혈전 프로파일링 분석법: 생체역학적 혈전 생성을 포괄적으로 특성화하기 위한 마이크로플루이딕스 기반 플랫폼

Summary

이 연구는 전단 응력을 이용해 혈전 형성을 유도하고, 여러 차원의 판독을 통해 혈전을 특성화하는 마이크로유체 분석법을 설명합니다. 이 검사법은 혈액 샘플의 혈전형성 경향을 측정할 수 있어 질병 진단, 신약 개발, 혈전증과 관련된 기전적 연구에도 유용합니다.

Abstract

혈전증은 혈소판과 혈전 인자가 혈관 내에 비정상적으로 축적되는 병리학적 상태입니다. 많은 연구가 혈전증의 기전으로 용해성 작용제에 의한 혈소판 활성화에 초점을 맞추었지만, 혈류가 혈전 형성을 촉진한다는 점은 종종 간과되어 왔습니다. 특히 동맥에서는 혈전증이 동맥 협착과 관련이 있는데, 동맥 협착증은 혈류의 전단 스트레스를 증가시키고 혈전 생성 과정을 촉진하는 생체기계적 혈전형성 현상입니다. 오랫동안 생체역학적 혈전형성 과정에 대해 전면적이고 상세한 통찰을 제공할 수 있는 바이오어세이가 없었습니다. 이를 해결하기 위해 마이크로플루이딕스와 다색 형광 영상을 결합하여 혈전형성 분석법이 개발되었으며, 이는 혈전의 크기와 조성, 그리고 혈소판 활성화 수준을 포함하는 7개의 측정값으로 생체역학적 혈전 생성을 포괄적으로 특성화할 수 있게 합니다. 이 혈전 프로파일링 분석법은 인간의 혈전 전생 경향과 항혈전제의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 동맥 혈전증의 기전 이해에도 유용합니다.

Introduction

혈전증은 심혈관 질환의 주요 원인으로, 매년 전 세계적으로 수백만 명의 사망을 초래합니다^. 현재 혈전증 위험을 평가하는 표준 임상 환경에서는 생물학적 분석법이 제공되지 않습니다. 상업화된 실험실 및 현장 혈액학 기능 검사 중에서, 기존의 응고 검사와 응집 측정법은 혈전증 또는 주요 부작용 심혈관 사건을 예측하는 데 신뢰할 수 없다는 것이 입증되었습니다 ^2,3,4. 글로벌 혈전증 검사⁵, PFA-100/200⁶, 그리고 글로벌 응고 검사 7,8,9,10,11도 이들의 성능을 뒷받침하는 데이터가 제한적입니다.

현재의 이해에 따르면, 혈전 형성 과정은 주로 세 가지 메커니즘에 의해 이루어집니다. 전통적으로 인정된 두 가지 기전인 생화학적 혈소판 응집과 응고 외에, 연구가 부족하고 종종 과소평가되는 세 번째 기전은 전단 주도 혈소판 응집으로, 이를 '생체역학적 혈소판 응집'이라고도 불렀다^12,13. 생체역학적 혈소판 응력에서 높은 전단 응력과 전단 구배는 GPIbα-von Willebrand 인자(VWF), 인테그린 α_IIbβ 3-VWF, 인테그린 α_IIbβ₃-섬유소균원 상호작용을 통한 혈소판 가교의 주요 원동력이 됩니다. 동맥 혈전증에서는 생체역학적 혈소판 응집이 가장 중요한 메커니즘일 가능성이 높으며, 이는 동맥 협착으로 인한 높은 전단 흐름에 의해 크게 강화되기 때문입니다. 따라서 생체역학적 혈소판 응집에 의해 촉진되는 혈전형성은 '생체기계적 혈전형성'이라고 불렸다^12,14.

이전 연구에서 생체역학적 혈소판 응집을 실험적으로 관찰하는 일반적인 방법은 미세유체 협착 분석법으로, 심한 협착 부위를 직선 채널에 박는 것입니다. 생리학적 벽 전단 스트레스 하에 혈통을 통해 혈액이 관류하면, 협착 부위 주변에 병리학적으로 높은 전단 응력이 발생하여 혈소판이 축적되어 혈전을 형성하게 됩니다. 그러나 이전 연구에서는 혈소판 크기에 따라 단일 판값(혈전 크기를 반영)^{15,16,17,18,19} 또는 최대 두 개(혈소판과 다른 바이오마커 각각 1개)만 ^사용했기 때문에 혈전의 포괄적인 특성 분석에 실패했습니다.

최근 미세유체 협착 분석법에 다색 형광 영상을 통합하여 7가지 바이오마커(혈소판, 섬유소령원 수준, 폰 빌레브란트 인자 수준, P-셀렉틴 발현 수준, 인산과석세린 노출 수준, 확장 인테그린 α_IIbβ₃ 발현 수준, 완전 활성 인테그린 α_IIbβ₃ 실시간 추적을 달성했습니다 발현 수준)을 통해 생체역학적 혈전형성을 포괄적으로 특성화하는 기초가^됩니다. 이 연구에서는 혈전 프로파일링 분석의 준비 및 수행 및 관련 데이터 분석에 관한 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 분석에 필요한 하드웨어에는 역전형 다색 형광 현미경과 마이크로플루이딕 시스템이 포함됩니다. 이 검사법은 비교적 적은 양의 인간 전혈(2 mL 미만)을 사용하며, 비용 효율성이 높으며(샘플당 ~$12), 30분 이내에 결과를 도출합니다. 이 검사법은 개인의 다차원 전혈전 이상을 정확히 검출하고, 항혈전제가 혈전의 크기, 조성 및 혈소판 활성화 상태를 변화시키는 효과를 평가하여 향후 연구 및 임상 목적에 널리 적용될 가능성을 지지합니다²¹. 분석은 반드시 신선하게 채취한 헤파린화된 혈액을 사용해야 한다는 점이 주목할 만합니다. 혈액을 4°C에 보관하거나 6시간 이상 보관하거나 헤파린 이외의 항응고제를 사용하면 혈전이 형성되지 않거나 부정확한 결과가 나옵니다.

Protocol

이 프로토콜은 텍사스 대학교 의과대학 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따르며 승인을 받았습니다. 실험 하드웨어 구성은 마이크로플루이딕 장치, 관류 부품(커넥터, 튜빙, 주사기, 주사기 펌프), 그리고 밝은 시야 및 다색 형광 이미징을 가능하게 하는 광학 부품이 있는 역현미경으로 구성됩니다. 현미경에는 다중 LED 등대와 다중 통과 필터 큐브가 사용되어 4개의 형광 채널을 최소 번갈아 효과로 분할합니다: 여기: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, 그리고 방출: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. 모든 실험 시술 시 장갑, 안구 보호구, 실험복 등 개인 보호 장비를 착용하세요. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 마이크로플루이딕 장치 준비

1. 마스터 몰드를 설계하여 직사각형 채널(폭 200 μm × 높이 50 μm)을 포함하고, 80% 광도 좁음 부위를 포함합니다. 각 채널에는 튜빙 연결을 위한 전용 입구와 출구가 있습니다(그림 1; 원본 설계 파일은 보조 파일 1 참조).
2. 설계에 따라 실리콘 웨이퍼를 사용해 표준 포토리소그래피 를 통해 SU-8 포토레지스트 마스터 몰드를 제작합니다. 15cm 페트리 접시 바닥에 몰드를 테이프로 붙이세요(그림 2A).
3. PDMS 혼합물은 실리콘 엘라스토머 키트에서 프리폴리머 베이스와 경화제를 10:1 무게비로 혼합하여 준비합니다. 혼합물을 마스터 몰드에 부으세요(그림 2B).
4. PDMS 혼합물이 담긴 플레이트를 진공 건조기에 넣어 기포를 제거하고 제거하세요.
   참고: 기포가 완전히 제거될 때까지 최소 2시간 동안 진공청소기로 유지하세요.
5. PDMS 혼합물을 75°C에서 2시간 동안 배양하여 열경화합니다.
6. 마스터 몰드에서 경화된 PDMS를 조심스럽게 잘라내어 개별 칩 유닛으로 나누세요.
7. 프로브 바늘을 사용해 지정된 위치에 구멍을 뚫어 입구와 출구를 만듭니다(그림 2E).
   참고: 구멍에 남아 있는 이물질을 제거할 때는 압축 공기 먼지를 사용하세요. 표면 오염을 최소화하기 위해 접착 전에 접착 테이프로 PDMS 소자를 청소하세요.
8. 화학 후드에서는 작업 물솜에 75% 에탄올을 뿌리고, 적신 작업 물티슈로 유리 슬라이드를 닦고 청소하세요. 유리 슬라이드는 말릴 때까지 두세요.
9. 화학 후드에서는 유리 슬라이드와 PDMS 칩을 각각 고주파 발생기로 30초와 20초 동안 처리한 후, 각 칩을 유리 슬라이드로 정렬합니다. 칩을 유리 슬라이드 표면에 부드럽게 눌러 결합할 수 있게 하세요.
   참고: 이 단계는 화학 후드에서 해야 하는데, 고주파 발생기가 사용 중 오존을 생성하여 건강에 해롭기 때문입니다.
10. 장치를 150°C에서 15분간 인큐베이션하여 열결합합니다. 냉각 후에는 기기를 사용할 준비가 완료됩니다(그림 2F).
11. 기기를 먼지 없는 실온에서 보관하세요.
12. 집게를 사용해 탐침 바늘의 플라스틱 부분을 제거하고 금속 튜브를 90°로 구부립니다. 이 휘어진 튜브들은 마이크로플루이딕 소자의 커넥터로 사용될 예정입니다.

2. 형광 센서 준비

참고: 이 실험은 총 7개의 형광 센서를 사용합니다: SZ22-FITC, 섬유소원-알렉사 플루어 405, 2.2.9-알렉사 플루어 555, AK4-알렉사 플루어 647, 부속 V-퍼시픽 블루, MBC 370.2-알렉사 플루어 555, PAC-1-알렉사 플루어 647. 그중 피브리노겐, 2.2.9, MBC 370.2는 비접액형으로만 상업적으로 구할 수 있으며, 실험실에서 형광 접합이 필요합니다.

1. 파이브리노겐과 Alexa Fluor 405를 결합시키려면:
   1. 신선한 0.1M 중탄산나트륨 버퍼를 만들고, pH 8.5입니다.
   2. 피브리노겐 육수를 인산 완충 생리식염수(PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4)에 희석하여 1 mg/mL로 희석합니다.
   3. 섬유소원(fibrinogen) 용액에 탄산수소나트륨 완충제 1/10 부피를 추가합니다.
   4. 1 mL 피브리노겐과 1 mg 알렉사 플루어 405 NHS-에스터를 혼합한 후 회전 기계 위에서 실온에서 1시간 배큐합니다. 빛으로부터 보호하세요.
   5. 정제 컬럼에서 저장 버퍼를 1,100 × g 에서 2분간 원심분리하여 제거한 후 플로우 스루를 버립니다. 반응 용액을 컬럼에 적재하고, 호환되는 수집 바이알에 컬럼을 장착한 후 1,100 × g 에서 5분간 원심분리하여 피브리노겐-알렉사 플루오 405를 수확합니다.
   6. 분광광도계를 사용해 280 nm(A₂₈₀; 단백질 신호)와 405 nm(A₄₀₅; 염료 신호) 파장에서 흡광도를 측정하세요. 단백질 농도와 F/P 비율(형광: 단백질 몰 비율)을 계산하세요.
      참고: F/P 비율은 8-10 범위 내에 있어야 합니다.
   7. 섬유소원-알렉사 플루오 405는 어두운 곳에서 4°C에 보관하세요.
2. 2.2.9 항체와 MBC 370.2 항체를 Alexa Fluor 555와 결합시키는 방법:
   1. 신선한 0.1M 중탄산나트륨 버퍼를 만들고, pH 8.5입니다.
   2. 항체 스톡을 아민 없는 완충액에 1 mg/mL로 희석합니다.
   3. 항체 용액에 탄산수소나트륨 완충제의 1/10 부피를 추가하세요.
   4. 100 μL 항체와 Alexa Fluor 555 NHS-에스터 1바이알(100 μg)을 혼합하여 로테이터 위에서 실온에서 1시간 배양합니다. 빛으로부터 보호하세요.
   5. 정제 컬럼에서 저장 버퍼를 제거하여 1,100 × g 에서 2분간 원심흡입한 후 플로우 스루를 버립니다. 반응 용액을 컬럼에 적재하고, 호환되는 수집 바이알에 컬럼을 장착한 후 1,100 × g에서 5분간 원심분리하여 2.2.9 또는 MBC 370.2-Alexa Fluor 555를 수확합니다.
   6. 분광광도계를 사용해 280 nm(A₂₈₀; 단백질 신호)와 555 nm(A₅₅₅; 염료 신호) 파장에서 흡광도를 측정합니다. 항체 농도와 F/P 비율(형광: 항체 몰 비율)을 계산하세요.
      참고: F/P 비율은 1에서 1.5 사이여야 합니다.
   7. 2.2.9와 MBC 370.2-Alexa Fluor 555를 어두운 곳에서 4°C에 저장하세요.
      참고: 과도한 라벨링은 피하세요 - 높은 F/P 비율은 생물학적 기능을 저해할 수 있습니다.

3. 인간 대상 혈액 채취

참고: 이 절차는 자격을 갖춘 의료진(예: 면허 간호사, 공인 채혈사)이 시행해야 합니다. 또한, 연구에 참여하는 사람들로부터 서면 동의서를 받으세요.

1. 주사기를 준비하기 위해 혈액 10 mL당 0.32 U/mL 헤파린을 포함한 타이로드 완충제(12 mM NaHCO₃, 10 mM Hepes, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 5.5 mM D-Glucose, 0.5% 소 혈청 알부민, pH 7.4)를 흡인하여 준비합니다.
2. 정맥천자 로 혈액을 채취하세요. 빈 주사기를 사용해 첫 2mL의 혈액을 채취해 버리세요. 그 후 헤파린이 함유된 주사기로 전환하여 혈액 샘플을 채취합니다. 혈소판 활성화를 최소화하기 위해 주사기를 천천히 당기세요.
3. 수집된 혈액을 15mL 원심분리관에 옮기고 37°C 이하로 유지합니다.
   참고: 혈액 샘플은 채취 후 6시간 이내에 실험을 사용해야 합니다.

4. 혈전 프로파일링 분석법

참고: 혈액 취급과 관련된 모든 시술은 실험자에게 혈액이 흐르는 것을 방지하기 위해 가능한 한 생물안전 캐비닛에서 시행하는 것이 권장됩니다. 만약 불가능하다면 벤치탑 스플래시 쉴드를 사용하세요.

1. VWF 단량체를 PBS에서 2 μg/mL로 희석합니다. 마이크로플루이딕 장치에 VWF 단량체를 미리 코팅하고 상온에서 1시간 배양합니다.
2. 형광 센서 세트 1 또는 2로 혈액 샘플을 실온에서 10분간 배양하세요:
   1. 세트 1: SZ22-FITC (0.5 μg/mL), 피브리노겐-알렉사 플루오 405 (60 μg/mL), 2.2.9-알렉사 플루어 555 (1 μg/mL), AK4-알렉사 플루어 647 (1 μg/mL).
   2. 세트 2: SZ22-FITC (0.5 μg/mL), Annexin V-Pacific Blue (1 μg/mL), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), PAC-1-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
      참고: 두 개의 센서 세트를 별도로 사용해야 하므로, 각 혈액 샘플은 완전한 데이터 세트를 얻기 위해 최소 두 번(센서 세트 1과 센서 세트 2 사용) 검사해야 합니다.
3. 마이크로플루이딕 장치를 입구 및 출구 커넥터와 튜빙으로 연결합니다. 입구 커넥터의 반대쪽 끝에는 PBS가 들어있는 튜브를, 다른 쪽 끝은 주사기로 연결하세요. 주사기를 주사기 펌프에 장착하세요. 마이크로플루이딕 장치를 역현미경에 장착하고, 스테이지를 수동으로 조작하여 현미경 아래에서 협착 부위를 찾으세요(그림 3A).
4. 주사기 펌프를 이용해 0.5 mL/min의 유량으로 마이크로유체 채널과 튜빙에 PBS를 채웁니다. 협착 부위 주변에 기포가 없는지 확인하세요.
5. 입구 튜브를 혈액 샘플과 연결하고, 주사기 펌프를 이용해 마이크로플루이딕 채널을 통해 0.018 mL/min의 유량으로 혈액 샘플을 관류합니다(그림 3A).
6. 각 형광 채널의 노출 시간과 이득을 설정하세요. 4개 채널을 번갈아 사용하며 한 번에 한 종류의 형광체를 여기시켜 실시간 다색 형광 이미징을 수행합니다. 한편, 혈전의 초점 평면을 찾아 협착 부위에서 신호를 기록하는데, 보통 15-30분 간격입니다(그림 4).
   참고: 각 채널의 노출 시간은 포화를 피하면서 형광 신호를 쉽게 구분할 수 있도록 조정해야 합니다(그림 4). 현재 시스템에서는 건강한 피험자의 혈액 샘플이 형성된 혈전 내에서 다음과 같은 신호 강도 범위를 일반적으로 전달합니다: SZ22-FITC, 70-110; 피브리노겐-알렉사 플루어 405, 60-100; 2.2.9-알렉사 플루어 555, 70-110; AK4-알렉사 플루어 647, 45-75; 부속 구역 V-퍼시픽 블루, 35-65; MBC 370.2-Alexa Fluor 555, 45-85; PAC-1-알렉사 플루어 647, 10-30. 하지만 주목할 점은, 건강한 피험자 중 소수만이 비정상적인 측정을 나타낸다는 점입니다. 따라서 각 채널의 노출 시간이 적절한지 확인하기 위해 최소 5명의 건강한 피상자의 혈액 샘플을 검사하는 것이 권장됩니다.

5. 데이터 분석

1. ImageJ 1.53(피지, 국립보건원)을 사용하여 데이터 파일을 열어보세요.
   참고: 각 파일에는 4개의 서로 다른 채널에서 총 4개의 동영상이 포함되어야 합니다. 다음 절차는 사용자가 분석하고자 하는 모든 시점에 일반적으로 적용됩니다.
2. SZ22-FITC 채널을 사용해 혈전의 윤곽을 식별하고, '폴리곤 선택'을 사용해 혈전 영역을 대략적으로 선택하세요(그림 5A,B).
3. 각 채널에 대해 이미지 -> 조정 -> 임계값을 사용해 배경을 제거하고(그림 5C), 분석 -> 측정 을 사용해 혈전대 내 신호의 면적과 평균 강도를 측정합니다.
   참고: SZ22-FITC는 혈소판을 염색하여 혈전 크기를 반영합니다. 세트 1에서 피브리노겐-알렉사 플루오 405는 피브리노겐 농축 수준을, 2.2.9-알렉사 플루오르 555는 폰 빌레브란트 인자(VWF) 풍부도를 반영하며, AK4-알렉사 플루오르 647은 P-선택 발현을 반영합니다. 세트 2에서 Annexin V-Pacific Blue는 인산티딜세린(PS) 노출을 반영하고, MBC 370.2-Alexa Fluor 555는 확장된 구조(E⁺ α_IIbβ₃)에_{대한 인테}그린 α_IIbβ 3 활성화를 반영하며, PAC-1-Alexa Fluor 647은 인테그린 α_IIbβ₃ 완전 활성화를 반영합니다(Act. α_IIbβ₃)²¹.

Results

혈전 프로파일링 분석법은 혈전을 좁힌 채널을 통해 혈액을 관류시켜 전단에 의해 형성된 혈전을 형성하고, 형성된 혈전에 대한 다차원 정보를 수집하기 위해 실시간 다색 형광 영상을 수행합니다. 세트 1과 세트 2 센서를 모두 사용하여 실험을 완료함으로써, 혈전의 크기, 가교 단백질(폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐)의 풍부도, 혈소판 활성화 수준(P-선택 발현, PS 노출, 인테그린 α_{IIbβ 3 활성화}로 반영됨) 등 혈전을 특성화할 수 있을 것입니다²¹.

각 실험에서 수집된 데이터는 철저히 분석되어 '신호 대 시간' 곡선(그림 6 참조). 하지만 이 과정은 시간이 많이 소요됩니다. 또는 단일 시점을 선택하여 채널당 한 장의 이미지를 데이터 분석에 사용할 수도 있습니다. 예를...

Discussion

마이크로플루이딕 협착 검사와 다색 형광 영상을 결합함으로써, 혈전 프로파일링 분석은 생체역학적 혈전 생성과 혈소판 기계생물학을 연구하는 데 편리하고 강력한 접근법을 제공합니다. 한편, 이 분석법은 다양한 응용 분야에서 유용합니다. 예를 들어, 생체역학적 혈소판 응집을 특이적으로 억제하는 항혈전제를 스크리닝하는 데 사용될 수 있으며, 분자 표적과 작용 기전은 효과^{바코드 21}에서 추론할 수 있습니다. 또한 특정 인구에서 혈전전생 경향을 연구하여 심혈관 질환 위험 요인의 영향을 식별하고 특성화하며, 개인의 혈전전증 경향을 평가하는 데도 활용될 수 있습니다. 우리는 혈전 프로파일링 검사가 개인의 전혈전 경향을 평가하고 의사들이 환자를 위한 맞춤형 항혈전치료 요법을 개발하는 데 도움이 되는 임상 번역에 유망하다고 믿습니다.

혈전 프로파일링 검사법은 다재다능합니다. 분자 센서는 맞춤형 필...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mL 주사기	헨케 사스 울프	5100-X00V0	혈액 샘플 채취
15mL 매관	제네시 사이언티브	28-101	혈액 샘플 저장
1-mL 가스 밀폐 유리 주사기	해밀턴	81331	하드웨어 조립
2.2.9	메루 배스면역		혈전 착색
20개의 X1/2 프로브 바늘	맥마스터-카	M919	PDMS 장치 제작
20mL 주사기	헨케 사스 울프	5200-X00V0	혈액 샘플 채취
에탄올 70%	시그마-올드리치	EX0281-1	가스 밀폐 주사기의 소독과 유리 슬라이드 세척
AK4-알렉사 플루어 647	바이오레전드	304918	혈전 착색
알렉사 플루어 405 NHS 에스터	인비트로젠	A30000	피브리노겐 표지
Alexa fluor 555 항체 표지 키트	인비트로젠	A88065	MBC 370.2 및 2.2.9 라벨링
부속 구역 V-퍼시픽 블루	인비트로젠	501121505	혈전 착색
청소용 더스터	오피스 디포	911245	PDMS 장치 제작
나무 상자가 있는 공예용 취미용 칼 세트	엑셀 블레이드	44282	PDMS 장치 제작
이온이 탈온된 물과 nbsp;	서모피셔 사이언티픽	751-628	가스 밀폐 주사기 세척
건조기	벨 아르트	F420270000	PDMS 가스 배출
일회용 다목적 실험실 주걱	레브고	17211	실리콘 엘라스토머 베이스와 경화제를 혼합하는 과정;
염료 및 비오틴 제거 스핀 컬럼	제바	A44296S	피브리노겐 표지
피브리노겐	혁신적인 연구	IHUFBG25MG	혈전 착색
퓨전 200-X 주사기 펌프	케믹스 주식회사	0720X	하드웨어 조립
헤파린	시그마-올드리치	H3149	혈액 샘플 항응고
고주파 발생기	일렉트로-테크닉 제품 주식회사	BD-20	PDMS 장치 제작
인간 VWF 단량체	시노 바이오컬리카 주식회사	10973-H08C	마이크로퓨이딕 디바이스 코팅
이미지 J v1.53 소프트웨어	피지, 국립보건원(NIH)		데이터 분석
역현미경	라이카	DM IL 이끄는 것; 필터 큐브: 라이카 DFT51010; 등대: LED5	하드웨어 조립
킴와이프스	킴벌리 - 클라크 프로페셔널	34120	유리 슬라이드 세척
루어 락 캡	인터내셔널 메디컬 인더스트리즈 주식회사	57100B	혈액 샘플 채취
MBC 370.2	케라파스트	EBW104	혈전 착색
현미경 커버 글라스	폴 마리엔펠트 GmbH & KG 중대	ES0107222	PDMS 장치 제작
미니 면도날 스크레이퍼	스탠리	28-100	PDMS 장치 제작
NanoDrop 2000 UV-VIS 분광광도계	써모 사이언티픽	ND-2000	단백질 농도 및 F/P 비율 측정
오븐	랩라인 기기	3512	PDMS 장치 제작
PAC-1-알렉사 플루어 647	바이오레전드	362806	혈전 착색
플라스틱 컵	서모피셔 사이언티픽	S04589	실리콘 엘라스토머 베이스와 경화제를 혼합하는 과정;
SU-8 포토레지스트 마스터  곰핀	UC 샌디에이고 나노3 나노제조 클린룸 시설		PDMS 장치 제작
실가르드 184 실리콘 엘라스토머 키트	크레이든 다우	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	벡먼 쿨터	IM 1756U	혈전 착색
튜빙	콜 - 팔머 인스트루먼트 컴퍼니	06422-01	하드웨어 조립