방법 논문

수정된 염화철 유도 상시상동 혈전증 형성

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DOI:

10.3791/69563

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2025년 12월 30일

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital Capital Medical University

이 논문에서

요약

본 연구는 실크 봉합법과 레이저 반점 조영 영상 및 고해상도 초음파를 결합하여 평가를 위해 실크 봉합법과 레이저 반점 조영 영상 및 고해상도 초음파를 결합하여 상시상동 혈전증을 재현 가능하고 최소 침습 모델로 확립하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

뇌정맥혈전증(CVT)은 드물지만 생명을 위협할 수 있는 신경학적 질환입니다. 동물 모델은 병태생리를 조사하고 잠재적 치료법을 평가하는 데 중요한 플랫폼을 제공합니다. 본 연구에서는 FeCl₃ 침착 봉합 기법을 사용하여 수정된 쥐 상시상동(SSS) 혈전증 모델을 제시합니다. 수컷 스프래그-도울리 쥐(220-250g)는 중간절개와 SSS 위에 1cm 두께의 두개골 창을 만들었습니다. 전통적인 정중 절개와 비교할 때, 이 방법은 절개 피부, 뼈 창, 그리고 그 아래 경막 사이의 유착을 방지합니다. 또한, SSS 위에 위치한 봉합 매듭으로 인한 간섭을 피하여 초음파 영상의 품질을 향상시킵니다. 40%FeCl3 에 적신 2-0 실크 봉합사가 노출된 부비동에 두 차례 연속 5분 간격으로 직접 적용되었습니다. 전통적인 FeCl3필터 종이 방법과 비교할 때, 이 기술은 시상 피질에 대한 직접적인 화학적 손상을 최소화합니다. FeCl3 적용 전후의 뇌정맥 관류 평가를 위해 레이저 스펙클 조영 영상을 사용하였습니다. 혈류가 유의미하게 감소한 결과, 혈전증이 성공적으로 확인되었습니다. 수술 후 7일째, 혈전 형성과 혈역학적 변화를 고해상도 초음파 로 평가하고 Vevo LAB 소프트웨어를 사용해 혈전의 체적·혈역학적 데이터를 제공하였습니다. 이 수정된 모델은 전임상 CVT 연구를 위한 재현 가능하고 최소 침습적이며 영상과 호환되는 접근법을 제공합니다.

서론

뇌정맥혈전증(CVT)은 뇌혈관 질환의 한 종류로, 전체 뇌졸중의 0.5-3%를 차지하며 젊은 성인에서 뇌졸중의 중요한 원인 중 하나입니다. 이 질환의 핵심 병리학적 변화는 경막성 정맥동 및/또는 뇌정맥 내 혈전증으로, 이는 뇌정맥 배출 장애를 초래하고, 이후 두개내압 상승, 뇌부종, 정맥경색 또는 출혈을 유발합니다. 그 기전을 더 잘 밝히고 새로운 치료 중재를 평가하기 위해서는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 동물 모델이 필수적입니다. 상시상동(SSS)이 가장 자주 영향을 받는 부위이며, 그 표면적 위치가 수술절차 2,3을 용이하게 하기 때문에, 현재 동물 실험은 주로 상시상동혈전증(SSST) 모델을 사용합니다.

다양한 모델링 방법 중에서, 염화철(FeCl3) 유도법은 조작 간편성과비용 효율성 덕분에 가장 널리 사용되는 기법 중 하나가 되었습니다. 이 모델에서는FeCl3 용액을 국소적으로 바르면 정맥동 내피를 직접 손상시켜 강한 산화 특성을 통해 내피하 기질이 노출됩니다. 이 노출은 혈소판 응집과 응고 연쇄 반응을 활성화하여 궁극적으로 정맥동 혈전증5를 유도합니다. 하지만 다른 방법과 비교할 때, 전통적인 FeCl3필터 종이 모델에는 몇 가지 단점도 있습니다. 가장 심각한 문제는FeCl3 의 수자성 특성과 높은 자기 감수성이 자기공명영상 촬영 중 상당한 아티팩트를 발생시켜 혈전 평가 및 정맥동 재관화 관찰의 정확성을 심각하게 저하시킨다는 점입니다. 게다가 필터 페이퍼의 형태가 SSS와 잘 맞지 않아 부비동 주변의 뇌 실질을 손상시키기 쉽습니다. 따라서 SSS 주변의 실질 손상이 혈전증 자체에서 비롯된 것인지, 아니면FeCl3에 의한 직접적인 화학적 손상에서 비롯된 것인지 판단하기 어렵습니다.

본 연구의 전반적인 목표는 FeCl3에 의해 유발되는 직접적인 피질 손상을 줄이고 SSS 내 혈류와 혈전 크기를 평가할 수 있는 수정된 FeCl3 유도 SSST 쥐 모델을 구축하는 것입니다. 본 연구는FeCl3에 적재된 봉합 기법과 결합된 파라미디언 접근법을 도입하여,FeCl3로 인한 직접적인 피질 화학적 손상을 최소화하고, 고해상도 초음파를 이용해 정맥동 혈류와 혈전 형성을 실시간으로 비침습적이며 정량적으로 모니터링할 수 있게 합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 수도의과대학 동물실험 및 실험동물복지위원회의 승인 번호를 받았습니다. AEEI-2025-138. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 수정된 FeCl3 유도 쥐 SSST 모델 확립

  1. 실험용으로 6-7주 된 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐, 몸무게 220-250g을 사용한다. 수술 전에 쥐를 1주일간 적응시키고 12시간 동안 먹이를 주지 마세요.
  2. 다음 시약, 기기 및 장비를 준비하세요: 2% 펜토바르비탈 용액, 40%FeCl3 용액, 5% 포비돈-요오딘, 생리식염수, 안과 연고, 일회용 면도날, 메스, 수술용 가위, 겸자, 2-0 및 4-0 실크 봉합사, 역절삭 바늘, 바늘 홀더, 1-mL 및 5-mL 주사기, 의료용 테이프, 설치류 수술 플랫폼, 직장 온도 탐침이 포함된 온열 패드, 마이크로 핸드헬드 두개골 드릴.
  3. 체중 측정 후, 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 2% 펜토바르비탈(50 mg/kg) 복막 내 주사로 쥐를 마취합니다. 그 후 겸자로 뒷다리 피부를 꼬집어 금단 증상과 통증 반응이 없음을 확인합니다.
  4. 안과 연고를 바르고 일회용 면도날로 쥐의 두피 털을 면도하세요.
  5. 쥐를 설치류 수술 플랫폼에 엎드린 자세로 의료용 테이프로 고정시키고, 온열 패드로 체온을 37± 0.2 °C로 유지하며, 직장 탐침으로 중심 체온을 지속적으로 모니터링합니다.
  6. 두피를 5% 포비돈-요오드로 소독하세요.
  7. 두피에 15mm 파라미디언 피부 절개를 한 후, 밑의 근막과 골막을 둔하게 해부하여 두개골을 완전히 노출시킵니다.
  8. 두개골을 두개골 드릴로 얇게 하여 SSS가 명확히 노출될 때까지 하며, 람다에서 시작해 시상봉합선을 따라 앞쪽으로 10mm 확장합니다. 기저의 경막과 SSS를 손상시키지 않도록 간헐적 드릴링 기법을 사용하고, 피질에 대한 열 손상을 방지하기 위해 드릴 비트에 반복적으로 생리식염수로 관개하세요.
  9. 노출된 SSS 표면에 40%FeCl3 용액에 적신 2-0 실크 봉합사 10mm 구간을 5분간 감싼 후, 새로 적신 구간으로 교체하여 5분간 적용합니다.
  10. 남은FeCl3를 제거하기 위해 0.5 mL 생리식염수로 수술 부위를 세 번 세척하세요.
  11. 4-0 실크 봉합사를 사용해 중단 봉합으로 피부를 봉합한 후 포비돈-요오드 소독을 시행합니다.
  12. 쥐가 완전히 깨어날 때까지 관찰한 후 다시 우리로 돌려놓으세요.

2. 성공적인 모델 구축 평가

참고: 수술 중 LSCI는 두개골 창문 생성 후 FeCl3 적용 전, 그리고 FeCl3 적용 및 수술 부위 세척 후, 피부 닫힘 전의 SSS 내 정맥 혈류를 측정하는 데 사용되었습니다. 이 모델은 SSS의 정맥 혈류가 유의미하게 감소할 때 성공적으로 확립된 것으로 간주됩니다.

  1. LSCI와 해당 소프트웨어(RFLSI v5.0)를 켜고 온라인 모드 버튼을 누르세요.
  2. 기기의 높이와 위치를 조절하여 지시야 중앙에 레이저가 맞춰집니다.
  3. 쥐를 폼 플랫폼 위에 올려놓고 SSS가 인디케이터 레이저와 일치할 때까지 위치를 조정하세요.
  4. 이미지가 선명하게 나올 때까지 배율과 초점을 조절하세요. 의사 색상 임계값의 하한과 상한을 10과 200으로 설정하여 의사 색상 이미지의 시각적 외관을 최적화합니다.
  5. ROI 설정 버튼을 누르고, 원형 도구를 선택한 후 SSS 지역을 구분하세요.
  6. 기록 버튼을 눌러 정맥 혈류를 확인하고 원본 이미지와 의사 컬러 이미지를 모두 촬영하세요.

3. 혈전 면적/용적 및 혈역학적 변화 평가

참고: 시술 후 며칠에서 몇 주 후에는 고해상도 초음파를 사용하여 혈전 변화와 혈관 재관화 상태를 평가하세요.

  1. 다음 약물, 기기 및 장비를 준비하세요: 이소플루란, 초음파 젤, 일회용 면도날, 의료용 테이프, 소동물 마취기, 고해상도 소동물 초음파 및 광음향 영상 시스템, 70 MHz 초고주파 UHF57x 선형 배열 트랜스듀서, 3D 획득 모터.
  2. 3D 획득 모터와 UHF57x 트랜스듀서를 설치하세요. 그다음 모터를 초기화합니다.
  3. 3% 이소플루란과 1 L/min 산소를 혼합한 유도 챔버에서 쥐를 마취합니다.
  4. 쥐를 37°C 온도의 온도 영상판 위에 엎드린 자세로 눕히고, 머리와 팔다리는 의료용 테이프로 부드럽게 고정하며, 코 콘을 통해 1.5%-2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
  5. 일회용 면도날로 두피 털을 면도해 검출 부위를 노출시킨 후 초음파 젤을 바르세요.
  6. SSS와 뇌내 혈전이 명확히 시각화될 때까지 쥐의 위치와 방향을 변환기에 대해 조정합니다.
  7. 3D이미징 B-모드(스텝 사이즈 0.04mm)를 사용해 시상면과 코로나면 모두에서 SSS의 순차적 단층촬영 이미지를 획득할 수 있습니다.
  8. 컬러 도플러 모드를 사용해 SSS에서 혈류를 관찰한 후, 펄스파(PW) 도플러 모드를 적용해 혈류 속도를 측정하세요.
  9. 마취를 중단하고 쥐가 완전히 깨어난 후 다시 케이지로 돌려보내세요.
  10. 이미지를 내보내고 Vevo LAB 소프트웨어로 분석하세요. SSS에서 최대 시상면적과 관상 단면적, 혈전의 부피, 그리고 부비동의 최대 혈류 속도를 기록하세요.

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결과

수정된 FeCl3 유도 SSST 모델의 개략도는 그림 1에 나타났다. 실험 결과,FeCl-3 포화 실크 봉합선을 SSS에 적용한 후 LSCI는 국소 혈류가 유의미하게 감소함을 감지하여 정맥동의 성공적인 폐쇄를 나타내고 동적 관류 변화 감지에 LSCI의 민감성을 확인했습니다(그림 2). 수술 후 7일째에 소동물 초음파 검사로 SSS에 혈전이 형성되었고 부분 하강 재관화가 확인되었습니다(그림 3). Vevo LAB 소프트웨어를 사용하여 초음파 이미지를 분석하여 단면적(시상면 및 관상면)과 혈전의 부피, 그리고 잔류 내강 내 혈류 속도를 얻었습니다(그림 3 및 그림 4)....

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토론

CVT는 드물지만 잠재적으로 생명을 위협할 수 있는 특정 뇌혈관 질환유형입니다. 병리학적 기전을 더 연구하고 효과적인 개입 전략을 개발하기 위해, 연구자들은 SSS 결찰 또는 폐쇄 7,8,9, 전혈전 물질 주입10, 자가혈전 주입11, 광화학 유도12, FeCl₃ 유도4 등 다양한 SSST 동물 모델을 구축했습니다. 이 중 SSS 연결 또는 폐쇄 모델은 혈전의 자발적 해체 과정을 시뮬레이션할 수 없어 치료 효능 평가에 적합하지 않습니다13; 전혈전 물...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학기금(82401527)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL 주사기선전 화욘 바이오테크놀로지 유한회사.21-3020
2-0 실크 봉합사상하이 푸동 진환 의료제품 유한회사(유한회사A224
3D 획득 모터후지필름 비주얼소닉스https://www.visualsonics.com/gallery/extended-3d-motor
4-0 실크 봉합사상하이 푸동 진환 의료제품 유한회사(유한회사A222
5% 포비돈-요오딘산둥 리콘 의료기술유한회사.https://www.lircon.cn/products_details/100.html
5mL 주사기선전 화욘 바이오테크놀로지 유한회사.21-3023
일회용 면도날동양진민 무역유한회사.ST300
FeCl3맥클린I811935
온열 패드선전 화욘 바이오테크놀로지 유한회사.36-0001
이소플루란RWD 생명과학R510-22-10
레이저 스펙클 이미징 시스템RWD 생명과학RFLSI III
선형 배열 변환기후지필름 비주얼소닉스UHF57x
의료용 테이프쑤저우 콘리다 의료용품 유한회사.B02
마이크로 핸드헬드 두개골 드릴RWD 생명과학78001
바늘 홀더RWD 생명과학F31025-13
생리식염수상하이 비요타임 바이오테크놀로지 유한회사.ST341-500ml
안과 연고선전 화욘 바이오테크놀로지 유한회사.19-7223
역방향 절단 바늘상하이 푸동 진환 의료제품 유한회사(유한회사TJ-3-514
설치류 작동 플랫폼상하이 위옌 과학기기 유한회사.30150
메스 칼날RWD 생명과학S31015-01
메스 손잡이RWD 생명과학S32003-12
소동물 마취기RWD 생명과학R500
소동물 초음파 및 광음향 영상 시스템후지필름 비주얼소닉스베보 F2
스무스 겸자RWD 생명과학F12013-10
나트륨 펜토바르비탈시그마-올드리치(상하이) 무역회사P3761
외과용 가위RWD 생명과학S14014-10
이빨 겸자RWD 생명과학F12011-13
초음파 젤산둥 리콘 의료기술유한회사.https://www.lircon.cn/products_details/230.html

참고문헌

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  13. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  14. Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
  15. Srivastava, A. K., Kalita, J., Haris, M., Gupta, R. K., Misra, U. K. Radiological and histological changes following cerebral venous sinus thrombosis in a rat model. Neurosci Res. 65 (4), 343-346 (2009).
  16. Wang, W., et al. Establishment of a rat model of superior sagittal-sinus occlusion and recanalization via a thread-embolism method. Neuroscience. 416, 41-49 (2019).
  17. Hachenberger, M., et al. Comparison of edoxaban and enoxaparin in a rat model of AlCl3-induced thrombosis of the superior sagittal sinus. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 396 (12), 3887-3892 (2023).

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