쥐 광내 MCAO 모델의 표준화: 품질 관리 조치가 포함된 상세 프로토콜

요약

이 프로토콜은 쥐를 대상으로 최적화된 60분 중뇌동맥 폐색(MCAO) 기법을 시연합니다. 이 프로토콜은 다중 모달 접근법을 사용하여 검증되었으며, 87.5%의 성공률과 최소한의 사망률을 달성하고 뇌졸중 연구에 대한 경색 및 행동 결과를 재현 가능하게 제공합니다.

초록

쥐 중뇌동맥 폐색(MCAO) 모델은 허혈성 뇌졸중 병태생리를 규명하고 신경보호 치료법을 검증하는 기준으로 남아 있습니다. 그러나 미묘한 수술적 편차는 경색량과 행동 결과를 크게 바꿀 수 있습니다. "시각화 후 체계화" 프레임워크를 사용하여 모델 구축과 검증의 모든 단계를 재검토했습니다. 주요 수술 지점과 중요한 단계에 대한 상세한 사진 기록이 이루어져 해부학적 방향과 필라멘트 배치를 표준화하였습니다. 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염색(TTC) 염색을 사용하여 재관류 후 24시간 및 72시간 경근의 부피와 토포질을 정밀히 매핑하였습니다. 신경학적 결손은 Zea-Longa, Bederson, 수정 가르시아 척도로 평가되었습니다. 24마리의 수컷 스프래그-도울리 쥐가 60분간 일시적인 MCAO를 받았고; 경색량과 신경학적 점수는 24시간과 72시간에 평가되었습니다. 약 87.50%의 동물이 성공적인 뇌혈류 차단(Zea-Longa ≥ 1 및 명확한 TTC 정의 심색)을 달성했으며, 전체 사망률은 12.50%로 모델의 높은 충실도를 입증했습니다. 이 표준화된 프로토콜은 전임상 뇌졸중 연구를 위한 기술적으로 정교하고 재현 가능한 기반을 제공하여 뇌졸중 병태생리와 치료 중재를 조사하는 연구에서 실험실 간 일관성을 촉진합니다.

서론

뇌졸중은 전 세계적으로 두 번째로 많은 사망 원인이자 세 번째로 큰 장애 원인입니다 ^1,2. 뇌졸중은 저소득 및 중간 소득 국가에 불균형적으로 영향을 미치며, 이들 국가에서는 평균 고소^{득 국가보다} 15년 더 일찍 발생한다. 주요 유형은 허혈성 뇌졸중(85%)과 뇌내출혈(15%)입니다^. 허혈성 뇌중은 뇌졸중의 대다수를 차지하며, 뇌 혈류 차단으로 인해 세포 사멸과 뇌경색이^{발생합니다.} 허혈성 연쇄 반응은 여러 생화학적 사건을 포함하며, 여기에는 중요한 촉진 산화 과정 ^5,6.

광범위한 전임상 및 임상적 노력에도 불구하고, 조직 플라스미노겐 활성화제를 이용한 정맥 내 혈전용해술과 기계적 혈전절제술 등 극소수의 치료법만이 효과가 입증되었으며, 이러한 치료법들은 제한된 치료 기간과 엄격한 환자 선택 기준에 의해 제한되고 있습니다. 따라서 허혈성 손상, 신경혈관 회복, 뇌졸중 후 회복의 세포 및 분자 기전을 명확히 밝힐 필요가 시급합니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 재현 가능하고 임상적으로 적합한 동물 모델이 필수적입니다.

중대뇌동맥 폐색(MCAO) 모델은 설치류의 허혈성 뇌졸중을 연구하는 데 널리 사용됩니다 ^7,8. 인라루날(intraluminal filament) 폐쇄법은 MCAO^{기법 중} 가장 고전적이고 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 이 기법은 두개골 절제술 없이도 영구 폐색과 일과성 폐색을 모두 모델링할 수 있습니다. 혈관 내 와이어를 이용한 새로운 경대퇴골 기법은 쥐에서 일시적인 MCAO를 유도하는 데 유망함을 보여주었으며, 더 일관된 결과를 제공합니다¹⁰. 이 모델은 일반적으로 뇌관 내 필라멘트 기법(¹¹)을 사용하여 중뇌동맥을 막는 방식을 포함합니다. MCAO는 국소 뇌 저관류를 일으켜 허혈과 재관류 손상을 유발합니다¹².

MCAO는 뇌졸중 병태생리와 잠재적 치료법 연구에 유용하지만, 변태 볼륨에 따라 달라질 수^{있습니다. 7}. 따라서 재관류 기법 개선, 표준화된 수술 프로토콜 수립, 통합 평가 기준 개발과 같은 MCAO 모델 개선은 경색 위치 및 부피의 변동성을 줄여 허혈성 뇌졸중 연구에서의 유용성을 높일 수 있습니다.

이 프로토콜은 일관된 결과를 얻기 위해 약 10–15회의 수술을 거쳐야 합니다¹³. 성공률은 운영자의 경험과 쥐 계통에 따라 다를 수 있습니다¹⁴. 이 모델은 급성 허혈성 뇌졸중 연구에 적합하지만 고혈압이나 당뇨병과 같은 인간 동반 질환을 완전히 재현하지 못할 수 있습니다^. 이에 따라 표준화된 절차와 엄격한 품질 관리 조치를 통해 실험적 변동성을 줄이기 위한 최적화된 MCAO 프로토콜을 고안하고 엄격히 검증하고자 했습니다. 표준화와 데이터 신뢰성의 이중 향상을 위해 네 가지 보완적 혁신이 통합되었습니다: (1) 이중 시간점 종단 평가—Zea-Longa, Bederson, Modified Garcia 척도의 신경학적 점수를 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 유래 경색 부피와 병행하여 재관류 후 24시간 및 72시간 경전에 얻어, 부종 해소와 기능 회복 간의 시간적 관계를 명확히 했습니다; (2) 삼중 척도 교차 검증—통합 삼척도 교정을 통한 블라인드 이중 연구자 채점이 행동 평가의 민감도와 정밀도를 유의미하게 높였습니다; (3) 전과정 저체온 신속 절단—"90초 얼음 배 추출 후 사전 냉각 몰드에서 단일 단계 2mm 코로날 절단"이라는 표준 운영 절차(SOP)가 자가분해와 인간 오류를 최소화하고 고충실도 체적 측정을 보장하기 위해 확립되었습니다; (4) 통합 품질 관리 프레임워크—수술 전 단식, 마취 깊이 조절, 수술 전 체온 조절, 교차 오염 방지 전반에 걸친 종합 표준 운영 절차(SOP)를 구축하여 재현 가능하고 쉽게 전이 가능한 MCAO 표준 운영 절차를 제공하여 실험실 간 일관성과 연구 간 비교 가능성을 위한 견고한 토대를 마다지었습니다.

프로토콜

이 실험은 수도의과대학 기관동물실험 및 실험동물복지위원회의 승인 및 감독을 받았습니다. 모든 프로토콜은 NIH 실험동물 관리 및 사용 가이드(NIH 출판 80-23, 1996년 개정판)를 준수했으며, 멸균 장비와 무균 기술이 요구되었습니다.

1. 동물 선택

1. 인증된 실험동물 공급업체(허가 번호 SCXK (베이징) 2021-0011) MCAO 모델을 확립하기 위해 작성되었습니다.
2. 동물들을 관례적으로 원하는 음식과 물을 제공하고; 모든 절차는 국제 윤리 강령을 준수했습니다.
3. 필라멘트 크기 선택 시 동물 체중을 기준으로 다음 기준을 사용하여 일관된 폐쇄를 보장하세요:
   - 220–250 g: 직경 0.33–0.35 mm
   - 250–280 g: 직경 0.35–0.38 mm
   - 280–310 g: 직경 0.38–0.40 mm
   참고: 이 규격은 연령 관련 혈관 직경 증가를 고려하여 SAH 또는 불완전 폐색 발생률을 감소^{시킵니다.}

2. 표본 크기

1. 샘플 크기 계산 소프트웨어를 사용해 샘플 크기를 계산하세요. MCAO 그룹에서 예상 경색량이 35% ± 10%(평균 ± SD)인 반면 SHAM 그룹은 0% ± 2%임을 보여주는 예비 데이터를 바탕으로, 효과 크기(Cohen's d)를 추정합니다. 양측 맨-휘트니 U 검정(t-검정의 비모수 대안)을 α = 0.05이고 거듭제곱(1-β) = 0.80인 경우, 최소 표본 크기를 계산합니다.
   참고: 효과 크기는 3.5로 추정되었으며, 최소 표본 크기는 그룹당 6마리였습니다.
2. 예상 사망률(12.5%)과 배제율(5–10%)을 고려하기 위해 MCAO 그룹에 24마리, SHAM 그룹에 6마리의 쥐를 포함시켜, 주요 평가변수(24시간 경색량)에 대해 적절한 검정력(>0.90)을 제공하였습니다.

3. 포함 및 제외 기준

1. 다음 기준을 충족하는 동물을 포함하세요: (1) 수컷 스프래그-도울리 쥐, 240–270g, 6–8주 생기; (2) 기존의 신경학적 결손 부재(수술 전 신경 점수 = 0); (3) 합병증 없이 성공적으로 마취 유도.
2. 다음과 같은 동물을 분석에서 제외하십시오: (1) 부검 시 나타나는 지주막하 출혈(SAH); (2) 재관류 후 <24시간 이내) 실험적 개입과 관련 없는 조기 사망; (3) 폐색 실패(신경학적 점수 = 0 및 TTC 정의 경색 부재); (4) 기술적 수술 실패(예: CCA 파열).
   참고: 이 기준들은 선택 편향을 최소화하기 위해 연구 시작 전에 미리 정해졌습니다.
3. 동물 대체 정책: 통계적 검정력을 유지하기 위해 기술적 수술 실패나 수술 중 사망으로 제외된 동물만 교체합니다. 실패한 모델링(폐색 실패)으로 동물을 대체하지 말고, 변동성을 인위적으로 줄이지 않도록 성공률 계산의 일부로 보고하세요.

4. 수술 전 준비

1. 오토클레이드 도구, 멸균 필라멘트, 드레이프 필드를 준비하세요.
2. 규칙적인 단식은 필요하지 않습니다; 필요 시 단식 시간을 2–4시간으로 제한하세요. 이소플루란(3–4%)으로 마취를 유도하고, 시술 중 30–40% 산소 농도에서 1.5–2%를 유지합니다. 마취 깊이를 교정 반사와 발가락 집힘 상실로 확인하세요.
3. 직장 온도 모니터링과 피드백 제어 온열 패드를 사용해 체온을 37± 0.5 °C로 유지하세요.
4. 목과 두피를 면도한 후 포비돈-요오드로 해당 부위를 깨끗이 닦고, 이어서 70% 에탄올을 사용하세요.
5. 부프레노르핀(0.05 mg/kg, 피하 투여)은 수술 30분 전, 수술 후 12시간마다 48시간 동안 투여하거나, 멜록시캄(1 mg/kg, 피하 투여)을 하루 1회 3일¹⁶일 투여합니다. 그루밍 행동, 자세, 자발적 활동을 모니터링하여 통증을 평가합니다; 불편한 증상이 계속되면 추가 진통제를 투여하세요.

5. MCA의 폐색

1. 쥐를 등을 누운 자세로 눕히고, 머리를 부드럽게 펴서 복부 목을 드러냅니다.
2. 홍채 가위를 사용해 경추 중앙선(1.5–2.0cm) 절개를 하세요.
3. 곡선 겸자를 사용해 흉선돌상근과 오모하듬근을 무딘 분리하여 좌측 총경동맥(CCA) 분기부를 노출시켰습니다.
4. 외경동맥(ECA)은 원단 4-0 실크 봉합사로, 말위부는 임시 결찰로 결찰합니다. 두 ECA 결찰 사이에 미세가위를 사용해 작은 절개를 만드세요.
5. 미세혈관 클램프(60g 압력)를 사용해 CCA와 내경동맥(ICA)을 일시적으로 막으세요.
6. ECA 절개를 통해 4-0 실리콘 코팅 단필라멘트(직경 0.35–0.40 mm)를 삽입합니다. CCA로 역행시키고, CCA 분기점을 넘어 ICA로 방향을 바꾸세요.
   참고: 필라멘트가 측면으로 갈라지는 pterygopalatine artery(PPA)가 아니라 두개골 기저 쪽으로 ICA에 들어가도록 하세요. <10 mm에서 저항이 발생하면 필라멘트를 수축하고, 동물의 머리를 반대편 쪽으로 30° 회전시킨 뒤, PPA 원점을 지나 방향을 바꾸기 위해 다시 전진합니다.
7. 필라멘트를 CCA 분기점에서 18–20mm 앞으로 이동시키고, 약간의 저항이 MCA 기원의 폐쇄를 나타낼 때까지 진행합니다. 필라멘트에 미리 표시된 기준선(실리콘 마개에서 2mm 가까운 위치)을 사용해 깊이를 확인하고, ECA 그루터기 삽입 지점에서 캘리퍼로 측정합니다. 필라멘트가 제자리에 들어가면 CCA 클램프를 풀어주세요.

6. 재관류

1. 60분 동안 폐쇄 후 절개 부위를 다시 열고 임시 ECA 결찰을 느슨하게 하세요.
2. 필라멘트의 끝이 ECA 절단 부위를 벗어날 때까지 부드럽게 빼내어 혈류를 회복시킵니다. 즉시 부위 근처에 영구 결찰을 하여 등출혈을 방지하세요. 상처를 여러 겹으로 봉합하세요.
3. 쥐를 따뜻한 회복 케이지로 옮겨 지속적인 모니터링을 하세요.

7. 가짜 수술

1. 위에서 설명한 MCAO와 동일한 절차(단식, 마취, 온도 조절, 멸균 덮개)를 따라 동물을 준비하세요.
2. 위와 같이 경추 절개와 CCA 분기 노출을 시행합니다.
3. 혈관을 해부하고 노출하세요. 필라멘트를 삽입하지 마세요.
4. 동맥은 개활한 상태로 남겨두고; 뇌허혈을 유발하지 마세요.
5. 노출 후 절개 부위를 층으로 닫으세요. 동물을 따뜻한 회복 케이지로 옮겨 모니터링하세요.

8. 수술 후 신경학적 점수

1. 경색 부피 측정을 위해 희생 직전, 재수류 후 24시간과 72시간에 평가하십시오.
2. 조용한 방에서 25°C에서 30분간 익숙해지세요.
3. 두 명의 독립 조사관에게 그룹 배정을 눈가리치게 하세요. 각 조사관이 별도의 점수 시트에 상의 없이 기록하도록 하고; 평가자 간 차이≥1점이 있으면 재평가가 촉발됩니다.
4. 척도(투여 순서대): Zea-Longa¹⁷(표 1), Bederson¹⁸ (표 2), 수정 가르시아¹⁹ (표 3) 점수 산정을 수행하며, 일관된 기준을 위한 최신 발표 프로토콜에 따라 수행합니다.
5. 두 관찰자의 평균을 통계 분석에 사용하세요. 평균 점수가 >10% 차이가 있으면 어떤 동물의 데이터도 제외하고 새로운 피험자로 대체하세요.

9. 뇌 경색 부피 측정

1. 재관류 후 24시간과 72시간이 지나면 5% 이소플루란으로 쥐를 심하게 마취합니다. 재직 반사와 발가락 꼬집기 반응 상실, 그리고 안정적인 호흡을 통해 깊은 마취를 확인한 후 진행하세요.
2. 심마취 확인 후 90초 이내에 뇌를 신속히 제거하고, 얼음처럼 차가운 PBS로 헹군 후 냉각된 쥐 뇌 매트릭스를 사용해 2mm 코로나 조각으로 잘라내세요. 슬라이스 시 다음 주의사항을 준수하세요
   1. 전체 시술을 0–4 °C에서 얼음 위에 보관하세요; 90초 이내에 뇌를 채취해 미리 냉각된 매트릭스에 평평하게 배치하세요.
   2. 날카로운 칼날을 사용해 정밀한 2mm 코로나 단면을 위해 단일 깨끗한 절단을 하고, 각 절면을 원미-꼬리 순서대로 얼음처럼 차가운 PBS로 모으세요.
   3. 교차 오염을 방지하기 위해 동물 간 매트릭스와 칼날을 75% 에탄올로 즉시 청소하세요.
3. 2% TTC를 37°C까지 미리 데운 후, 조각을 완전히 담가 어둠 속에서 20분간 부드럽게 부양시키고, 20분 동안 5분마다 부드럽게 휘저어 둡니다.
4. 4 °C PBS로 세 번 헹구어 즉시 반응을 멈추세요. 그 다음 4% 파라포름알데히드를 4°C에서 하룻밤 고정하세요.
5. 300 dpi에서 모든 슬라이스의 양면을 한 번씩 촬영하세요.
   1. 흰색 배경에 고정 조명을 사용해 그림자와 반사를 제거하세요.
   2. 겹치지 않고 슬라이스를 평평하게 놓고, 각 프레임에 스케일 바와 ID 라벨을 포함하세요. 카메라를 각 섹션에 수직으로 잡고 초점 거리와 화이트 밸런스를 일정하게 유지하세요.
6. ImageJ를 사용해 경색량을 정량화하세요.
   1. 300 dpi 이미지(RGB 포맷)를 가져오고 8비트 그레이스케일(이미지 > 타입 > 8비트)로 변환하세요.
   2. 오츠의 자동 임계값 조정(이미지 > 자동 임계값 조정 >> 오츠 선택)을 적용하여 경색(흰색)과 생존 가능한 조직(빨간색)을 분리합니다.
   3. Freehand 선택 도구를 사용해 동쪽 반구 경계를 윤곽 그려보세요.
   4. 면적을 측정(분석 > 측정)하고 픽셀 수를 기록하세요.
   5. 경색 부피를 계산하세요: Σ(경색 면적× 절개 두께 [2 mm]) × (반대쪽 반구 부피/동측 반구 부피), 대쪽 반구의 백분율로 표현됩니다.

10. 통계 분석

1. ±적절히 기준 편차(SD) 또는 중간 값 [4분위 범위]로 데이터를 제시하세요.
2. 비정규 분포 데이터에 대해 쌍이 없는 학생 t-검정 또는 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 그룹 간 비교를 수행합니다.
3. 통계적 유의성을 P < 0.05로 설정하라. 모든 분석은 적절한 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하세요.

결과

동물들은 말단 임신 유산 염색을 위해 24시간(n = 10) 또는 72시간(n = 10) 생존 그룹에 무작위로 배정되었습니다. 추가로 4마리의 쥐가 MCAO를 받았으나 예정된 종말점 이전에 사망했습니다(사망률 12.5%). SHAM 군은 n = 6으로 구성되었다. 따라서 총 사용된 동물 수는 30마리(MCAO 24마리 + SHAM 6마리)였습니다.

쥐들은 뇌허혈을 유도하기 위해 60분간의 MCAO를 받았습니다(그림 1). 재관류는 하강내 섬유를 제거하고 ECA에서 근위 결찰을 해제함으로써 시작되었습니다. 24마리의 MCAO 쥐 중 3마리는 72시간 이내에 사망했으며; 한 명은 사후 임신 염색 후 24시간 이내에 광범위한 경색을 보였고, 다른 한 명은 72시간 이내에 원인 불명의 사망을 보였다. 추가로 두 마리의 쥐는 모델링 실패로 제외되었으며(신경학적 점수는 기준을 충족하지 못했고, TTC 염색 결과 경색은 발견되지 않았다). 따라서 72시간 사망률은 12.50%였습니다. 성공적인 모델 구축을 24시간 생존과 롱가 점수 1–3으로 정의했으며, 성공률은 87.50%에 달했습니다.

신경학적 기능은 뇌졸중 발현 후 24시간과 72시간(경색 부피 측정 전)에 평가하였다. 문헌에서 가장 흔히 사용되는 세 가지 척도인 Zea-Longa, Bederson, 수정된 가르시아가 포괄적인 평가를 위해 사용되었다(그림 2). 24시간 시점에 쥐들(n = 20)은 Zea-Longa 척도에서 2.02 ± 0.41, Bederson 척도에서 2.80 ± 0.41, 수정 가르시아 척도에서 8.15 ± 1.18을 기록했다; 이 적자는 72시간으로 두드러졌다(제아롱가: 1.65 ± 0.59; 베더슨: 1.93 ± 0.38; 수정된 가르시아: 11.00 ± 1.34). 경색량은 반대반구 비율로 표현되었으며, MCAO 후 24시간 기준으로 37.61± 2.81%였으며, 72시간에는 28.32%± 4.18%로 감소하였다.

그림 1: 쥐의 좌측 경추-대뇌동맥 생리학과 중뇌동맥색전증의 개식도. (A) 경추-대뇌 동맥 해부학, (B) 삽입 전, (C) 삽입 후, (D) pterygopalatine 동맥으로의 필라멘트 위치 부위의 개략 도식. CCA: 총경동맥; ICA: 내경동맥; ECA: 외경동맥; PPA: pterygopalatine artery; MCA: 중뇌동맥입니다. "검은 삼각형": 절개 부위; 파란 선: 필라멘트. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 쥐의 뇌동맥 폐색 후 경색 부피 측정 및 신경학적 행동 평가. (A) 뇌 절편의 임신 임신 착색. (B) 72시간 경색 부피가 24시간 때보다 작다. (C,D) 72시간 시점의 Zea-Longa 점수와 Bederson 점수가 24시간 때보다 낮다. (E) 72시간 시점의 수정 Garcia 점수가 24시간 때보다 높다. ****P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

현현	점수 / 점수
신경학적 결손은 없습니다	0
꼬리 현각 중 반대쪽 앞다리가 굽히고 내전(경미한 신경학적 결손)	1
기어 다닐 때 반대쪽으로 자발적으로 원을 그리며 움직이는 현상(중간 정도 신경학적 결손)	2
서 있거나 걸을 때 반대쪽으로 넘어짐	3
(심각한 신경학적 결손)
의식 저하가 동반되는 자발적인 움직임은 없다	4

표 1: 제아롱가 점수^.

현현	점수/점수
동물의 꼬리를 잡고 몸통이 벤치 위 10cm 높이에 매달리도록 들어 올립니다. 일반 쥐에서는 양쪽 앞다리가 바닥 쪽으로 뻗어 있습니다. 신경학적 결손이 있는 쥐는 다음과 같은 행동을 보일 수 있습니다:
신경학적 결손은 없습니다	0
무호흡 전다리는 굽혀져 복부 가까이에 고정되고, 손상되지 않은 팔다리는 벤치 쪽으로 뻗어 있습니다	1
1에서 설명한 행동 외에도, 동물을 벤치에 엎드려 놓으면 측면 밀어내기에 대한 저항이 현저히 감소합니다	2
1, 2에서 설명한 행동 외에도, 동물은 걷을 때 파레틱 쪽으로 원을 그리며 움직인다	3

표 2: 베더슨 점수^.

항목	현현	점수/점수
a) 자발적 움직임	정상 활동	3
(쥐가 우리 안에서 5분간 활동을 관찰하세요)	약간 장애가 있습니다	2
	중등도 장애	1
	즉흥적인 움직임은 없어	0
b) 대칭 사지 움직임	대칭 자세	3
	비대칭 자세	2
	편마비	1
c) 앞부분 뻗기	대칭	3
(꼬리를 잡고 앞다리를 테이블 가장자리 쪽으로 당기고; 앞발 확장을 관찰하세요)	약간 비대칭	2
	눈에 띄게 비대칭	1
	편마비	0
d) 그립 및 등반 능력	단단한 그립으로 강하게 등반합니다	3
	일측 결손 관찰	2
	오르거나 원을 돌 수 없음	1
e) 몸의 양측 촉각 반사	양쪽 모두 대칭	3
	한쪽은 느린 반응	2
	한쪽에서는 아무런 반응이 없었다	1
f) 양측 진동 촉각 반응	대칭	3
	비대칭	2
	응답이 없어	1

표 3: 수정 가르시아 점수. 총점: 0–18점; 점수가 높을수록 신경학적 기능이 더 우수함을 의미합니다.

토론

이 연구의 주요 목표가 생물학적 발견이 아니라 방법론적 표준화였다는 점을 명확히 하는 것이 중요합니다. 표준화된 MCAO 프로토콜 개발은 허혈성 뇌졸중 연구에서 실험실 간 변동성을 줄이고 재현성을 높이는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 엄격한 품질 관리 조치를 통해 절차적 투명성을 높이고, 표준화된 필라멘트 삽입, 온도 조절, 조직학적 처리 등 MCAO 모델링에서 흔히 발생하는 기술적 결함을 해결합니다.

경색량이 24시간에서 72시간으로 감소하고 부분적인 신경학적 회복이 일시적인 MCAO에서 예상되는 병태생리학적 현상을 나타내지만, 이 연구의 기여는 엄격히 표준화된 절차를 통해 이러한 종말점의 시간적 신뢰성을 확립하는 데 있습니다. 상세하고 단계별 기술적 틀을 제공함으로써, 이 프로토콜은 신경염증 연쇄 반응, 세포자멸사 경로, 치료 중재 등 향후 기전 연구가 재현 가능하고 비교 가능한 기초 데이터를 기반으로 구축되도록 보장합니다. 우리는 이 연구를 JoVE의 범위에 부합하는 기술적 자원으로 명확히 위치시키며, 기전적 통찰을 발전시키기보다는 표준화된 전임상 뇌졸중 연구의 기초를 제공합니다.

이 프로토콜의 여러 단계는 일관된 허혈과 재관류를 보장하는 데 특히 중요합니다. 첫째, 교합선을 정확히 전진시켜 약간의 저항이 느껴질 때까지 진행하는 것이 재현 가능한 MCAO를 달성하는 데 필수적이다. 삽입 깊이에 약간의 편차가 있어도 불완전 폐쇄나 지주막하 출혈로 이어질 수 있기 때문이다^20,21. 둘째, 엄격한 수술 중 정상 체온(37 ± 0.5 °C)과 수술 후 체온 관리가 매우 중요합니다. 너무 낮거나 높으면 경색 부위와 신경학적 결과에 큰 변화를 줄 수 있습니다^12,22. 셋째, 90초 이내에 뇌를 신속히 제거하고 얼음 욕조 냉각을 수행하면 자가분해를 최소화하고 조직의 무결성을 유지하여 TTC 염색과 부피 분석의 정확성을 보장할 수 있습니다^. 이러한 단계들이 일관되게 구현된다면, 모델 정확도와 연구 간 비교 가능성을 크게 향상시킬 수 있습니다.

우리는 전통적인 MCAO 방법을 개선하여 재현성과 사용 편의성을 높였습니다. 미리 냉각된 뇌 슬라이스 몰드와 표준화된 슬라이스 프로토콜의 사용으로 인적 오류와 슬라이스 인공물을 줄였습니다. 또한, 두 명의 맹검 연구자가 3척도(Zea-Longa, Bederson, 수정 Garcia) 신경 기능 평가를 채택하면서 기능 평가의 견고성과 민감도가 향상되었습니다^{17, 18, 19}. 각 프로그램 단계를 다루는 상세한 표준 운영 절차를 통해 필라멘트 위치 이상, 조기 재관류, 수술 후 저체온증과 같은 일반적인 문제를 식별하는 데 도움을 줍니다. 일반적인 합병증에 대한 문제 해결 지침은 다음과 같습니다: (1) 10–12mm 저항 부족으로 인식되는 잘못된 교합선(PPA 진입)과 즉각적인 신경학적 개선—발견 시 즉시 필라멘트를 당기고, 동물의 머리를 반대쪽 쪽으로 30° 회전시킨 뒤, 약간의 내측 각도로 두개골 기저 쪽으로 다시 전진; (2) 조기 재관류(폐쇄 중 갑작스러운 신경학적 개선으로 나타난다)—실리콘 마개가 ECA 절단 부위에 단단히 고정되어 있고, 필라멘트 직경이 동맥 크기와 일치하는지 확인(240–270g 쥐의 경우 0.35–0.40 mm), 변위가 지속되면 더 긴 필라멘트 사용(실리콘 코팅 0.5mm 증가) 고려; 그리고 (3) 수술 후 저체온증(직장 온도<36ºC)—온열 패드 온도를 38°C로 올리고, 동물 위 30cm 높이에 열램프를 설치하며, 따뜻한 멸균 식염수(복강 내 37ºC, 0.5mL)를 투여합니다.

이러한 발전에도 불구하고, 이 프로토콜에는 여러 한계가 있습니다. 첫째, 이 기술은 일관된 성공률을 달성하기 위해 상당한 학습 곡선(10–15번의 수술)이 필요하며, 쥐의 혈관 해부학적 개인별 차이가 필라멘트 배치에 영향을 미칠 수 있습니다^21,24. 둘째, 본 프로토콜은 수술 중 뇌혈류 모니터링(LDF 또는 LSCI) 대신 사후 검증(신경학적 점수 및 TTC 염색)에 의존하고 있어 수술 중 품질 관리를 제한하고 불완전 폐쇄 동물의 조기 제외를 불가능하게 한다²⁵. 셋째, 검증은 어린 수컷 스프래그-도울리 쥐에 한정되어 암컷, 노령 동물, 그리고 동반 모델에 대한 일반화가 제한되었다^26,27. 향후 연구에는 (1) 성별을 생물학적 변수로 다루기 위해 남녀 양쪽을 포함해야 합니다; (2) 혈관 동반 질환이 있는 12–18개월 노령 쥐; 그리고 (3) 약물 중재 연구에서 재현성을 높이기 위한 실시간 CBF 모니터링.

이 방법은 결과의 일관성과 중개 관련성이 매우 중요하기 때문에 전임상 약물 선별에서 특히 가치가 있습니다. 이 글에서 설명한 표준화된 프로토콜은 허혈성 뇌졸중 연구의 엄격성과 재현성을 높이는 데 큰 가능성을 지니고 있습니다. 이 프로토콜의 향후 적용 분야는 다음과 같습니다: (1) 재관류 기간 동안 투여된 신경보호제의 전임상 선별; (2) 24시간 및 72시간 시점을 이용한 허혈-재관류 손상의 기전적 연구; (3) 뇌졸중 후 신경가소성 및 기능 회복 조사; 그리고 (4) 유전학적 또는 약리학적 중재와 병행하여 치료 표적의 검증. 상세하고 영상이 지원되는 SOP를 제공함으로써, 저희는 이 방법이 다양한 전문 수준의 실험실에서 널리 채택되도록 촉진하고, 궁극적으로 보다 신뢰할 수 있고 임상적으로 적합한 전임상 뇌졸중 연구에 기여하는 것을 목표로 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2% TTC 염색 용액	베이징 Solarbio 과학 & 기술 유한 회사	T8170	25 g/병, ≥98 % 순도
4% PFA	베이징 Solarbio 과학 & 기술 유한 회사	P1110	500 mL 즉시 사용 가능
흡수성 봉합사	산동 웨이가오 그룹 의료 폴리머 유한 회사	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson 핀셋	상하이 진중 수술 기기 유한 회사	JD-11010	1×2 치아, 12 cm
Dumont 곡선 핀셋	상하이 진중 수술 기기 유한 회사	JD-11052	11 cm 길이, 0.05 mm 미세 팁
피드백 발열 패드	심천 보상 생명 과학 & 기술 유한 회사	69001	37 ± 0.3 °C 폐쇄 루프
ImageJ	미국 국립 보건원	버전 1.53k
아이리스 가위	상하이 진중 수술 기기 유한 회사	JD-14060	곡선 팁, 10 cm
마이크로 혈관 클립	심천 루이워데 리프트 기술 유한 회사	JD-16010	1.5 cm 곡선 클립
비 흡수성 실크	상하이 푸동 진환 의료 제품 유한 회사	S-2304	6-0 블랙 실크 실
PASS 소프트웨어	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	버전 15.0	샘플 크기 계산 소프트웨어
쥐 뇌 매트릭스	심천 루이워데 리프트 기술 유한 회사	68610	2 mm 정면 슬롯
실리콘 코팅 나일론 필라멘트	심천 루이워데 리프트 기술 유한 회사	60-1250	0.35 mm OD, 30 mm 실리콘 팁, EO-멸균
소형 동물 마취 기	심천 루이워데 리프트 기술 유한 회사	R500IE	아이소플루란 증발기, 유도 챔버 & 마스크 포함
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	버전 26.0	통계 분석 소프트웨어
Vannas 마이크로 가위	상하이 진중 수술 기기 유한 회사	JD-14058	곡선 팁, 8 cm