HER2 양성 유방암에서 배액 및 전이 림프절의 RNA-seq 프로파일링을 통해 POSTN을 예후 표지자로 식별합니다

요약

우리는 HER2 양성 유방암에서 림프절 전파의 기저가 되는 세포외 기질 및 PI3K-AKT 중심 프로그램을 밝히고, POSTN을 위험 계층화 및 경로 지향 치료 전략을 지지하는 저소한 예후 지표임을 밝혀냈다.

초록

HER2 양성 유방암은 임상적으로 공격적이며 주로 지역 림프절로 전파되지만, 결절 전이와 관련된 전사체 프로그램은 아직 완전히 정의되지 않았습니다. 본 연구에서는 HER2 양성 유방암 환자 6명에서 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 사용하여 종양 배출 림프절(TDLN)과 전이 종양 관련 림프절(TMLN)을 프로파일링하였습니다. DESeq2를 사용하여 차별식 분석이 수행되었으며, Benjamini-Hochberg 보정(FDR < 0.05)과 절대 log2 복수 변화 임계값(|log2FC| ≥ 1)을 적용하였습니다. 우리는 237개의 차등 발현 유전자를 확인했으며(TMLN 대 TDLN에서 182개는 상향 조절, 55개는 하향 발현됨). 기능 풍부 분석 결과, 세포외기질(ECM)-수용체 상호작용, PI3K-AKT 신호, 국소 부착, 콜레스테롤 대사가 전이성 림프절과 관련된 주요 경로임이 강조되어, 결절 전파 중 ECM 재형성과 신호 활성화가 조정된 것으로 나타났다. 가장 상향 조절된 유전자 중에서 POSTN 은 핵심 후보로 부상했으며, 부정적인 임상병리학적 특성과도 연관이 있었습니다. 독립적인 검증 코호트(n = 120)에서는 POSTN 발현이 높을수록 무질병 생존율이 열등한 것으로 나타났습니다. 이 결과들은 POSTN 을 잠재적인 예후 바이오마커로 지명하며, ECM 중심 및 PI3K-AKT 관련 기전을 HER2 양성 유방암에서 림프절 전이의 실질적인 생물학적 특징으로 지지합니다.

서론

유방암(BC)은 여성에서 가장 자주 진단되는 암이자 전 세계적으로 암 사망의 주요 원인이며, 중국에서는 상당히 증가하는 부담을 겪고 있습니다^. 약 15%-20%의 피임명은 HER2 양성(HER2+)으로, ERBB2 증폭/과발현과 재발 및 사망 위험이 높은 공격적인 표현형을 특징으로 합니다 ^2,3. 항HER2 전신 치료가 현저히 결과를 개선했음에도 불구하고, 상당수의 환자가 여전히 재발하거나 전이로 나타나며, 이는 생물학적 정보 제공 위험 계층화와 새로운 치료 옵션의 필요성을 강조합니다^.

림프절 전이(LNM)는 BC에서 병기 분류, 보조 치료 선택 및 예후를 결정하는 중요한 요인입니다; 겨드랑이 침범은 생존이 열악함을 예고하며, 먼 장기로의 추가 확산을 촉진합니다 ^5,6. 그러나 HER2+ 질환에서 결절 전이의 생물학을 포착하는 강력한 바이오마커는 여전히 제한적이며, 현재의 임상병리학적 요인은 결과 이질성을 부분적으로만 설명한다⁷.

RNA-seq 기술의 발전으로 전사체 전체의 고동적 범위 프로파일링이 가능해졌으며, 현재 번역 종양학⁸에서 널리 채택되고 있습니다. 그러나 HER2+ BC의 대부분 발현 연구는 원발성 종양이나 비쌍 코호트에 초점을 맞추는 반면, 일치하는 종양 배액 림프절(TDLN)과 종양 전이 림프절(TMLN)의 비교 프로파일링은 드물어 결절 정착과 진행의 기저가 되는 분자 프로그램에 대한 통찰이 제한^{적입니다.}

림프절 전이의 임상적 중요성과 세포외기질 재형성과 PI3K-AKT 활성화가 전이성 시딩에 연관된다는 기존 증거를 바^탕으로, 동일한 환자 내에서 종양전이 림프절(TMLN)이 일치하는 종양 배액림프절(TDLN)과 구별되는 전사체 프로그램을 보일 것이고, 지속적으로 상향 조절된 ECM 관련 유전자 일부가 부정적인 임상병리학적 특징과 연관되어 있다고 가설을 세웠습니다. 재발 위험. 이 가설을 검증하기 위해 6명의 HER2 양성 환자에서 쌍 TDLN과 TMLN을 프로파일링하여 차별발현 유전자(DEG)와 노드 전파와 관련된 경로를 규명하였습니다. 그 후 POSTN을 우선순위로 정하고, 독립적인 코호트에서 ECM 재모델링과 PI3K-AKT 신호가 HER2+ 유방암에서 임상적으로 유용한 위험 층화와 연관되어 있는지를 평가했습니다. HER2 평가(현대 ASCO-CAP 기준에 따른 것), 시퀀싱 품질 관리, DESeq2 및 Benjamini-Hochberg FDR 대조를 이용한 DEG 호출, 검증 절차에 대한 세부^{사항이 여기 제공}되어 있습니다.

프로토콜

이 연구는 기관 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언과 인간 생물 시료 사용을 규율하는 현지 규정에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 중산 보아이병원 윤리위원회(KY-2020-012-124)의 승인을 받았습니다. 모든 참가자로부터 서면 동의서가 연구 특정 절차 전에 확보되었습니다.

연구 코호트 및 샘플
발견 코호트는 HER2 양성 유방암 환자 6명으로부터 수술 중 채취된 종양 배출 림프절(TDLN)과 전이 림프절(TMLN) 조직을 쌍으로 구성했습니다. 각 환자에 대해 일치하는 TDLN은 전이의 조직학적 증거가 없는 배액되는 림프절로 정의되었으며, 환자 내 대조 비교 대상자로 사용되었으며, TMLN은 병리적으로 확인된 전이 조직이었습니다. 신선한 조직은 찬 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 잠시 세척한 후 30분 이내에 액체 질소에 당겨 건조시키고, -80°C에서 추출 때까지 보관했습니다. 포함 기준은 병리학적으로 확인된 침습성 유방암, ASCO/CAP에 따른 HER2 양성, 쌍립절의 이용 가능성, 신조조제요법 부재였습니다. 제외 기준은 조직 또는 RNA 무결성 수(RIN) 부적합 < 7.0이었습니다. 처음 선별된 한 샘플은 RIN < 7.0으로 인해 QC에 실패하여 제외되었으므로, 모든 발견 분석에서는 일관되게 n = 6을 사용합니다. 독립 검증 코호트는 임상 추적 관찰을 포함한 120개의 아카이브 FFPE 림프절 표본으로 구성되었으며, qRT-PCR 및 결과 분석에 사용되었습니다. 예후 모델링을 위해 환자들은 POSTN 발현 그룹(높은 그룹과 낮은 그룹, 컷포인트는 X-타일로 결정됨)으로 비교되었으며, 저그룹이 기준 비교 대상이 되었습니다. 누락 추적 관찰 또는 불완전한 공변량이 있는 사례는 예후 모델링에서 제외되었습니다.

표본 크기 논리 (발견 및 검증)
발견 단계에서는 환자 내 대비를 극대화하고 개인 간 분산을 줄이면서 FDR = 0.05에서 다중성을 조절하기 위해 쌍 TDLN-TMLN 설계를 사용했습니다. 검증 코호트(n = 120)의 경우, POSTN 표현은 X-타일로 결정된 컷포인트(High/Low = 40/80)에서 이분법되었습니다. 48건의 무질병 생존(DFS) 사건과 α = 0.05가 주어지면, 쇤펠드 근사치는 균등한 할당 하에서 약 HR 2.3≥ 임상적으로 관련 위험비를 검출할 수 ≥있는 80% 검정력을 나타냅니다; 이는 관찰된 효과량(HR = 2.31, 95% CI 1.41-3.77)과 일치합니다.

HER2 양성의 정의
HER2 양성은 현대 ASCO/CAP 기준¹³을 따랐다: 면역조직화학(IHC) 3+는 종양 세포의 >10%에서 균일하고 강렬한 막 염색으로 정의되거나, HER2/CEP17 비율≥2.0, 세포당 평균 HER2 복사 수 ≥4.0 신호)로 정의된 제자리 하이브리드화(ISH) 증폭. IHC 2+ 결과는 증폭 상태를 확인하기 위해 ≥20개의 침습성 종양 세포를 맹목적으로 재계산한 반사 ISH 검사를 거쳤습니다.

조직 처리 및 RNA 분리
모든 시술은 지정이 없는 한 얼음 위에서 RNase 무첨가 소모품을 사용하여 시행되었습니다. 100 mg 조직이 ≤ 각 샘플에 대해, 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 시약(AGPC)에서 균질화가 이루어졌고, 이어서 200 μL 클로로포름을 15초 강한 혼합과 2-3분간의 상온 배양 상태로 첨가했습니다. 상 분리는 12,000 x g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리하여 이루어졌습니다. 수층은 신선한 튜브로 옮겨졌고, 10분간 실온에서 배양 후 500 μL 이소프로판올과 함께 RNA를 침전시켰습니다. 펠러팅은 12,000 x g 에서 4°C에서 10분간 완료되었습니다. 펠릿은 75% 에탄올 1mL로 세척한 후 7,500 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리한 뒤, 5-10분간 자연 건조한 후 RNase 무첨가물에 녹였습니다. 유전체 DNA 운반이 의심될 때는 온컬럼 DNase I 소화가 사용되었습니다. 시각적 체크포인트로는 클로로포름 추출 후 명확한 상 분리와 이소프로판올 침전 후 완전한 반투명 펠릿이 포함되었습니다. 문제 해결에는 낮은 A260/230 비율에 대해 에탄올 세척을 반복하고, 강수 연장 또는 펠릿 생산 중 냉각을 보장하는 것이 포함되었습니다.

RNA 품질 관리
정량화는 분광광도법을 사용해 A260/280과 A260/230을 1.8-2.1 정도의 타겟으로 모니터링하고, 정확도를 위해 형광측정 측정으로 보완했습니다. 무결성은 마이크로유체 전기영동 시스템에서 평가되었으며, RIN ≥ 7.0이 요구되었습니다. 18S/28S rRNA 피크와 유전체 DNA 도말 부재가 수용 기준으로 사용되었으며; 임계값을 충족하지 못한 샘플은 재추출하거나 제외되었습니다.

도서관 준비
가닥 mRNA 라이브러리는 온전한 RNA에 대해 poly(A) 선택으로 구성되었고, 부분적으로 분해된 입력에 대해서는 rRNA 소모가 허용되었습니다. 일반적인 입력은 라이브러리당 총 1 μg RNA≥였습니다. 파편화는 약 94°C에서 8분간 수행되었으며; 50 °C에서 50분 동안 첫 가닥 cDNA 합성; 16°C에서 60분간 두 번째 가닥 합성; 어댑터 결합은 20°C에서 15분간 진행; PCR 증폭은 과증폭을 피하기 위해 조정된 10-12 사이클을 사용했습니다. 정화 작업에서는 0.8x-1.0x 근처의 비드 비율을 사용했으며, 예상 라이브러리 크기 분포는 어댑터를 포함해 300 bp였습니다. 라이브러리 품질은 마이크로유체 전기영동으로 검증되었으며; 어댑터-다이머 오염으로 인해 더 엄격한 정화가 필요해졌고, 지나치게 넓은 크기 분포는 단편화를 소폭 단축하여 보정되었다.

시퀀싱
인덱스 라이브러리는 쌍말 150 bp(PE150) 모드로 시퀀싱되었으며, 라이브러리당 3천만 쌍의 읽기 쌍을 목표로 했습니다. 런 레벨 품질은 Q30 ≥ 90%와 안정적인 클러스터 밀도, 최소한의 레인 편향이 요구되었습니다. 라이브러리는 배치 효과를 줄이기 위해 레인별로 무작위로 배치되었고, 기록, 기록된 레인 할당 및 교차 오염 모니터링에 사용되는 센티넬 컨트롤을 기록했습니다.

계산 분석 및 미분식
분석은 리눅스에서 R(v4.3.2)으로 수행되었습니다. 원시 읽기 품질은 FastQC(v0.11.9)로 평가되었습니다. 어댑터 및 품질 트리밍은 fastp(v0.23.4)를 사용하여 자동 어댑터 감지, 슬라이딩 윈도우 트리밍(윈도우 크기 4 bp; 평균 Phred Q ≥ 20), 최소 읽기 길이 50 bp, 그리고 관련 화학이 감지될 때 폴리-G 트리밍을 사용하여 수행되었습니다. 리드는 라이브러리에 적합한 가닥 매개변수와 알려진 접이식 위치 인덱스를 적용한 HISAT2(v2.2.1)를 사용하여 GRCh37/hg19 참조 게놈에 정렬되었습니다. 유전자 수준 카운트는 paired-end counting, chimeric read 처리, 다중 매퍼 인식 설정, 올바른 가닥 플래그를 사용하여 featureCounts(Subread v2.0.3)를 사용하여 GENCODE v19에 대해 생성되었습니다. 저수 유전자는 최소 세 개의 샘플에서 10≥ 개수를 요구하여 필터링되었습니다. 차별식(DE) 분석은 DESeq2(v1.40.2)를 사용하여 paired design(설계 = ~ 쌍 + 조건) 하에 수행되었으며, 기본 크기-인자 정규화와 apeglm을 통한 log2 접수 변화 축소를 적용하여 TMLN과 TDLN을 비교하였습니다. 잠재적 이상치는 쿡의 거리를 사용해 평가했다. 전사체 전체 다중도는 Benjamini-Hochberg 거짓 발견률(FDR)을 사용하여 조절되었습니다. 유의성은 FDR < 0.05, 절대 log2 접수 임계값(|log2FC|) ≥ 1로 정의되었습니다. DESeq2의 음-이항 프레임워크는 개체수 데이터에 적합한 평균-분산 모델링을 제공하며, 소규모에서 중간 정도의 코호트에서 접수 변화 추정치를 안정화합니다. 민감도 분석으로서 동일한 필터링 기준과 FDR 임계값을 사용하여 edgeR과 limma-voom을 사용한 DE 테스트를 재실시했으며, 이는 주요 분석 선택의 견고성을 뒷받침하는 일치하는 상위 순위 신호를 얻었습니다.

기능성 풍부화 (GO 및 KEGG)
함수 주석은 clusterProfiler(v4.8.3)를 사용하여 R에서 수행되었습니다. 상향 및 하향 조절 DEGs는 별도로 분석되었습니다. 유전자 식별자는 풍부화 이전에 엔트레즈 유전자 ID(생물: 호모 사피엔스)와 매핑되었습니다. 유전자 온톨로지(GO) 풍부화는 enrichGO(OrgDb: org. Hs.eg.db; ONT = BP/CC/MF; pAdjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0.05; qvalueCutoff = 0.05), 그리고 KEGG 경로 농축은 enrichKEGG를 사용하여 수행되었습니다(생물체 = "has"; pAdjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0.05; qvalueCutoff = 0.05). 배경 우주는 DE 분석에서 저수 필터링 후 유지된 모든 발현 유전자로 정의되었습니다. 풍부한 용어는 추가로 10-500개의 주석 유전자를 가진 유전자 집합을 유지하도록 필터링되었습니다(minGSSize = 10; maxGSSize = 500). 시각화는 ggplot2(v3.5.1)와 ComplexHeatmap(v2.16.1)을 사용하여 생성되었으며, 유전자 비율과 -log10(조정된 P) 값의 닷플롯을 포함했습니다; "면역 반응 경로"라는 용어는 항원 처리 및 제시, 인터페론 신호 전달, 림프구 활성화를 다루는 엄선된 GO 모듈을 의미합니다.

외부 데이터베이스 조회
후보 유전자는 외부 자원에서 조사하여 정교 맥락을 제공하였습니다. 종양과 정상 mRNA 발현은 GEPIA2(v2.0)를 사용해 TCGA 유방침윤암(TCGA-BRCA) 종양 샘플과 정상 유방 조직(이용 가능한 GTEx/TCGA 정상 유방 조직)을 비교하여 조사하였습니다. GEPIA2가 보고한 발현 값(log2[TPM+1])과 그룹 비교를 위한 기본 통계 테스트 프레임워크를 사용하여 각 조회 유전자에 대해 박스플롯과 P 값을 생성하였습니다. 단백질 수준 위치는 인간 단백질 아틀라스(HPA)를 사용하여 유방 조직/암에 대한 조직 아틀라스 및 병리학 아틀라스의 면역조직화학 이미지와 주석을 검토하고, 가능한 경우 보고된 염색 강도와 세포 구획(예: 기질 대 상피)을 기록하여 평가하였습니다.

qRT-PCR 검증
독립적인 림프절 조직을 위와 같이 처리하여 총 RNA를 추출했으며, 1 μg RNA에서 20 μL 역전사 반응으로 cDNA를 합성하였다. 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)은 SYBR 기반 화학을 사용하여 수행되었으며, 각 반응에는 1개의 마스터 믹스와 각 프라이머 0.2-0.4 μM이 포함되어 있었습니다. 프라이머 특이성은 단일 피크 용융 곡선 프로파일로 확인되었으며, 증폭 효율은 희석 시리즈 표준 곡선을 사용하여 평가되었으며, 허용 효율은 90%-110%로 정의되었습니다. 각 샘플은 기술적으로 3중으로 분석되었으며; 복제는 주기 임계값(Ct) SD ≤ 0.3을 충족해야 했습니다. 유전자 발현은 GAPDH(또는 해당되는 경우 다른 검증된 참조 유전자)로 정규화되었고, 상대 발현은 2^-ΔΔCt 방법으로 계산되었습니다. 정상성은 샤피로-윌크 검정을 사용하여 평가되었으며; 그룹 간 비교에서는 대략 정상 데이터에 대해 양측 t-검정을, 그렇지 않은 경우에는 Mann-Whitney U 검정을 사용했습니다.

검증 코호트에서의 예후 분석
무질병 생존율(DFS)이 주요 평가변수로, 수술 날짜부터 최초 재발 기록 또는 마지막 추적 관찰(검열됨)까지 계산되었습니다. 1차 분석에서는 X타일로 결정된 컷포인트에서 POSTN 발현을 이분법(High 대 Low = 40/80)으로 이분화하였다; 민감도 분석에서는 삼중타위와 같은 대체 컷포인트를 사용했습니다. 카플란-마이어 곡선과 로그 랭크 검정이 단변량 비교에 사용되었습니다. 다변수 Cox 비례 위험 모델을 이용해 위험비(HR)와 95% 신뢰구간을 추정하였으며, 연령, 종양 크기, 결절 상태, 조직학적 등급, 수용체 상태를 사전 조정하였습니다. 비례 위험 가정은 쇤펠드 잔차를 사용해 평가되었고, 공선성은 분산-인플레이션 인플레이션을 사용해 검토되었으며, 영향력 있는 관찰은 dfbeta를 사용해 평가하였다. 위에서 설명한 추적 관찰 누락 또는 불완전한 공변량이 있는 사례를 제외한 후 완전한 사례 분석이 수행되었습니다.

일반 통계 및 보고
특별한 언급이 없는 한, 데이터는 평균 ± SD 또는 중앙값(IQR)으로 요약되며, 양측 검정을 사용하고, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다. 전사체 전체 분석 및 농축의 경우, 다중 범위는 BH-FDR로 제어되며, 효과 크기는 가능할 경우 95% 신뢰구간과 함께 제공됩니다.

안전 및 폐기물 처리
페놀-구아니디늄 시약과 유기 용매는 인증된 연기 후드에서 실험실 코팅, 니트릴 장갑, 스플래시 방지 장치를 착용하여 취급되었습니다. 유기물 및 할로겐 폐기물은 라벨이 붙은 용기에 분리되어 기관 정책에 따라 폐기되었습니다. 생물학적 폐기물은 폐기 전에 오토클레이브 또는 화학 소독되었고, 표면과 도구는 RNase 비활성화 용액으로 오염 제거되었습니다. 부식성 및 독성과 같은 시약별 위험은 실험실 표준 절차(SOP)에 문서화되었고 모든 절차에서 관찰되었습니다.

결과

코호트 및 임상병리학적 특성
발견 코호트는 6개의 쌍을 이룬 TDLN/TMLN 샘플로 구성되었고, 검증 코호트는 120개의 아카이브 림프절 표본과 종단 추적 관찰로 구성되었습니다. 나이, 종양 크기, 등급, 수용체 상태, 결절 상태 등 두 코호트의 기초 임상 병리학적 특성은 표 1에 요약되어 있습니다.

시퀀싱 품질 및 글로벌 데이터 구조
12개의 발견 라이브러리 모두 샘플당 약 3천만 쌍의 리드 페어를 중앙값으로 달성했으며, Q30은 90%≥, 매핑률> 85%에 달했습니다. 분산 안정화 카운트의 주성분 분석에서는 이상치가 없었고, 노드 상태에 따른 예상 분리가 TDLN과 TMLN이 뚜렷한 클러스터를 형성함을 보여주었습니다. 전체 유전체 차별 발현에 대한 개요는 그림 1A-B에 나와 있으며, ...

토론

HER2 양성 유방암은 침습성 증가, 빈번한 림프절 전이(LNM), 그리고 현대 전신 치료에도 불구하고 열악한 결과가 특징입니다¹⁵. 기존의 임상병리학적 요인은 이 아형에서 예후를 부분적으로만 설명하므로, 결절 전파 위험을 포착하는 생물학적 근거 지표에 공백이 남아 있습니다. 종양 배액 림프절(TDLN)과 종양 전이 림프절(TMLN)을 RNA-seq와 비교 프로파일링함으로써, 우리는 세포외기질(ECM) 재형성, 면역 및 항원 제시 프로그램, 그리고 전이 능력과 림프절 지적 적응에 관여하는 지질-대사 경로 축에 수렴하는 237개의 차별발현 유전자(DEGs)를 확인했습니다¹⁷.

유전자 존재론 범주는 인터페론 매개 신호전달, 항원 처리 및 제시, 소포 운송, MHC 복합체 구성 요소...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
바이오분석기	2100-BA	애질런트, 미국	RNA 무결성 및 품질 관리 평가 장비.
DESeq2	해당 없음	R 생도체	RNA-seq 데이터를 위한 차별 발현 분석 소프트웨어.
FastQC 소프트웨어	해당 없음	바브라함 바이오인포매틱스	RNA-seq 데이터를 위한 품질 관리 소프트웨어로 서열 품질을 평가합니다.
HEK293 세포주	ATCC-CRL-1573	ATCC, 미국	형질전환 실험에 사용된 인간 배아 신장 세포주.
qRT-PCR 키트	4385616	서모피셔, 미국	유전자 발현 검증을 위한 정량적 PCR 키트.
RNA 추출 키트	74204	치아겐, 독일	조직 샘플에서 고품질 RNA를 분리하는 데 사용되는 RNA 추출 키트.
RNA 시퀀싱 키트	RS-122-2001	일루미나, 미국	RNA 샘플 시퀀싱을 위한 RNA 라이브러리 준비 키트.
시퀀싱 플랫폼	노바세쿼터 6000	일루미나, 미국	RNA 라이브러리 시퀀싱을 위한 고처리량 RNA 시퀀싱 플랫폼.
조직 냉동 장비	TFE-300	미국 서모 피셔	액체 질소에 조직 샘플을 얼리는 장비.
고뇌 체온계	55678-TT	ThermoScience, 일본	체온 측정에 사용되는 정확한 온도계.