용한 면역조직화학

  1. 잔여 아지화나트륨을 제거하기 위해 PBS에 3번 세척하세요. 페닐히드라진 용액(PBS에 0.2 - 0.3 mg/mL)을 37°C에서 30분간 배양합니다.
    주의: 페닐하이드라진은 발암성이 있으니, 이 단계는 연기통에서 수행하고 폐기물은 위험한 것으로 간주해 처리하세요.
  2. PBS에 3번 5분, 10분, 10분 차례로 세척하세요. 조직을 1시간 동안 RT에서 차단하고, 10% 정상 염소 혈청(NGS)과 0.1% Triton X-100이 포함된 PBS에 삽입합니다.
  3. 권장 희석도(예: 마우스 항-아탁신-2, 차단액 1:1000)에서 1차 항체를 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 교반하여 인큐베이팅합니다. PBS에 3번 5분, 10분, 10분 차례로 세척하세요.
  4. 비오티닐화된 2차 항체(차단액에 1:200 비율)를 2시간 동안 RT에서 부드럽게 교반하여 인큐베이팅합니다. PBS에 3번 5분, 10분, 10분 차례로 세척하세요.
  5. ABC 복합체에서 RT에서 30–40분간 배양하고, PBS에 3회 5분, 10분, 10분씩 순차적으로 세척합니다.
  6. DAB 용액을 신선하게 준비하세요: 초순수 2.5mL에 1방울 버퍼를 넣고 소용돌이로 돌리세요; DAB와 보텍스 2개 드롭을 추가하고; H₂O₂ 1방울을 넣고 다시 소용돌이로 돌리세요.
    주의: DAB는 발암성 물질이므로, 배기통에서 다루고 폐기물은 적절히 버려야 합니다.
  7. 원하는 염색 강도(보통 1–10분)에 도달할 때까지 DAB 용액에서 각 단면을 개별적으로 현상합니다. 즉시 반응을 멈추려면 PBS로 전환하세요.
    참고: DAB 반응성은 시간이 지남에 따라 감소합니다; 효율적으로 일하세요. 한 번에 여러 구역이 우물에 있을 경우, 이들이 접촉하지 않도록 주의해야 합니다. 이는 염색 과정에 영향을 미칩니다.
  8. PBS에 3번 5분, 10분, 10분 차례로 세척하세요. 젤라틴 코팅된 슬라이드에 단면을 장착하고 완전히 건조시키세요. 슬라이드에 흑연 연필로 라벨을 붙이면 영상 촬영에 방해가 될 수 있습니다.
  9. 탈수, 투명, 덮개는 다음과 같습니다: 증류수에 30초간 담그고, 에탄올 시리즈로 탈수: 75%, 96%, 100%(각각 3분). 자일렌 대체물에 5분간 담은 후 자연 건조하세요. 빠른 경화 매운용 매체를 사용해 커버슬립을 적용하고, 흡기 후드 내부에서 최소 24시간 경화시킨 후 이미징 또는 보관하세요.

6. FIJI를 이용한 쥐 선형체 내 DARPP-32 고갈된 부피 정량화 (ImageJ)

  1. 이미지 획득
    1. 전체 선조체(약 Bregma +1.0에서 –0.5 mm)를 아우르는 관상뇌 단면의 이미지를 촬영하세요. 일관된 조명, 배율(예: 10배), 해상도를 유지하세요. 이미지를 순차적인 파일명(예: Striatum_Bregma_+0.5.tif)으로 TIFF 형식으로 저장하세요.
  2. 피지의 이미지 준비
    1. 피지에서 각 이미지를 열어보세요. 픽셀 크기 보정: 분석 > 스케일 설정으로 이동하세요. 마이크로미터나 이미지 메타데이터에서 알려진 스케일(예: 1 픽셀 = 1 μm)을 사용하세요.
    2. 이미지를 8비트로 변환하기: 이미지 > 유형 > 8비트. 필요하다면 고갈된 영역을 최적으로 시각화하기 위해 밝기/대비를 조절하세요(이 단계에서 임계값 설정은 피하세요).
  3. ROI 고갈된 면적 선택
    1. 다각형, 자유손, 붓 도구를 사용해 DARPP-32로 고갈된 영역(보통 선조체 내 색이 더 밝거나 없음)을 윤곽 표시하세요. 면적을 μm2 단위로 기록하려면 Analyze > Measure로 가세요.
    2. ROI를 저장하려면 ROI Manager로 가서 > Add > More > 저장하거나 배치 분석을 위해 Multi-Measure 기능을 사용하세요.
    3. 관련 뇌 부위에 대해 이 과정을 반복합니다.
  4. 고갈된 부피 계산
    1. 각 단면의 고갈된 면적에 단면 간 거리(단면 두께와 간격에 따라 일반적으로 120 – 240 μm)를 곱합니다.
      단면당 부피(mm3) = 고갈면적(mm2) × 단면 간격(mm)
    2. 모든 구간의 부피를 합산하세요:
      총 고갈된 부피(mm3) = Σ (× 구간 면적)
    3. 선택 사항: 시각화를 위한 오버레이. ROI의 이미지 > 오버레이 > 을 사용해 섹션별로 고갈된 영역을 시각화하세요. 도형의 요약 이미지나 애니메이션을 내보내세요.
  5. 정확한 원-꼬리 지도를 위해 항상 마우스 뇌 아틀라스와 정렬을 확인하세요. 각 반구를 개별적으로 분석하여 일방적 효과(예: WT vs 돌연변이 주사)를 구분하세요.

7. 쥐 선형체 내 단백질 응집체 정량

  1. FIJI를 이용한 수동 정량화
    1. 이미지를 로드하고 보정하세요. 피지에서 이미지를 열어보세요. 픽셀 크기 보정(메타데이터가 포함된 이미지를 사용할 경우 이 단계는 건너뛰세요).
    2. 분석 > 설정 스케일 로 가서 알려진 거리(예: 1 픽셀 = 0.5 μm)를 입력하세요. FIJI에서는 Plugins > Analyze > Cell Counter > Cell Counter를 참고하세요. 초기화를 클릭한 후 이미지를 선택하세요.
    3. 골재에 대해 마커 유형(예: 타입 1)을 선택하세요. 보이는 각 집합체를 수동으로 클릭하여 라벨을 붙이세요. 기록 데이터: FIJI는 셀 카운터 패널에 카운트를 표시합니다. 각 이미지/섹션마다 기록 수를 확인하세요. 수작업으로 내보내거나 매크로를 사용해 결과를 합산하세요.
  2. IHCAggreCount를 이용한 반자동 정량화
    1. 이미지를 업로드하고 처리하세요. IHCAggreCount를 열고 이미지 업로드 (보조 그림 1)를 클릭하세요.
      참고: IHCAggreCount 애플리케이션은 현미경 이미지에서 세포 응집체의 정량화를 간소화하고 표준화하기 위해 우리 연구실에서 독립형 과학 도구로 개발되었습니다. 이 소프트웨어는 이미지 처리, 처리, 선택 보정, 측정 계산 등을 분리하는 모듈식 아키텍처를 사용하여 전적으로 파이썬으로 구축되었습니다. IHCAggreCount는 Windows 10과 Windows 11뿐만 아니라 macOS 13 Ventura와 macOS 14 Sonoma와 완전히 호환되며, 두 플랫폼 모두에서 성공적으로 테스트되었습니다. 기존의 수동 이미지 검사 방법과 비교할 때, 이 소프트웨어는 사용자 주관성을 줄이고, 반복적인 수작업 과정을 없애며, 이미지 처리 속도를 높이고, 측정 재현을 보장하며, 관심 영역을 일관되게 추출하고, 여러 환경을 배치 처리할 수 있다는 등 상당한 분석 이점을 제공합니다. 전반적으로 이 애플리케이션은 전통적인 수동 접근법보다 구형 검출 및 정량화를 위한 더 빠르고 객관적이며 견고한 워크플로우를 제공합니다. 신청서는 저자들이 합리적인 요청 시 제공한다.
    2. 이미지는 원본 이미지 디스플레이에 나타납니다. 처리 탭으로 이동하세요. HiLo를 적용해 집게/배경 대비를 강화하세요(보조 그림 2 참조). 배경에서 집합체를 필터링할 때 밝기 임계값(보충 그림 3)을 적용합니다. 최소 크기 필터를 사용해 작은 입자(노이즈)를 제거하세요(보조 그림 4). 선택적으로 비집합체 형태를 제외하기 위해 원형 임계값(Roundness Threshold)을 적용할 수 있습니다(보충 그림 5).
    3. IHC 집계 검출을 원하시면, 일반 탭에서 '총 집계 계산 '과 ' 집계 면적 계산 '을 클릭하세요. 검출된 모든 집합체는 매트릭스 테이블에 강조 표시되어 나열됩니다(ID, 면적, 평균 크기; 보충 그림 6).
  3. 수동 교정 (선택 사항)
    1. 보정 탭으로 가서 Smart Add를 사용해 선택한 지역의 집계를 자동으로 감지합니다(보조 그림 8). 수동 추가를 사용해 집단에 수동으로 라벨을 붙이세요. 스마트 삭제를 사용해 원치 않는 라벨을 제거하세요. (강조된 골재는 시각적 검사를 위해 표시되며; 보충 그림 7).
  4. 수출 결과
    1. 현재 이미지 데이터를 내 보내려면 CSV 내보내기를 클릭하세요. ' 모두 내보내기' 를 클릭하면 여러 분석된 이미지에서 데이터를 일괄 내보내세요. IHCAggreCount에서 동일한 밝기/대비 설정과 기타 매개변수(예: 임계값)로 이미지를 분석할 때는 항상 IHCAggreCount에서 확인하세요.

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결과

본 연구는 현재 프로토콜을 사용하여 아탁신-2와 DARPP-32의 발현을 성공적으로 확인하였습니다. C57BL/6J 마우스의 선조체에 렌티바이러스 벡터를 입체주입한 후, 12주 후 야생형 및 돌연변이 아탁신-2의 강한 발현이 검출되었습니다. 우리는 이전에12 개의 구조체가 뉴런에 특이적임을 보여주었으며, 이는 mm3당 평균 20,000개의 뉴런을 효과적으로 전달합니다. 실험 조건 하에서 아탁신-2의 면역염색은 야 생형 아탁신-2의 확산된 세포질 분포를 이산 포함체를 형성하지 못한 것을 드러냈습니다(22Q; 그림 3A, 노란색 화살표). 반면, 돌연변이 아탁신-2(104Q)는 구형 형태가 뚜렷한 세포질 집합체를 보였다(그림 3B, 빨간 화살표). 이 응집체들은 야생형 상태...

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토론

이 글에서는 polyQ SCA에 대한 선조체 렌티바이러스 마우스 모델 생성에 대해 설명합니다. 또한 야 생형 및 확장형을 암호화하는 고역가 렌티바이러스 벡터의 생성과 입체성 수술을 통한 생쥐 선형체체에 LV를 양측 주입하는 과정을 설명합니다. 또한 뇌 채취 절차, 조직학적 처리, 질병 특징의 영상 기반 정량화도 설명합니다. 이 방법들을 결합하면 선체체 내 단백질 응집체와 신경 마커 손실을 보여주는 렌티바이러스 polyQ SCA 마우스 모델을 생성할 수 있으며, 이는 다른 뇌 영역에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 목적은 신경병리학적 특징을 질병모델링에 필수적인 구성 요소로 특성화하는 것이지만, 표적 뇌 영역에 따라 행동 변화가 발생할 수 있습니다17. 선조체 내 변이 아탁신-2의 렌티바이러스 매개 발현은, 돌연변이 아탁신-2 주사를 받은 쥐에서 야생형 아탁신...

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

클레비오 노브레가의 연구실은 Cure CSB 프로젝트, 슬로베니아 빌젬 율리얀 희귀질환 아동 협회, 알가르브 생의학센터 연구소(ABC-Ri)의 지원을 받고 있습니다. 이 논문의 저자 중 일부는 Fundação para a Ciência e Tecnologia(FCT)의 박사 펠로우십을 받았으며, 참고인은 Tiago Moreira-Gomes(2022.11008.BD), Inês T Afonso(2022.10161.BD), Rafael G Costa(2022)입니다. 11973.BD).

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% NaClLocal supplier—마취 및 길항제 혼합물 준비용
100 mm 조직 배양 접시SPL Life Sciences11090
ABC kit (Avidin-Biotin Complex)VECTASTAIN Elite
Atipamezole (5.0 mg/mL)Local supplier—메데토미딘 길항제
벤치톱 원심분리기--
Class II Biosafety 캐비넷 (BSL-2 규정 준수)--
바이오틴화 2차 항체--
Bovine Serum Albumin (BSA)NZYTechMB47002
DARPP-32를 면역염색한 뇌 절편 (예: 30–40 µm 관상면 절편)--
Cell Counter 플러그인 (FIJI)Built-in / ImageJ—수동 집합체 계산 도구
CO2 인큐베이터 (37 °C, 5% CO2, 습윤)--
컴퓨터 워크스테이션Local supplier—이미지 처리 및 소프트웨어 실행용
원추형 초원심분리기 튜브Beckman Coulter358126
면봉Local supplier—골막 제거용
Cryostat 및 시편 디스크 홀더--
DAB (Diaminobenzidine)--
Digital stereotaxic coordinate readerStoelting/WPI51725좌표 측정용 디지털 디스플레이
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, 고글루코즈)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
Ethanol 70, 96 및 100%--
Ethanol, 70%Local supplier—두피 소독용
Fentanyl (0.05 mg/mL)Local supplier—마취 성분
Fetal Bovine Serum (FBS), heat-inactivatedGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (ImageJ 배포판)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/집합체 수동 정량화용 오픈소스 소프트웨어
Fine forceps (발가락 핀치용)Local supplier—마취 깊이 모니터링용
Flumazenil (0.1 mg/mL)Local supplier—미다졸람 길항제
Forceps 및 메스Local supplier—골막 제거 및 두개골 노출용
Hamilton 700/1700 시리즈 마이크로리터/Gastight 주사기Hamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203바이러스 용액 로딩용
Hamilton Small Hub 착탈식 바늘 (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205바이러스 전달용
가열 패드 (설치류용)Kent Scientific / SOMNI예: 04-777-177체온 유지용
HEK 293T 세포 (≤ 10회 배양, 마이코플라스마 무)ATCC 또는 동등CRL-3216
과산화수소--
IHCAggreCount 소프트웨어요청 시 제공N/A집합체의 반자동 감지 및 정량화용 소유 소프트웨어
세포 혼잡도용 반전 현미경--
실험실 보류형 믹서--
렌티바이러스 벡터 (WT 및 돌연변이)인하우스 / 코어 시설N/A주사용 바이러스 용액
L-glutamine (200 mM)Gibco/Thermo Fisher25030081
카메라 장착 광학 현미경 (밝은 필드)--
Medetomidine (1.0 mg/mL)Local supplier—마취 성분
Micro-drill (스테레오탁시 호환)Stoelting / Local supplier—두개골 절개용
Microinjection 펌프 (예: Stoelting)Stoelting/WPI53210바이러스 주사용 자동화 주입 펌프
Micropipette (P1000, P200, P10) 및 팁--
현미경 이미지 (IHC 섹션)사내 생성N/A분석할 면역조직화학 이미지
마이크로톰 블레이드 (저프로파일, 일회용)--
Midazolam (5.0 mg/mL)Local supplier—마취 성분
마운팅 미디어--
Naloxone (0.4 mg/mL)Local supplier—펜타닐 길항제
바늘 홀더 및 미세 해부 바늘--
Normal Goat Serum (NGS)-

참고문헌

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