여기서는 LC-MS/MS 기법을 사용하여 인간 혈장 내 동위원소 표지와 천연 레티노이드를 동시에 정량하는 프로토콜을 제시하며, 검출 한계는 6 fmol on column입니다. 이 방법은 간단한 샘플 추출 절차와 짧은 분석 실행 시간을 포함하여 높은 처리량을 가능하게 합니다.
이 논문에서
요약
초록
레티놀 동위원소 희석(RID) 방법은 인간의 비타민 A 풀과 안정 동위원소 희석을 통해 체내 비타민 A 전체(TBS) 저장량을 추정합니다. 이를 위해 질량분석법을 통해 표지된 레티놀과 비표지된 레티놀의 혈장 동위원소 비율을 정확하고 효율적으로 결정하는 것이 매우 중요합니다. 준비 HPLC 및 유도화 같은 광범위하고 시간이 많이 소요되는 추출 및/또는 정제 절차를 피하기 위해, LC-MS/MS를 사용하여 표지된 레티노이드와 비표지된 레티노이드를 빠르고 민감하며 동시에 분석합니다. 이 방법은 두 가지 수준의 검출을 사용합니다: (i) 초기 모(전구) 이온의 질량/전하(m/z) 분리, 이어서 (ii) 파편화된 딸(생성물) 이온을 검출합니다. 이로 인해 레티놀 검출 한계가 6 fmol까지 높은 감도를 갖게 됩니다. 탠덤 질량분석법의 장점에도 불구하고, 이온화 과정에서 말단 관료기가 손실되어 유사한 모이온(m/z) 및 자손 이온 분쇄 패턴이 나타나기 때문에 레티놀과 레티닐 에스터를 분리하려면 액체 크로마토그래피 분리가 필요합니다. 이 논문은 용매 추출을 통해 혈장에서 내인성 및 표지된(13C 또는 2H) 레티놀을 분리한 후, 대기압 화학 이온화(APCI) 양이온 모드에서 LC-MS/MS로 정량화하는 과정을 설명합니다.
서론
비타민 A는 인체 건강에 필수적인 지용성 영양소입니다. 비타민 A 결핍은 심각한 감염성 이환율과 사망률에 대한 감수성을 높이며, 전 세계적으로 29%의 유병률을 가진 것으로 추정되며, 사하라 이남 아프리카(48%)와 남아시아(44%)에서 더 높은 수준입니다2. 비타민 A 보충제는 특히 사하라 이남 아프리카와 같은 고위험 지역에서 과도한 아동 사망률을 줄이는 효과적인 전략입니다. 그러나 반기별 비타민 A 보충제의 도입과 대규모 비타민 A 강화 및 미량 영양소 분말 분배가 여러 공공 및 민간 기관을 통해 관리되는 경우, 과도한 비타민 A 섭취에 노출될 가능성이 있습니다 4,5,6,7,8,9,10 . 따라서 비타민 A의 바이오마커는 이상적으로는 결핍부터 독성까지 비타민 A 상태의 전 스펙트럼을 포괄할 수 있어야 합니다. 레티놀 동위원소 희석(RID) 방법은 현재 인간의 총 비타민 A 저장량을 간접적으로 평가하는 가장 정확한 방법이며, 간 내 비타민 A 농도에 대해 검증되었으며, 비타민 A 상태의 가장 좋은 생화학적 지표로 간주됩니다14,15. 이 방법은 안정 동위원소 표지된 비타민 A 경구 추적 용량이 표지되지 않은 비타민 A(트레이스)와 교환 가능한 체내 풀에서 혼합된다는 원리에 기반합니다. 투여 후 특정 시점에 혈장 레티놀 특이적 활성(즉, 표지된 레티놀 추적자와 혈장 내 총 레티놀 비율(혈장 내 추적자/추적 비율))을 측정하면 RID 식(11,12,13)을 사용하여 비타민 A 상태를 추정할 수 있습니다.
혈장 내 레티놀 추적자와 추적자의 정확하고 정확한 농도를 결정하기 위해, 가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS), 동위원소비율 질량분석법(IRMS), 액체 크로마토그래피 탠덤 질 량분석법(LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22 등 안정 동위원소 표지된 비타민 A를 정량화하는 다양한 방법이 적용되었습니다.23, 24, 25, 26. 중요한 점은, LC-MS/MS가 높은 민감도, 특이도, 조작 간편성을 결합하여 복잡한 매트릭스에서 천연 레티놀과 라벨링 레티놀을 직접 측정할 수 있다는 점입니다. 따라서 IRMS용 준비 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)나 GC-MS용 유도화와 같은 시간이 많이 드는 샘플 준비를 피하기 위해, LC-MS/MS 분석은 추출 절차가 간단하고 안정 동위원소에 대한 검출 한계가 매우 낮으며, 짧은 실행 시간이 7,18,19. 여기서는 더 짧은 실행 시간, 단순한 워크플로우, 높은 민감도와 선택성을 결합한 업데이트된 LC-MS/MS 방법을 제시하여, 비타민 A 전체 저장량 측정이 필요한 대규모 인간 개입 및 관찰 연구에서 샘플을 고처리량으로 분석하는 데 매우 적합한 방법입니다.
프로토콜
이 연구는 필리핀 대학교 마닐라 연구 윤리 위원회(IRB ID: UPMREB 2016-282-01), UC 데이비스 기관심사위원회(IRB ID: 903681-2)의 승인을 받았으며, ClinicalTrials.gov 등록(ID: NCT03030339)에 등록되었습니다. 이 연구는 가나 보건 서비스 윤리 심사 위원회(GHS-ERC 012/07/20)에서 승인되었으며, https://clinicaltrials.gov 년에 NCT04632771 등록되었습니다.
1. 내부 표준 작성
- 내부 표준 용액: 0.1% 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT; w/v)을 함유한 에탄올에 1 mg/mL 레티닐 아세테이트 농도로 내부 정액을 준비합니다. 재고 용액을 알리코트(알리코트)로 나누어 -80 °C에서 최대 3개월간 보관하세요.
참고: 내부 표준체의 경우, 표지되지 않은 레티닐-아세테이트 또는 표지된 레티닐 아세테이트 중 하나를 사용하는 것이 가능합니다. 비표지된 레티닐-아세테이트 표준을 사용할 경우, 레티닐 아세테이트와 레티놀 피크의 기준선 해상도를 반드시 얻는 것이 중요합니다( 그림 1 참조). - 내부 표준 작업 용액: 기본 표준 액체(1 mg/mL)를 1 μg/mL로 희석하여 내부 표준 작업 용액을 준비합니다. 먼저 기본 표준 60 μL을 300 μL 에탄올로 희석한 후, 이 용액 60 μL를 10,000 μL 에탄올에 희석합니다. 각 샘플마다 20 ng의 레티닐-아세테이트를 포함한 작동 내부 표준 용액 20 μL가 첨가됩니다.
참고: 내부 표준 작동 용액은 -20 °C에서 최대 1주일간 보관할 수 있습니다.
2. 교정 표준 준비
- 보정 표준 물질: 0.1% BHT(w/v)를 함유한 에탄올 내 1 mg/mL 레티놀 농도로 보정 표준 용액을 조제하여 추적자와 추적자 모두에 사용합니다. 정액을 담아 최대 3개월간 -80°C에서 보관하세요. 동결-해동 사이클을 피하려면 각 알리콥터를 한 번만 사용하세요.
- 보정 표준 작동 용액: 보정 표준 용액 100 μL를 추출하여 10,000 μL 에탄올로 부피식 플라스크에 희석합니다. 석영 큐벳을 사용해 분광광도계에서 희석된 보정 재고 용액의 농도를 325nm에서 측정합니다(자세한 내용은 표 1 참조).
- 희석된 보정 표준 성분을 추출하여 50% 에탄올과 50% 아세토니트릴/dH2O(70:30 (v/v))를 사용해 트레이스는 8 μM, 추적자는 2 μM로 농도를 조절합니다.
- 50% 에탄올과 50% 아세토니트릴/dH2O(70:30 (v/v)를 사용하여 7가지 서로 다른 농도의 이중 보정 표준을 준비합니다. 200 μL의 플라즈마를 추출할 경우, 트레이스 보정 표준은 6 μM에서 0.03 μM 사이, 추적자 보정 표준은 0.5 μM에서 0.004 μM 사이여야 합니다.
참고: 정확한 정량화를 위해 혈장 내 동위원소 표지된 레티놀과 레티닐 에스터는 중복된 7점 보정 곡선을 사용하여 정량화합니다27. 보정 곡선의 최고 지점(혈장 내 트레이시와 트레이서의 최고 예상 농도의 두 배)은 원래 혈장 부피에서 재구성된 추출물의 농도 계수를 고려합니다.
3. 혈장에서 레티노이드 추출
- -80 °C 냉동고에서 혈장 샘플을 꺼내 상온(약 30분)에서 해동합니다.
- 해동이 완료되면 각 샘플을 소용돌이로 돌리고 몇 초간 돌려 뚜껑 안에 플라즈마가 남지 않는지 확인합니다. 그 후 샘플을 얼음에 올려놓으세요.
- 냉장 원심분리기를 켜고 4°C까지 식히세요. 15mL 유리관에 스크류 캡(피험자 ID 및 시점)을 라벨링하고, 각 샘플 튜브에 200 μL 탈이온수(dH2O)를 피펫으로 주입합니다.
- 내부 표준 작동 용액에서 내부 표준 혼합물 20 μL를 유리관에 피펫 주입합니다.
- 피펫을 사용해 내부 표준액과 dH2O가 포함된 튜브에 200 μL의 혈장을 투여합니다.
- 각 샘플 튜브에 400 μL의 에탄올을 피펫팅한 후 튜브를 돌려 에탄올과 혈장을 혼합합니다. 유리벽에 단백질 잔여물이 달라붙지 않도록 소용돌이 방지를 하세요.
- 첫 헥산 추출 시에는 각 튜브에 헥산을 2mL 넣고 튜브 뚜껑을 단단히 고정하세요.
- 튜브를 궤도 셰이커에 넣고 15,000rpm으로 30분간 흔듭니다. 튜브를 냉장 원심분리기로 옮기고 1,800 x g 에서 4 °C에서 10분간 회전시킵니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용해 상청액을 깨끗한 라벨이 붙은 유리 시험관으로 옮깁니다. 단백질, 침전물, 물이 옮겨지지 않도록 주의하세요.
- 남은 잔류물에 헥산을 추가로 2mL 추가하여 두 번째 헥산 추출을 하고, 튜브 뚜껑을 단단히 고정한 뒤, 튜브를 궤도 셰이커에 넣고 15분간 15,000rpm으로 흔듭니다.
- 튜브를 냉장 원심분리기로 옮기고 1,800 x g 에서 4 °C에서 10분간 회전시킵니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용해 각 샘플의 첫 헥산 추출(단계 3.9)에 담긴 상원액이 담긴 유리 시험관으로 상원액을 옮깁니다.
- 혼합된 헥산 추출 용매(각 샘플마다 1차 및 2차 추출 상청액)를 어두운 연기 후드에서 부드러운N2 흐름 아래 약 30분간 증발시킵니다. 가열 블록을 35 °C로 설정하세요.
- 건조된 잔여물을 50 μL 에탄올에 재현탁한 후 잠시 소용돌이치고, 50 μL 이동상(70:30 아세토니트릴/dH2O (v/v))을 추가한 후 다시 소용돌이 부탁합니다.
참고: 레티닐-에스터를 정량화하는 목적이 있을 때만 100 μL 에탄올을 사용하여 건조된 잔기물 재현탁을 수행해야 합니다. - 표지된 0.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 원심분리기는 16,900 x g 에서 5분간 돌립니다.
- 재구성된 잔여물 80 μL을 300 μL 삽입물이 포함된 호박색 HPLC 바이알에 옮깁니다. 증발로 인한 용매 손실을 막기 위해 즉시 바이알을 뚜껑으로 덮으세요.
- 유리 바이알을 냉동상자에 옮기고, 연구 이름, 추출일, 샘플 ID를 라벨로 붙인 후 -80°C 냉동고에 보관하여 분석할 때까지 보관합니다.
참고: 저장된 샘플 분석은 3-5일 이내에 완료되어야 합니다. 일반적으로 200 μL의 혈장 부피가 투여 후 최대 90일까지 라벨링된 비타민 A 추적자를 검출하기에 충분합니다. 하지만 플라즈마/물/에탄올의 비율이 1:1:2로 유지된다면 플라즈마 부피는 400 μL까지 조절할 수 있습니다.
4. 내부 표준 통제 샘플 준비
- 에탄올/이동상 용액을 120 μL의 에탄올을 마이크로 원심분리관에 피펫팅하고, 200 μL (70:30) 아세토니트릴/dH2O (v/v) 용량을 추가하여 소용돌이 처리하여 에탄올/이동상 용액을 준비합니다.
- 세 개의 별도 0.6 mL 튜브에 내부 표준 작동 용액 20 μL 피펫을 넣습니다.
- 에탄올/이동상 용액 80 μL을 추가한 후 소용돌이를 보입니다. 세 개의 내부 표준 대조 샘플을 300 μL 인서트가 포함된 호박색 HPLC 바이알로 옮기고, 증발로 인한 용매 손실을 방지하기 위해 즉시 바이알을 뚜껑으로 덮으십시오.
5. 플라즈마 하우스 표준
- 하우스 표준 샘플을 준비하기 위해, 분석 실행당 최소 3개 샘플을 분석할 수 있을 만큼 충분한 혈장 부피를 확보해야 합니다. 총 필요한 혈장 부피는 분석해야 할 샘플 수에 의해 결정됩니다.
- 알리코트는 표준 플라즈마를 각 분석 작업마다 필요한 부피의 작은 크라이오비얼에 저장하고 -80 °C에서 저장합니다.
참고: 하우스 표준에는 미확인 샘플에 사용되는 동위원소 표지된 레티놀 추적자가 반드시 포함되어야 합니다. 자원봉사자 샘플을 하나의 알리코트로 모아 충분한 물질을 얻을 수 있습니다. - 3단계에서 수행한 대로 미지의 플라즈마 샘플과 같은 부피로 각 분석 실행마다 최소 3개의 플라즈마 하우스 표준 샘플을 추출합니다.
- 플라즈마 하우스 표준 물질을 샘플 선반 전체에 배치하고, 그 사이에 최소 10개의 미지의 플라즈마 샘플을 배치하세요. 플라즈마 하우스 표준을 사용해 일중 및 낮 간 변동을 계산하세요.
6. 외부 표준 샘플
- 인증된 외부 표준 샘플을 확보하여 -80 °C에서 보관하세요. 널리 사용되는 인증된 외부 표준으로는 NIST 표준 참조 자료 SRM 968이 있습니다.
- 3단계에서 미지의 플라즈마 샘플과 같은 부피로 분석당 최소 4개의 외부 표준 혈장 샘플을 추출합니다. 외부 표준 샘플을 사용하여 얻은 결과의 정확성을 검증하세요.
7. 수동 복합물 최적화
- APCI 가열 네뷸라이저 프로브가 MS 소스 하우징에 설치되어 있는지 확인하세요. 각 안정 동위원소 추적자에 대해 약 1 μg/mL 용량으로 주입액을 준비합니다.
참고: 용액은 이동상과 유사해야 하며, 프로톤화를 위한 산을 포함해야 합니다. 좋은 용매는 1:1 아세토니트릴/dH2O에 0.1% 개미산(v/v)을 사용하는 것입니다. - 1mL 루어록 해밀턴 주사기에 주입액을 채운 후, 접지 유니온을 통해 PEEK 튜브로 주사기를 공급원에 연결합니다. 주입 유량을 10 μL/s로 설정하세요.
- 수동 튜닝을 선택하고 악기가 튜닝 및 캘리브레이트 모드에 있는지 확인하세요. 주사기 펌프를 작동시키고 양성 모드에서 Q1 스캔 유형을 선택하세요.
- 목표 화합물의 분자 질량보다 약 100 Da 높은 낮은 질량 범위와 약 100 Da 높은 상한 질량 범위를 설정합니다.
- 사이클을 500으로 설정하고, 스캔 속도는 200 Da/s로 설정하세요. 시작 을 클릭하고 질량 스펙트럼 창에서 신호를 관찰하세요.
- 신호가 안정될 때까지 기다렸다가 예상되는 m/z 피크가 나타나는지 확인하세요. MS가 양의 모드에 있으므로 [M+H]+ 및 [M+2H]2+ 피크를 고려하자.
- 목표 최대 높이는 1e6 정도여야 합니다. 총 이온 전류(TIC)는 1e7-1e9여야 합니다. 신호가 안정될 때까지 계속 주입한 후 멈추세요. 주입액 내 화합물에서 높은 강도의 뚜렷한 봉우리가 형성되어야 합니다. 총 이온 전류(TIC)가 표시되며, 이는 모든 이온의 총 신호를 보여줍니다.
참고: 12C 레티놀의 예상 질량은 269 Da이므로 [M+H]+ 및 [M+2H]2+ 이온을 나타내기 위해 50-300 Da 범위가 적합합니다.
8. 생성물 이온(MS2) 스캔 / CE 스펙트럼 검사
- 시작 질량을 더 낮은 질량, 예를 들어 50 Da, 그리고 Stop 질량을 Q1 질량 바로 위(예: 12C 레티놀 269.1)에 설정하세요. 사이클을 5로 설정하고 충돌 에너지(CE)를 10으로 변경하세요. 전구체 이온으로 Q1 질량을 확인해 보세요. 작은 조각이 나타나지 않으면 CE를 20으로 올립니다.
- CE가 증가할수록 더 많은 생성물 이온이 형성됩니다. 스펙트럼 오른쪽의 전구체 이온이 완전히 사라질 때까지 CE를 계속 증가시키세요. CE를 더 높여 잠재적인 2차 파편화를 관찰할 수 있습니다.
9. MRM 스캔
- MS2 스캔에서 가장 풍부하거나 적합한 세 가지 생성 이온을 선택하여 추가 최적화를 위해 가져갑니다.
- 각 곱물 이온에 대해 Q1(전구체) 질량과 Q3(생성물) 질량을 입력합니다. Dwell Time을 200ms로 설정하세요. 각 단편의 이름을 그에 맞게 명명하세요(예: 12C_Frag_93).
- 충돌 에너지를 선택하고 램프 기능을 사용하여 최적의 CE 값을 식별합니다. 각 조각별로 최적화된 CE 값으로 CE 열을 채웁니다.
- 등압 간섭을 최소화하기 위해 CE 최적화 후 탈클러스터링 전위(DP)를 최적화합니다. 한 번에 한 번에 한 번의 전이로 충돌 셀 출구 전위(CXP)를 최적화합니다.
10. 원천/가스 최적화
- 이 매개변수들은 자동으로 최적화할 수 없습니다. 신호 강도를 개선해야 한다면 수동 최적화 과정을 수행하세요. 한 번에 한 가지 매개변수를 변경하고 신호가 증가했는지, 변하지 않았는지, 감소했는지 비교하세요.
11. 액체 크로마토그래피 조건
- 크로마토그래피의 경우, dH2O (A) 내 0.1% (v/v) 포름산과 아세토니트릴(B) 포메믹 산 0.1% (v/v) 이진 이동상 구배를 사용한다.
- 적용되는 LC 시스템에 따라, 4mm x 2mm C18 카트리지(HPLC)가 장착된 100mm x 2.1mm(3μm) ABZ PLUS 컬럼을 사용하거나, RP18 FIT 컬럼이 장착된 100mm x 2.1mm(1.7μm) Premier BEH Shield(초고압 크로마토그래피(UPLC)용)를 사용해 레티놀 분석에 사용할 수 있습니다. 컬럼은 각각 40 °C 또는 50 °C 온도로 유지하세요.
- 혈장 추출물 10 μL을 컬럼에 주입합니다. 유출물은 분당 0.4 mL의 유량으로 분석됩니다. HPLC 시스템의 선형 구배는 6.0분 내에 60% B에서 95% B까지; 6.1분에서 13.0분까지 100% B; 13.1분에서 14.0분까지 100% B에서 60% B로; 그리고 14.0분에서 17.0분 사이 60%의 B. UPLC 시스템의 경우 선형 구배는 연구 질문에 따라 다릅니다. 레티놀만 측정할 경우, 구배는 1.0분 내에 40% B에서 60% B로; 1.0분에서 6.0분에서 95% B까지; 6.5분에서 7.5분까지 100% B; 7.5분에서 7.6분 사이 100% B에서 40% B까지; 그리고 7.6분에서 8.5분 사이에 40% B가 포함되어 있습니다. 레티놀과 함께 레티닐 에스터도 분석하는 것이 목표라면, 선형 구배는 다음과 같습니다: 3.0분 내에 60% B에서 95% B; 3.5분에서 6.5분까지 100% B; 6.5분에서 7.0분 사이 100% B에서 60% B까지; 그리고 7.0분에서 8.5분 사이 60% B.
12. MS/MS 질환
- 양이온 모드에서 대기압 화학 이온화(APCI) 하에서 MS/MS 분석을 수행합니다. APCI는 더 높은 신호 강도, 더 넓은 선형 범위, 낮은 배경 잡음을 제공하기 때문에 전기분무 이온화보다 선택됩니다26.
- [12C]레티놀, [13C10]레티놀, [2H6]레티놀 및 이들의 에스터/아세테이트에 대해 API4000 및 QTRAP 5500 질량분석기의 선택된 반응 모니터링(SRM) 매개변수와 함께 각 질량 전이에 대해서는 표 2, 표 3, 그림 2를 참조하십시오.
참고: 레티놀, 레티닐 에스터, 레티닐 아세테이트에 대한 선택된 이온 모니터링은 APCI 정량을 위한 m/z 269의 동일한 조각 이온이었는데, 이 이온은 프로톤화된 분자에서 물, 지방산 또는 아세트산이 손실되는 것과 일치하기 때문입니다. LC-MS/MS는 레티놀 피크를 에스터에서 분리할 수 있기 때문에, 단일 주입으로 한 샘플 내 레티놀과 레티닐-에스터 분획 모두에서 동위원소 농축도를 측정할 수 있습니다.
13. 레티놀의 정량화
- [12C] 레티놀, [2H6] 레티놀, [13C10] 샘플 농도를 각각의 보정 기준에 대해 정량화하세요.
- 각 샘플의 내부 표준 농도를 내부 표준 대조 샘플과 비교하여 추출 손실을 산출합니다.
- 미국 국립표준기술원(NIST) 표준 참조 물질(SRM) 968을 사용하여 혈장 레티놀 농도를 확인합니다.
결과
서로 다른 크로마토그래피 시스템에서 안정 동위원소 표지된 레티놀을 분석하는 분석 방법의 효과를 보여주기 위해, 우리는 두 가지 다른 연구 결과를 제시합니다.
초기 HPLC와 함께 API4000을 사용할 때, 12개월에서 18개월의 필리핀 어린이 111명의 혈장 샘플을 분석하였으며, 이들은 0일에 400 μg(1.17 μmol) 경구 레티닐 아세테이트 투여를 받고 4일 후 6 mL 혈액 샘플을 채취하여 7.28명을 분석하였습니다. 평균 혈장 총 레티놀 농도는 1.1 μmol/L였고, 평균 [13C10] 레티놀 농도는 0.007 μmol/L이었다. m/z 279에서 100 전이 내 배경 잡음 수준은 평균 최대 높이 ~50 cps였기 때문에(그림 1), [13C10] 레티놀의 검출 수준(LOD)과 정량 측정(LOQ)은 각각 150 cps와 500 cps로 설정되었으며, 이는 컬럼 내 6 fmol과 19 fmol에 해당한다. [12C] 레티놀과 적용된 내부 레티닐-아세테이트 표준 사이에서 좋은 기준선 해상도가 확보되었기 때문에, 안정적인 동위원소 표지된 레티닐-아세테이트를 사용할 필요가 없었습니다.
UPLC와 QTRAP 5500을 결합하면 더 빠른 크로마토그래피 분리가 가능하며, 실행 시간은 10분 미만입니다. 연구 질문에 따라 두 가지 다른 분리 방법이 적용될 수 있습니다; (i) 표지되지 않은 내부 레티닐 아세테이트 표준 체를 적용한 천연 및 동위원소 표지된 레티놀을 결정하는 목적이라면, 레티놀(4.37분)과 레티닐-아세테이트(5.33분) 사이의 보존 시간이 좋은 기준선 분리를 제공합니다(그림 3); (ii) 천연 및 표지된 레티놀을 천연 및 표지된 레티놀과 함께 분리하는 것이 목표라면, 8.5분 동안 좋은 분리가 가능합니다(그림 4). 하지만 레티놀(2.10분)과 레티닐 아세테이트(2.43분) 사이의 체류 시간이 매우 가까워 대신 동위원소 표지된 레티닐 아세테이트([2H4] 레티닐 아세테이트)를 사용하는 것이 권장됩니다. 이 예시에서는 가임기 여성 80명으로부터 혈청 샘플을 분석했으며, 이들은 2 mg 레티놀 상당량의 [2H6] 레티닐 아세테이트를 투여한 후 21일째에 혈액 샘플을 채취했습니다. 평균 혈청 총 레티놀 농도는 1.89 μmol/L였으며, 평균 [2H6] 레티놀은 0.027 μmol/L, 평균 [13C10] 레티놀은 0.025 μmol/L이었다.
제시된 방법은 낮은 수준의 검출을 달성했습니다(LOD = 6 fmol; LOQ = 19 fmol on column)을 통해 안정 동위원소 표지된 레티놀을 검출하는 데 높은 민도와 특이도를 보여주었으며, 천연 레티놀과 내부 표준 사이의 명확한 기준선 분리가 있었습니다. 더욱이, 이 방법은 보존 시간 차이에도 불구하고 HPLC와 UPLC 두 장치 모두에서 효과적으로 작동했습니다. 동위원소 표지된 내부 표준 ([2H4] 레티닐 아세테이트)을 사용하여 레티닐-에스터를 결정해야 할 경우 더 빠른 UPLC 조건에서 정확한 정량화가 가능했습니다. NIST가 인증한 기준에 대한 검증은 정확성을 확인했으며, 일중 및 일간 변동 계수(각각 2.3%와 4.4%)는 우수한 정밀도와 재현성을 보여주었습니다. 서로 다른 투여 프로토콜을 적용한 두 개의 뚜렷한 집단(필리핀 어린이와 가나 여성)의 혈장/혈청 샘플을 성공적으로 분석한 결과, 다양한 영양 연구에서 견고함과 실용성이 입증되었습니다.
그림 1: API4000 질량분석기를 사용한 LC-MS/MS 크로마토그램. 혈청 레티놀의 크로마토그램은 0.4 mg [13C10] 레티닐 아세테이트 경구 복용 후 4일 후에 얻어졌다. m/z 269에서 93까지의 선택된 반응 모니터링(SRM)은 [12C] 레티놀(RT = 5.06분)과 [12C] 레티닐 아세테이트(RT = 5.83 분)의 분리를 내부 표준(IS)으로 보여줍니다. [13C10] 레티놀 신호는 m/z 279에서 100까지 검출 한계(LOD)와 정량 한계(LOQ)를 모두 충분히 초과합니다. 크로마토그래피 조건: (A) dH2O에서 0.1% (v/v) 개상의 이진 이동상 구배와 아세토니트릴에서 0.1% (v/v) 개상; 유량은 분당 0.4 mL이며, 선형 구배는 6.0분 내에 60% B에서 95% B 사이; 6.1분에서 13.0분까지 100% B; 13.1분에서 14.0분까지 100% B에서 60% B로; 14.0분에서 17.0분 사이 60% B; 100 mm x 2.1 mm (3 μm) ABZ PLUS 컬럼, 40 °C에서 유지되는 4 mm x 2 mm C18 카트리지를 장착했습니다. 이 도형의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.
그림 2: APCI-MS/MS 제품 이온 질량 스펙트럼. 유동 주입 APCI-MS/MS 제품 이온 질량 스펙트럼은 (A) m/z 269 [12C] 레티놀, (B) m/z 273 [2H4] 레티놀, (C) m/z 275 [2H6] 레티놀, (D) m/z 279 [13C10] 레티놀을 양이온 모드에서 측정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: QTRAP 5500 질량분석기를 사용한 LC-MS/MS 크로마토그램. 혈장 하우스 표준 추출물의 LC-MS/MS 크로마토그램은 1.0 mg [2H6] 레티닐 아세테이트 경구 섭취 후 21일, 경구 섭취 후 90일 후에 샘플링되었습니다. m/z 269→93의 선택적 반응 모니터링(SRM)에서는 [12C] 레티놀 피크(RT = 4.37분)와 레티닐 아세테이트(RT = 5.33분)가 내부 표준(IS)으로 나타납니다; [2H6] 레티놀(RT = 4.36분)은 m/z 275→96에서 측정됩니다; 그리고 m/z 279→100의 [13C10] 레티놀 피크(RT = 4.38)를 기록했습니다. 크로마토그래피 조건: (A) dH2O에서 0.1% (v/v) 형태산 2 O의 이성 이동상 구배와 아세토니트릴에서 0.1% (v/v) 형태산; 유량은 분당 0.4 ml이며, 선형 구배는 1.0분 내에 40% B에서 60% B까지; 1.0분에서 6.0분에서 95% B까지; 6.5분에서 7.5분까지 100% B; 7.5분에서 7.6분 사이 100% B에서 40% B까지; 7.6분에서 8.5분 사이 40% B; 100mm x 2.1mm(1.7μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT 컬럼, 50°C에서 유지됨. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 4: QTRAP 5500 질량분석기를 사용한 레티놀 및 레티닐-에스터의 LC-MS/MS 크로마토그램. 혈장 하우스 표준 추출물의 LC-MS/MS 크로마토그램을 1.0 mg [2H 6] 레티닐 아세테이트 경구 섭취 후 6시간 후, [13C10] 레티닐 아세테이트 경구 섭취 후 90일 후에 샘플링하였다. m/z 269→93의 선택적 반응 모니터링(SRM)은 [12C]의 레티놀 피크(RT = 2.10분)를 나타냅니다; 내부 표준(IS)으로는 m/z 273→94(RT = 2.43분)의 [2H4]레티닐 아세테이트; [2H6]레티놀(RT = 2.09분)과 [2H6]레티닐 팔미테이트(RT = 5.11분)의 분리는 m/z 275→96에서 피크를 이룹니다; 그리고 m/z 279→100에서 [13C10]의 레티놀 피크(RT = 2.10)를 기록했습니다. 크로마토그래피 조건: (A) dH2O에서 0.1% (v/v) 형태산 2 O의 이성 이동상 구배와 아세토니트릴에서 0.1% (v/v) 형태산; 유량은 분당 0.4 ml이며, 선형 구배는 3.0분 내에 60% B에서 95% B; 3.5분에서 6.5분까지 100% B; 6.5분에서 7.0분 사이 100% B에서 60% B까지; 7.0분에서 8.5분 사이 60% B; 100 mm x 2.1 mm (1.7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT 컬럼, 50 °C에서 유지됨. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
| 매개변수 | |
| 에탄올 내 레티놀의 몰 흡수율(ɛ): | 52,770 M-1 cm-1 |
| 희석 계수: | 100 (100μL 스톡 보정 표준 100mL 에탄올) |
| 측정된 평균 흡광도: | 0.575 |
| 계산 | |
| 에탄올 내 [12C]레티놀 농도(mol): | 농도(몰) = 흡수 / ɛ x 큐벳 길이 |
| = 0.575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1.09 x 10-5 M | |
| 희석 보정: | 1.09 x 10-5 M x 100 = 1.09 x 10-3 M 또는 1.09 mM |
표 1: 교정 표준 레티놀 재고 농도 결정.
| 분석물 | MRM 전이 (m/z) | 탈클러스터 전위 (V) | 진입 전위 (V) | 충돌 에너지 (eV) | 충돌 출구 전위(V) |
| [12C]-레티놀/에스터 | 269→93 | 51 | 10 | 27 | 6 |
| [2H4]레티닐 아세테이트 | 273→94 | 51 | 10 | 27 | 6 |
| [2H6]레티놀/에스터 | 275→96 | 51 | 10 | 27 | 6 |
| [13C10]-레티놀/에스터 | 279→100 | 41 | 10 | 27 | 6 |
표 2: 선택된 반응 모니터링(SRM) 매개변수. [12C] 레티놀, [13C10] 레티놀, [2H6] 레티놀 및 그 에스터의 매개변수 API4000
| 분석물 | MRM 전이 (m/z) | 탈클러스터 전위 (V) | 진입 전위 (V) | 충돌 에너지 (eV) | 충돌 출구 전위(V) |
| [12C]-레티놀/에스터 | 269→93 | 94 | 10 | 33 | 8 |
| [2H4]레티닐 아세테이트 | 273→94 | 54 | 10 | 20 | 11 |
| [2H6]레티놀/에스터 | 275→96 | 69 | 10 | 25 | 3 |
| [13C10]-레티놀/에스터 | 279→100 | 102 | 10 | 35 | 9 |
표 3: 선택된 반응 모니터링(SRM) 매개변수. QTRAP 5500을 사용한 [12C] 레티놀, [13C10] 레티놀, [2H6] 레티놀 및 그 에스터의 매개변수
토론
제시된 LC-MS/MS 방법은 매우 높은 감도를 가지며, 검출 한계가 6 fmol/L까지 낮아 연구자들이 100 - 200 μL 정도의 플라즈마19를 사용할 수 있게 합니다. 이 표적 연합 MS 방법은 양화자와 정식 생성물 이온이 모두 사용될 때 레티노이드 동위상학 동일성을 확인하는 데 특히 강력하다18. 그러나 동위원소 표지된 레티노이드는 생리학적 비표지 레티노이드보다 훨씬 낮은 농도로 존재하기 때문에, 표지된 레티놀과 레티닐 에스터를 포함한 혈장 샘플은 추가적인 농도 단계가 필요할 수 있습니다. 이 필요성은 투여 후 혈액 샘플 시점, 경구 추적자 농도, LC-MS/MS 시스템의 민감도와 같은 요인에 따라 달라집니다. 역사적으로는 이전 질량분석기의 낮은 감도를 극복하기 위해 더 높은 선량을 적용했으나, 최근의 발전으로 낮은 선량 사용이 가능해졌습니다. 제시된 예시에서, 경구 용량이 높을수록 안정 동위원소 표지된 레티놀 수치가 21일 후반에 증가합니다.
레티닐 에스터의 말단 관료기가 이온화 과정에서 손실되기 때문에, 동일한 모체 m/z가 269와 유사한 자각 이온 분열 패턴을 레티놀과 레티닐 에스터 모두에서 관찰합니다. 따라서 크로마토그래피 분리는 각각의 농도를 결정하는 데 매우중요합니다. 또한, 내인성 레티놀 동위상포로지 내 13C 안정 동위원소가 자연적으로 풍부하기 때문에, 인간 혈장 내 레티놀의 기저 자연 13C 농축을 보정할 필요를 피하기 위해 레티놀 추적자에 3개 이상의 13C 원자를 포함하는 것이 권장됩니다.
혈장 샘플은 동위원소 분석 전에 두 단계로 처리되어야 합니다. 먼저, 혈장 샘플을 탈단백화하고, 이어서 비극성 용매를 사용해 레티놀과 레티닐 에스터를 추출하여 이상 시스템 18,19,20을 만듭니다. 위 프로토콜을 통해 명확한 상 분리가 가능하지만, 이상 시스템의 간기가 교란되거나 수집되지 않는 것이 매우 중요합니다. 이는 건조 시간이 증가하고 분석의 정확도를 떨어뜨립니다. 또한, 우리 그룹은 레티노이드20에 대한 단상 추출 절차의 적용도 탐구해왔습니다. 이를 위해 200 μL 플라즈마 샘플을 2mL 플라스틱 마이크로 원심분리관에 피펫 넣고, 레티노이드는 에탄올과 에틸 아세테이트의 조합으로 추출합니다. 이 추출 프로토콜을 적용하면 레티놀과 레티노산 이성질체와 같은 극성 레티노이드를 분석할 수 있으며, 이상 추출과 동등한 회수율을 가지며, Kane과 Napoli30의 1단계 아세토니트릴 추출법과도 비교할 수 있습니다.
레티노이드는 자외선과 열에 노출될 경우 산화와 이성질화에 취약하기 때문에 가능한 한 신속하게 분석을 수행하는 것이 매우 중요하며, 플라즈마30의 수집, 취급 및 보관 시 일반적인 예방 조치가 필요합니다. 안정 동위원소 표지된 레티노이드를 분석하는 전통적인 방법은 시간이 많이 걸리는 분리 및/또는 유도화를 사용합니다. GC-MS 분석은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용해 인간 혈청에서 레티놀 분획을 분리한 후 레티놀22의 유도화를 진행해야 합니다. GC-C-IRMS에 유도체화는 필요하지 않지만, 두 단계의 HPLC 정제 과정을 이용한 레티놀 분리가 권장되며(17,25,31), 표본 집단에서 인간 혈장 내 레티놀의 기초 자연 13C 농축 측정도 필요합니다17,32. 반면, 제시된 LC-MS/MS 방법은 여러 가지 장점을 가지고 있습니다. 광범위하고 시간이 많이 드는 추출 및/또는 정제 과정을 피하여 레티닐 에스터와 자유 레티놀 16,18,26,32의 빠르고 민감하며 동시 분석을 가능하게 합니다. 더불어, 이 방법은 높은 정확도와 낮은 변동성을 제공하며 다양한 LC-MS/MS 시스템에 적응할 수 있어 효과적입니다.
공개 사항
저자들은 선언할 것이 없다.
감사의 글
이 작업은 빌 & 멜린다 게이츠 재단(프로젝트 번호: OPP1115464)과 비엔나의 국제원자력기구(IAEA, 프로젝트 번호 E4.30.30)로부터 지원을 받았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강>용매 | |||
| 절대 에탄올 HPLC 등급 | 피셔 | 10428671 | |
| 아세토니트릴 HPLC 등급 | 피셔 | 10660131 | |
| 헥산 95% n-헥산 HPLC 인증 HPLC | 피셔 | H/0406/17 | |
| 이소프로판올 HPLC 등급 | VWR | 20880.32 | |
| 이소프로판올 HPLC 등급 | VWR | 20880.32 | |
| 메탄올 99% 2.5L | 써모 사이언티픽 | 11367996 | |
| <스트롱>스탠다드/동위원소 | |||
| 올-트랜스-레티놀 | 바이오엑스트라 | 95144 | |
| 레티닐 아세테이트 | 시그마 | PHR1236 | |
| 안정 동위원소 표지된 레티놀: | ReseaChem/Buchem BV | ||
| 레티닐 아세테이트라는 안정 동위원소: | ReseaChem/Buchem BV | 해당 없음 | RID 방법에는 다양한 안정 동위원소를 사용할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 다양한 동위원소 목록은 표 1에 나와 있습니다. |
| 비타민 A (19,19,19,20,20,20-D6) | |||
| 비타민 A (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10) | |||
| 비타민 A 아세테이트 (10,19,19,19-D4) | |||
| 비타민 A 아세테이트 (19, 19, 19, 20, 20, 20-D6) | |||
| 비타민 A 아세테이트 (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10) | |||
| <스트롱>장비 | |||
| 5ml 조절 가능한 용매 디스펜서 | 시그마-올드리치 | Z627607-1EA | |
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| 1000ul 피펫 팁 | 스타랩 | S1122-1830 | |
| 100ml 부피 플라스크 | 피셔 | 11323644 | 파이렉스 붕규산염 유리 클래스 A 인증 부피 플라스크 |
| 200ul 피펫 팁 | 스타랩 | S1120-8810 | |
| 4mm x 2mm 시큐리티가드 C18 탄환 | 현상 | AJ0-4286 | |
| 50ml 부피 플라스크 | 피셔 | 11313644 | 파이렉스 붕규산염 유리 클래스 A 인증 부피 플라스크 |
| 9mm 호박색 유리 바이알과 삽입물 | 피셔 | 11583680 | |
| 9mm 바이알 나사산 캡 | 피셔 | 13206419 | |
| 종이 크라이오박스 | 스타랩 | A9623-8181 | |
| 헬마 큐벳 UV 쿼츠 | SLS | CEL1600 | |
| 질소 가스 (최고 순도, 산소 없음) | BOC | ||
| 파스퇴르 피펫 | 피셔 | 11546963 | |
| 파이렉스 배양관 100x16mm | 코닝 | CLS9944916 | |
| 나사 캡, PTFE 라이너 16mm | 코닝 | CLS999815 | |
| 바이알 유리 앰버 2ml PTFE 캡 | 피셔 | 11573542 | |
| 바이알 스크류 캡 9mm 실리콘 화이트/PTFE 레드 | 열학 및 nbsp; | 13206419 |
참고문헌
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