방법 논문

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

409 조회수

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DOI:

10.3791/69562

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2026년 4월 10일

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1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

이 논문에서

요약

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

초록

인간 다능성 줄기세포(hPSC) 유래 췌장 내분비 세포는 당뇨병 세포 치료와 질병 모델링에 유망한 원천입니다. 여러 차별 프로토콜이 확립되었지만, 생 체 내 착상은 생리학적 맥락에서 성숙과 기능을 연구하기 위해 일반적으로 필요합니다. 대부분의 이식 방법은 신장 캡슐이나 피하 공간과 같은 부위에 의존하며, 이는 기술적 또는 생리학적 한계를 초래할 수 있습니다. 여기서는 면역결핍 마우스에 hPSC 유래 췌장 SC-섬을 근육 내 이식하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 부위는 수술적 접근이 간편하고, 침습성이 줄며, 후속 분석을 위한 신뢰할 수 있는 이식편 채취를 가능하게 합니다. 이 절차는 줄기세포 유래 섬의 근육 내 착상을 가능하게 하고, 구강 포도당 도전 후 인슐린 분비 평가를 위한 회복을 지원합니다. 프로토콜에는 클러스터 준비 및 압축, 이식 수술, 생체 내 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS), 조직학적 분석을 위한 이식편 채취 단계가 포함되어 있어, 전임상 마우스 모델에서 근육 내 이식을 위한 재현 가능한 틀을 제공합니다.

서론

당뇨병은 지난 30년간 유병률이 두 배로 증가한 이질적인 대사 장애로, 2050년까지 13억 명이 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 식습관과 생활습관 같은 환경적 요인이 제2형 당뇨병(T2D) 발병에 중요한 역할을 하지만, 유전적 소인도 발병 기전에 크게 기여합니다. 췌장 β세포는 인슐린 합성과 분비를 담당하며 당뇨병 병태생리에서 중심적인 역할을합니다. 유전적 위험이 β세포 기능 장애에 어떻게 기여하는지 이해하기 위해, 3차원 내분비 클러스터(이하 SC-섬이라 부름)로 조직된 인간 줄기세포 유래 β세포가 매우 유익하고 관련성 높은 모델 시스템을 제공합니다 4,5. 최근 프로토콜은 특정 억제제와 성장인자를 사용하여 췌장 발달의 주요 단계를 재구성함으로써 인간 줄기세포가 인슐린 생성 β세포로 분화하는 과정을 효과적으로 안내합니다 6,7.

이 시스템들은 발달 이정표를 확장 가능하고 재현 가능한 방식으로 신뢰성 있게 재현하며, 발달 모델링을 지원하지 않고 공급 제약에 제약받는 기증자 유래 섬의 한계를 극복합니다. 쥐 모델은 췌장 발달에 대한 귀중한 통찰을 제공했으나, 인간 환자에서 관찰되는 표현형 증상을 완전히 재현하지 못하는 경우가 많습니다5. 따라서 줄기세포 기반 시스템의 사용은 인간 췌장 발달과 β 세포 기능 장애에 관여하는 유전적 변이의 특성화를 가능하게 합니다8.

이러한 발전에도 불구하고, 시험관 내에서 생성된 SC-소들은 성체 β 세포에 비해 전사체적·기능적으로 미성숙한 상태로 남아 있습니다. 이들은 최적이 아닌 포도당 자극 인슐린 분비를 보이며, MAFA와 G6PC2와 같은 성숙한 β세포 표지자의 발현이 부족합니다 9,10. 이 격차를 메우기 위해 면역결핍 마우스로의 이식을 통한 생체 내 성숙이 자주 사용되며; 이로 인해 인슐린 분비 역학과 유전자 발현 프로필 모두가 개선됩니다. 6.

포도당 대사는 엄격히 조절되며 전신 신호의 통합이 필요합니다. 이식된 SC-섬은 여러 장기에서 오는 신호를 통합할 수 있어, 인간β세포에서 유전적 변이의 기능적 결과를 평가하는 데 필수적인 생리학적으로 더 적합한 환경을 제공합니다.

쥐에서 S-섬 이식은 다양한 해부학적 부위에서 시행되어 왔습니다. 기존 부위는 신장 캡슐로, 스트렙토조토신(STZ) 치료 설치류에서 β세포 성숙 촉진과 당뇨병 역전에 효과적이지만, 복잡한 침습적 수술이 필요해 실험실 내 적용이 제한됩니다13. 더불어, 이 방법은 크기와 혈관 분배 제한 때문에 제1형 당뇨병 환자 치료에 임상 환경으로 적용되지 않습니다14. 근육 내 이식, 피하 조직, 지방 조직과 같은 대체 이식 부위가 보고되어 있어 덜 침습적이고 임상적으로 더 적합한 경로를 제공합니다. 근육 내 이식은 신장 캡슐에 비해 최적의 β세포 성숙과 인슐린 분비에 어려움이 있을수 있으나, 효과적인 인슐린 분비와 포도당 항상성 유지를 달성할 수 있으며, 더 간단하고 접근하기 쉬운 수술적 접근법을 제공합니다15,16.

따라서 이 프로토콜에서는 다른 이식 프로토콜의 여러 한계를 해결하는 근육 내 이식 접근법을 제시합니다. 이 방법은 최소 침습적이며, 성숙한 척 섬을 성숙시키고 β세포 기능 장애와 관련된 유전적 변이를 조사하는 데 신뢰할 수 있는 생체 내 전략을 제공합니다.

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프로토콜

다능성 줄기세포(hPSC)와 실험동물을 대상으로 한 모든 실험은 기관, 지역 및 국가 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 여기서 사용된 hPSC 군주는 원래 출처 기관에서 적절한 윤리적 승인과 사전 동의 절차에 따라 도출 및 배포되었습니다. 그림 1 은 hPSC 유지 관리부터 직접적 췌장 계통 분화 및 이식에 적합한 SC-섬으로의 성숙까지의 전체 작업 흐름을 보여줍니다.

1. hPSC와 췌장 전구세포의 분화

참고: 이 프로토콜은 두 가지 필수 준비 단계를 기반으로 합니다: 1) hPSC의 유지 및 확장, 2) 내분비 췌장 계통으로 유도된 분화. 두 단계 모두 7,17에서 자세히 설명되어 있습니다. hPSC는 Lyria-Leyte 등17의 권고에 따라 B8 배지와 함께 코팅된 플레이트에 유지됩니다. 기하급수적 성장 과정에서 분화를 위해 hPSC를 수확하고, 이들이 합류하기 전에 분화할 수 있습니다. 권장 파종 밀도에 도달하면 다음 날 90-100% 합류율에 도달해 분화를 시작할 준비가 됩니다. 내분비 췌장 계통으로의 분화는 Barsby 등7이 설명한 절차에 따라 수행됩니다. 미디어 관련 상세 내용은 표 1에서 확인할 수 있습니다.

  1. 분화 판에 기저막에서 유래한 세포외기질을 새로 코팅합니다.
  2. 0일차에 0.16-0.19만 세포/cm2 씨앗(6웰 플레이트에서 170만 세포 우물 씨앗). 영양분 고갈을 막기 위해 B8 + CEPT 부피의 1.5-2배를 사용하세요(6웰 플레이트에서 웰당 3-4mL).
    참고: hPSC를 통과시키거나 시딩 분화 실험을 할 때, 기존 ROCK 억제제 Y-27632 대신 크로만 1, 에므리카산, 폴리아민, 트랜스-ISRIB의 혼합물인 CEPT를 B8 배지에 우선적으로 보조합니다. 이는 hPSC 생존18을 향상시키는 입증된 능력 때문입니다. 그럼에도 불구하고 Y27632는 이 프로토콜에 대한 유효한 대안으로 남아 있습니다.
  3. 다음 일정에 따라 차별화 매체 S1부터 S4까지 미디어 변경을 수행합니다: S1(1-4일), S2(4-7일), S3(7-9일), S4(9-11일).
    참고: 전체 미디어 구성은 표 1을 참조하십시오; 추가적인 절차적 세부사항은 Barsby 등에서 설명하고 있습니다.

2. 3차원 클러스터 생성과 인슐린 생성 세포로의 분화

참고: 11일째에는 분화된 세포가 췌장 전구세포로 발달했어야 합니다. 이 단계에서 내분비계 분화를 촉진하기 위해 세포는 평면 배양에서 3D 배양으로 전환됩니다.

  1. 24웰 마이크로웰 플레이트 바닥에 역피라미드 마이크로웰(직경 400 μm)을 덮기 위해 5% (w/v) 안티-부착 용액 0.5mL를 첨가합니다(자세한 내용은 표 1 참조). 1,300g 원심분리기에서 실온(RT)에서 10분간 돌립니다.
    참고: 반부착 솔루션은 세포가 플라스틱에 달라붙지 않도록 방지하고 균일한 응집을 촉진하는 반접착 표면을 만듭니다.
  2. 현미경으로 미세한 웰을 검사하여 공기 방울을 확인하고, 필요 시 다시 원심분리하여 갇힌 공기를 제거하세요(그림 2A). 부착 방지 용액을 흡입한 후 0.5mL PBS로 2회 세척하세요. 사용할 준비가 될 때까지 우물에 PBS를 덮어 두세요.
  3. 세포를 1mL PBS-0.5 mM EDTA로 세척한 후 PBS-EDTA를 흡입한 후 트립신(6웰 플레이트 웰의 경우 1mL)으로 덮습니다. 37ºC에서 8-12분간 배양하세요(두드리면 눈에 띄는 분리가 생길 때까지).
  4. 트립신을 제거하지 마세요; 대신 DMEM-F12 또는 PBS 2배 용량으로 희석한 후 피펫팅으로 부드럽게 재현탁합니다. 서스펜션을 원뿔형 튜브에 넣고 즉시 다음 단계로 넘어가세요.
    참고: 강한 기계적 분쇄를 하기보다는 트립신에서 더 오래 배양하는 것이 더 낫습니다.
  5. 현탁액을 200g에서 3분간 RT로 원 심분리합니다. 상정액을 조심스럽게 흡입한 후 펠릿을 미리 예열한 S4 배지(24웰 마이크로웰 각 웰당 1.25mL)에 부드럽게 재현탁합니다.
  6. 마이크로웰 접시에서 PBS를 흡입하세요. 부드럽게 각 마이크로웰 플레이트의 웰에 1.25mL의 부유 세포를 추가합니다.
    참고: 24마이크로웰 플레이트의 각 웰에는 1,200개의 마이크로웰이 포함되어 있습니다. 적절한 크기의 클러스터를 얻기 위해 필요한 시딩 밀도는 마이크로웰당 1,500 셀로, 웰당 180만 셀에 해당합니다. 또는 6웰 마이크로웰을 사용하여 부피와 세포 수를 조절할 수 있습니다(약 885만 개의 세포, 5mL의 4단계 배지).
  7. 100g 원심분리기를 3분간 RT에서 원심분리하여 마이크로웰 내 세포를 고르게 분포하세요. 마이크로웰 플레이트를 조심스럽게 가습 인큐베이터로 옮기세요.
  8. 미분 매체 S5(D14-D18), S6(D18-D25), S7(D25-D46)를 사용하여 미디어 변경을 수행합니다.
    참고: 전체 구성 세부사항은 표 1에 제공되며, 추가 절차적 세부사항은 Barsby 등에서 설명했습니다.
    CEPT 조합은 ROCK 억제제 Y-27632 대신 이 단계에서 사용할 수 있는데, 이는 오가노이드 형성 중 세포 생존을 향상시키는 입증된 능력 때문입니다18. 성공적인 집집은 24-48시간 이내에 조밀하고 구형의 군집이 형성됨으로 나타난다( 그림 2B 참조).

3. 면역결핍 마우스의 조근육으로의 SC-섬 이식

참고: SC-섬은 분화 단계(4단계부터 7단계까지)에 걸쳐 이식되었습니다. 분화된 S7 SC-섬의 이식이 포도당 반응성 평가의 최적 전략인6, 초기 단계의 전구세포(S4-S5) 또는 미성숙 SC-섬(S6)의 이식은 정의된 배양 조건을 사용하여 시험관 내에서 가려지는 분화 또는 성숙 차이를 드러내는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 덜 분화된 전구세포를 이식하는 것은 주로 잔류하는 미분화 세포 집단으로 인해 기형종 형성 위험이 증가합니다.

  1. 클러스터의 압축
    1. 적절한 양의 클러스터를 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다(참고).
      참고: 세포 용량은 실험 목표에 따라 다릅니다. 조직학에서는 마우스당 0.50만-100만 개의 세포가 안정적인 이식편 채취에 충분하며, STZ 치료 마우스에서 기능적 검사나 당뇨병 역전은 일반적으로 200만에서 500만 개의 세포까지 더 높은 용량이 필요합니다. 압축 전에는 SC-아이슬릿이 목표 직경 ~150-250 μm(허용 범위: 100-300 μm)의 균일한 구형 형태를 보여야 합니다. 이 크기 범위는 클러스터당 약 ~10³-4 × 10³ 세포에 해당하며, 과도한 덩어리(>300-400 μm)는 중추 괴사에 더 취약하므로 피해야 합니다. 클러스터 크기와 균일성은 대표적인 우물의 밝시야 또는 입체현미경 영상으로 압축 전에 검증된 후, 표준 영상 분석 소프트웨어를 이용한 직경 측정이 이루어집니다.
    2. 주사기를 바늘 튜브 조립체에 연결하고 S7 미디엄을 채우세요.
    3. 클러스터를 마이크로 원심분리기 튜브에서 직접 튜브로 흡입하세요. 튜빙을 반으로 접고 접힌 부분을 200 μL 피펫 팁에 삽입합니다. 팁 튜빙 바늘 조립체를 15mL 원뿔형 튜브에 삽입하고, 끝부분을 테이프로 튜브 가장자리에 고정합니다.
    4. 튜브를 100g 압력으로 4°C에서 2분 간 원심분리하여 클러스터를 압축하세요. 즉시 튜브를 얼음 위에 올려놓으세요.
  2. 쥐로의 클러스터 이식
    참고: 모든 수술 절차는 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 기관의 생물안전 및 동물 복지 규정을 준수하여 수행되어야 합니다. 마취제와 날카로운 물건은 승인된 안전 절차에 따라 취급 및 폐기되어야 합니다.
    1. 3-5% 이소플루란을 사용하여 NOD-scid-gamma 마우스에 마취를 유도합니다.
    2. 오른쪽 다리 무릎 아래 뒷면을 면도하고 70% 에탄올로 소독하세요.
    3. 피펫 팁에서 튜빙을 분리해서 주사기에 연결하세요. 다져진 클러스터 근처에 튜브를 잘라서 바늘의 둔한 끝에 연결하세요. 첫 번째 뭉치가 바늘 끝에 닿을 때까지 식염수를 밀어 넣습니다.
    4. 마우스를 엎드린 자세로 오른쪽으로 기울이고 오른쪽 다리를 뻗으세요. 바늘을 오른쪽 허벅지 내측 구획, 내전근과 경근 사이 부위에 4-5mm 깊이 삽입합니다.
    5. 주사바늘을 ~3mm 당기면서 클러스터를 주입하세요. 주사기를 돌리고 바늘을 빼세요.
    6. 마취에서 완전히 회복될 때까지 쥐를 관찰하세요.
      참고: 기능적 특성 분석(즉, 생체 내 GSIS, 4절)을 위해서는 마우스당 단일 유전자형의 SC-아이슬렛을 사용해야 합니다; 이식 한 번이면 충분합니다. 그러나 착상 후 성숙의 조직학적 또는 전사체학적 특성화를 위해서는 양쪽 다리를 모두 사용할 수 있습니다(예: 한쪽 다리는 질병 관련 유전 변이를 포함하는 hPSCs에서 유래한 SC-클러스터를, 다른 쪽 다리는 변이가 교정된 상태입니다). 주사 직후 생 체 내에서 정확한 근육 내 전달을 직접 확인할 수는 없습니다. 성공적인 착상 여부는 대신 채취 시점의 이식편을 거시적으로 확인하고(그림 3), 조직학적 분석(그림 4)을 통해 사후적으로 확인됩니다.

4. 생체 내 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)

참고: 경구 포도당 도전을 통한 생체 내 GSIS는 생리적 자극에 반응하여 기능적 인슐린 분비를 평가합니다. 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 지침을 따라야 합니다. 이식된 β세포의 기능적 반응은 생체 내 성숙과 함께 개선됩니다: 인간 C-펩타이드는 이식 후 2주부터 검출될 수 있으며, 강력한 포도당 반응성 분비는 보통 4주가 걸립니다. 이 기간은 이식 시 척추 섬의 발달 단계에 따라 달라질 수 있습니다

  1. 포도당 투여 전 4-6시간 동안 단식을 하며 물을 확보하세요.
  2. 20% (w/v) D-(+)-포도당 용액을 물에 담아 준비하세요. 사용 전에 0.22 μm 필터를 통과시키고 실온으로 데워 멸균하세요.
  3. 각 마우스의 무게를 재고 3g/kg 체중으로 필요한 포도당 선량을 계산하세요.
  4. 적절한 양의 포도당 용액을 1mL 주사기에 부착한 20G 곡선 바늘에 주입하세요.
  5. 쥐를 부드럽게 제지하고 구강 관술을 시행하며, 기관 흡인을 막기 위해 관침이 부드럽게 삽입되도록 하세요.
  6. 기저치(0분)와 15분 및 30분 시점에 모세혈관과 1.5mL 마이크로 원심분리관을 사용하여 하악하정맥 또는 꼬리정맥 천공을 통해 혈액 샘플을 채취합니다. 혈액을 실온에서 약 15분간 응고시키고, 튜브를 얼음 위에 보관하세요.
  7. 샘플을 1,000g 원심분리기, 4°C에서 15분간 보관한 후 혈청을 새 튜브로 옮깁니다. ELISA로 분석할 때까지 −80 °C에서 보관됩니다.
    참고: 실험 모델에 따라 시간 포인트가 조정될 수 있습니다. 이종 이식 모델에서 이식편 유래 인슐린 분비를 평가할 때는 인간과 마우스 인슐린 또는 C-펩타이드를 구분할 수 있는 분석법을 사용하는 것이 매우 중요합니다.

5. 접목된 클러스터의 회수

  1. 동물 윤리 지침에 따라 쥐를 안락사시키세요.
  2. 털로 인한 조직 오염을 최소화하려면 몸에 에탄올 70%(v/v)를 뿌려 주세요.
  3. 피부를 제거해 하체 근육을 드러내고, 확대경으로 이식된 군집을 찾아보세요. 가위와 겸자를 이용해 이식 조직을 절제합니다.
  4. 조직을 PBS로 한 번 헹구고 얼음 위에 4% (w/v) 파라포름알데히드(PFA)로 옮기세요. 4% PFA에 4°C에서 부드럽게 흔들며 4시간 동안 조직을 고정하세요.
  5. 샘플을 PBS로 1시간 동안 부드럽게 흔들며 세척하세요. 조직을 30% (w/v) 자당에 PBS로 옮기고 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
    참고: 생물학적 조직, 혈액 샘플, 화학 폐기물(고정제 및 마취 잔류 포함)은 기관의 생물안전 및 화학 폐기물 관리 지침을 따라야 합니다.

6. 추출물 염색

  1. OCT 임베딩
    1. 조직을 최적 절단 온도(OCT) 화합물로 채운 몰드에 박습니다.
    2. 몰드를 드라이아이스-이소프로판올 욕조에 넣어 샘플을 급동합니다. 냉동 절부 전까지 -80°C에서 보관하세요.
    3. 크라이오스탯을 사용해 5-7 μm 단면을 잘라 -80 °C에 저장합니다.
  2. 면역염색
    1. 결로를 방지하기 위해 용기 안에서 15분간 RT 슬라이드를 평형으로 유지하세요.
    2. 슬라이드를 PBS로 3회 5분간 세척하세요.
    3. 각 절편을 100 μL 차단/투과화 용액으로 30분간 RT(PBS에 0.1% 비이온 계면활성제, 2차 항체가 생성된 종의 5% 혈청 포함)에 인큐베이팅합니다.
    4. 각 절편을 4°C에서 4°C에서 50 μL 1차 항체를 블로킹/투과용액에 희석한 상태로 배양합니다.
    5. 슬라이드를 PBS로 3회 5분간 세척하세요.
    6. 각 절편을 차단/투과용 용액에 희석한 2차 항체 50 μL를 1시간 RT 강사로 배양합니다.
    7. 슬라이드를 PBS로 3회 5분간 세척하세요.
    8. 15 μL 용량의 DAPI 마운팅 용액을 사용해 슬라이드를 장착하고 커버슬립을 적용합니다. 영상 촬영 전까지 어두운 곳에서 4°C에서 보관하세요.

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결과

결과는 면역결핍 마우스에 7기 스카-섬을 근육 내 이식한 결과이며, 이식 후 6주 후에 분석이 수행되었습니다. 대표적인 이식편을 가진 소수의 동물을 분석하여 이 절차의 실현 가능성을 입증하였습니다. 본 연구에서 성공적인 결과는 근육 내 이식편의 거시적 채취 후 이식된 SC-섬의 생존 및 내분비 동일성 확인을 조직학적으로 확인하는 것으로 정의됩니다. 그림 1 은 hPSC 유지 과정을 지향적 췌장 계통 분화, 그리고 이식에 적합한 SC-섬으로의 성숙에 이르기까지 전체 분화 작업 흐름을 보여줍니다.

크기 조절 3D 응집체를 생성하기 위해 4단계 췌장 전구세포의 단일 세포 현탁물을 마이크로웰 플레이트에 시딩했습니다(그림 ...

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토론

이 프로토콜에서는 SC-섬의 근육 내 이식을 생 체 내 성숙을 위한 간단하고 재현 가능하며 최소 침습적인 접근법으로 설명하며, 기능적 평가 가능성도 있다고 설명합니다. 신장 캡슐 이식은 설치류에서 섬 또는 SC-섬 이식의 '골드 스탠다드'로 널리 인정받지만, 더 높은 기술적 전문성과 더 긴 수술 절차가 필요합니다. 반면, 근육 내 부위는 절차의 단순성과 빠른 시술을 제공하며, 3Rs 프레임워크의 정제화 원칙에 부합하여 수술 복잡성과 수술 전 스트레스를 줄입니다. 이러한 특성들은 시행의 용이성이 중요한 SC-섬에서 유전자 변형 결과를 평가하려는 실험실에 특히 매력적입니다.

골격근을 이용해 내분비 조직 이식을 하는 개념은 임상 내분비학에서 오랜 선례가 있으며, 특히 부갑상선 자가이식에서 두드러지며, 현재도 일상적으로 사용되고 있습니다. 이는 근육 조직...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구에 사용된 hPSC 라인을 관대하게 제공해 주신 단웨이 황푸 박사(뉴욕 메모리얼 슬론 케터링 암센터)에게 감사드립니다. 이 연구는 스페인 과학혁신대학부 MICIU/AEI/10.13039/501100011033 및 Next GenerationEU/PRTR(A.B.)의 PID2021-122284NA-I00 및 CNS2023-145179 보조금, 그리고 카를로스 3세 건강 연구소(ISCIII)의 CIBER-네트워크 생의학 연구 컨소시엄 CB07/08/0029 및 PID2023-150719OB-I00 (M.V.)의 지원을 받았습니다. 당뇨병 및 관련 대사 질환 생의학 연구 센터(CIBERDEM)는 ISCIII의 이니셔티브이며 유럽 지역 개발 기금(FEDER)의 일부 지원을 받고 있습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid FreeGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392CEPT 칵테일
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)SyncomCustom productGamma-secretase 억제제
Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham’s F12 media (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPT 칵테일
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptCustom product
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-Ascorbic AcidSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid ConcentrateGibco11548846
Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteineThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherence solution)Sigma Aldrich821845% (w/v) 사용
Polyamine Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483CEPT 칵테일
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5 억제제
Retinoic AcidSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MG세포 투과성 T3 유사체
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPT 칵테일
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nonionic surfactant)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCK 억제제
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
항체
Rat anti-Human C-peptide (insulin)DSHBGN-ID4-s150 ng/mL 사용
Mouse anti-glucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Rabbit anti-somatostatinMilliporeAB54941:500
Goat anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Donkey anti-mouse AF488InvitrogenA-212021:500
Donkey anti-rabbit AF488InvitrogenA-212061:500
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참고문헌

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