이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

연구 논문

동충하초 다당류가 D-갈락토스에 의해 유발된 신장 노화에 미치는 영향

434 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69579

⸱

2026년 4월 3일

 ,  ,  ,  ,  , 
1First Clinic Medical School, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Renal Division, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

D-갈락토스를 이용해 쥐와 HK-2 세포에서 노화 모델이 확립되었습니다. 동충하초 다당류(CCP)가 신장 노화에 미치는 영향은 서부 블롯팅과 면역형광법을 사용하여 평가되었으며, 미토콘드리아 변화는 활성 산소 종 검출과 JC-1 염색으로 평가되었습니다.

초록

만성 신장 질환(CKD)은 전 세계적으로 중요한 보건 문제를 제기합니다. 신장 세뇨관 상피 세포(RTEC)의 노화는 신장 재생과 수리를 저해하고, 노화 관련 분비 표현형(SASP)의 방출을 통해 CKD 진행을 촉진합니다. 동 충하초 다당류(CCP)를 주요 생리활성 성분으로 포함한 동충하초는 CKD 임상 제제에 여러 차례 포함되며 치료적 이점을 입증했습니다. 신장 노화에서 CCP의 역할을 조사하기 위해, D-갈락토스 유도 신장 노화 모델을 마우스에서 확립하고 CCP를 중재로 투여하였다. 노화 관련 염색과 신장 기능 평가를 통해 치료 결과를 평가하였다. HK-2 세포에서 D-갈락토스 유도 노화 모델이 추가로 확립되어 기저 세포 메커니즘을 조사하였습니다. JC-1 염색 및 활성 산소종(ROS) 검출을 사용하여 CCP 처리 후 노화 조건에서 미토콘드리아 변화를 평가하였다. 면역형광, 서부 블로팅, 정량적 PCR(RT-PCR)을 통해 CCP가 MAPK 인산화, NF-κB 핵전위, NLRP3 인플라마좀 활성화에 미치는 영향을 평가하였다. 결과는 CCP가 세뇨관 간질성 세포 노화, 신손상, 섬유증을 완화시키면서도 D-갈락토스 유발 노화의 세포 및 동물 모델에서 미토콘드리아 기능을 개선함을 보여줍니다. 이러한 효과는 ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3 신호 전달 경로의 조절과 관련이 있습니다.

서론

만성 신장 질환(CKD)은 가장 흔한 신장 질환 중 하나이며 전 세계적으로 많은 사람들에게 영향을 미칩니다. 이 질환의 발생은 노화와 밀접한 관련이 있습니다. 신세뇨관은 신장의 주요 기능 단위이며, 신관 상피세포(RTEC) 내 세포 노화가 신장 기능 저하에 주요 기여를 합니다. 약물 노출과 기타 스트레스 요인은 기관 스트레스 관련 노화를 유발하여 신장 기능 점진적 상실과 결국 말기 신장 질환(ESKD)으로 진행할 수 있습니다. 따라서 RTECs에서 노화를 표적으로 삼는 것은 신장 노화를 지연시키고 CKD를 예방하거나 치료하는 효과적인 전략일 수 있습니다.

만성 염증은노화의 특징이자 많은 노화 관련 질환의 중요한 원인입니다. 노화 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인은 노화 관련 분비 표현형(SASP)으로 통칭됩니다. SASP는 지속적인 염증을 촉진하고, 인접 세포의 노화를 유도하며, 점진적인 기능 저하에 기여합니다. D-갈락토스(D-gal) 유도 노화 모델은 가장 널리 사용되는 실험적 노화 모델 중 하나입니다. 이전 연구들은 D-gal 처리가 세포 내 활성 산소종(ROS) 축적, 미토콘드리아 기능 장애, 산화환원 항상성 파괴, 스트레스 관련 세포 노화 유도를 초래한다는 것을 보여주었다. 시간이 많이 걸리고 개인 간 변동성이 큰 자연 노화 모델과 비교할 때, D-갈락토스 유도 모델은 단순성, 빠른 유도, 그리고 비교적 낮은 그룹 내 변이성 등의 장점을 제공합니다. 이 모델은 생체 내 및 시험관 내 연구 모두에 적용 가능합니다. 비록 신장이 높은 대사 활동과 산화 스트레스에 취약한 신장 노화를 완전히 재현하지는 못하지만, 신장의 높은 대사 활동과 산화 스트레스에 대한 취약성을 고려할 때 신장 노화를 모델링하는 데 매우 적합합니다. 기전적 관점에서 D-갈락토스는 주로 산화 스트레스를 통해 세포 노화를 촉진하며, 이는 ROS 생성과 노화 중 미토콘드리아 기능 장애에 초점을 맞춘 연구와 일치합니다.

동충하초는 신장 관련 질환 치료에 널리 사용되는 전통 중국 약용 곰팡이입니다. 다당류, 아데노신, 아미노산, 코르디세핀, 에르고스테롤 등 다양한 생리활성 성분을 포함하고 있습니다. 코디셉스 시넨시스의 추출물과 발효 제제는 항염증, 항산화, 항노화 특성을 보입니다 8,9,10,11. 예를 들어, 동충하초 다당류는 천식 마우스 모델에서 TGF-β1/Smad 신호 전달 경로를 억제하여 염증 침투를 줄이는 것으로 나타났습니다. 또한 동충하초 다당류는 RAW264.7 세포에서 MAPK 경로 인산화를 억제하고 IL-6, IL-1β와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 감소시킬 수 있습니다13. 이전 연구들은 코르디셉스 다당류(CCP)가 코르디셉스 시넨시스의 주요 생리활성 성분으로, 자가포식을 조절하고 SASP 생성을 억제함으로써 신장 세관상 상피세포의 노화를 완화할 수 있음을 입증했습니다. 그러나 CCP가 ROS 매개 손상을 상쇄하는 분자 메커니즘은 아직 완전히 규명되지 않았습니다.

본 연구는 쥐에서 CCP가 신장 노화에 대한 보호 효과를 조사하고, D-갈락토스 유도 신장 세뇨관 상피 세포 노화 모델을 사용하여 염증, 산화 스트레스, 노화에 미치는 영향을 조사합니다. 또한 CCP가 ROS 생성, 미토콘드리아 기능 및 MAPK 인산화, NF-κB 핵전좌, NLRP3 인플라마좀 활성화 등 하위 신호 전달 경로를 조절하는지 더 탐구합니다. 이 연구는 신장 노화 및 연령 관련 신장 손상 연구에서 CCP 사용을 뒷받침하는 실험적 근거를 제공하는 것을 목표로 합니다. 전체 실험 워크플로우와 제안된 메커니즘은 그림 1에 요약되어 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 동물 시술은 기관 지침에 따라 진행되었으며, 난징 중의대학 동물윤리위원회(윤리 승인 번호 202108A006)의 승인을 받았습니다. 세포 배양 및 염색 과정에서 발생한 모든 폐기물은 밀봉된 용기와 생물학적 위험 가방에 수거되어 허가된 의료 폐기물 관리 서비스에 의해 처리되었습니다.

동물 모델 및 치료 개입

개인 간 차이를 최소화하기 위해 40마리의 쥐를 무작위로 5개 그룹(n=8개)으로 배정하고 다음 중재를 받았다: (1) 대조군: 마우스당 0.2mL의 위내 식염수 투여; (2) 모델군: 매일 D-갈락토스(250 mg/kg)를 피하 주사를 받고, 마우스당 25 mg/mL 용액 0.2 mL를 투여함; (3) 저용량 CCP 그룹: D-갈락토스 주사와 위내 CCP 50 mg/kg 투여(마우스당 5 mg/mL 용액 0.2 mL)를 투여함; (4) 고용량 CCP 그룹: D-갈락토스 주사와 위내 CCP 투여를 100 mg/kg 투여(마우스당 10 mg/mL 용액 0.2 mL); (5) 비타민 E 그룹: D-갈락토스 주사와 위내 비타민 E 투여를 100 mg/kg 용량(마우스당 10 mg/mL 용액 0.2 mL)을 병행함. 8주간의 치료 후 쥐들은 안락사되었고, 혈청, 소변, 신장 조직 샘플을 채취하여 후속 분석을 수행하였습니다.

신장 기능 분석

신장 기능은 제조사의 지침에 따라 크레아티닌, 요산, 요단 단백질을 측정하기 위해 상업용 검사 키트를 사용해 평가되었습니다. 다기능 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 크레아티닌은 505nm, 요산 510nm, 요로단백질은 585nm에서 흡광도값을 측정하였습니다.

조직 절편 염색

파라핀이 포함된 신장 조직은 두께 4 μm로 절단되었습니다. 절편들은 탈파라핀 처리, 헤마톡실린으로 5분간 배양, 흐르는 물로 세척, 1% 산성 알코올로 5초간 분별한 후 다시 세척했습니다. 1분간 인산염 완충 식염수(PBS) 세척 후, 절편을 에오신으로 3분간 대염색한 후 탈수한 후 장착했습니다. Masson의 트리크롬 염색에서는 위에서 설명한 대로 절단을 탈파라핀 후 헤마톡실린으로 염색한 후, Ponceau S를 5분, 아닐린 블루를 5분간 염색했습니다. 그 후 단편을 탈수하여 장착했습니다.

세포 생존성 검사

HK-2 셀은 웰당 1× 10⁵ 셀로 12웰 플레이트에 시딩되었습니다. D-갈락토스와 동충하초 다당류에 24시간 노출된 후, 각웰 14에 10% CCK-8 용액을 첨가하였습니다. 37°C에서 30분간 배양한 후, 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450nm에서 흡수도를 기록했습니다. 동충하초 다당류에 대한 품질 관리 문서와 HK-2 세포의 STR 인증은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.

역전사 정량 중합효소 연쇄반응

세포 배양 24시간 후 배양지를 제거하고 추출 시약을 사용해 총 RNA를 추출했습니다. RNA 농도는 마이크로플레이트 분광광도계를 사용해 측정하였고, RNA 무결성은 2% 아가로스 겔 전기영동으로 검증되었습니다. 유전체 DNA는 제거되었고, cDNA는 역전사로 합성되었습니다. 프라이머 서열은 재료표에 나열되어 있습니다.

세포 내 ROS 측정

HK-2 셀은 웰당 1× 10⁵ 셀로 12웰 플레이트에 시딩되었습니다. 60-70% 합류율에 도달하면 세포는 12시간 동안 D-갈락토스로 전처리를 받았다. 약물 노출 24시간 후, 배지를 폐기하고 세포를 PBS로 한 번 세척했습니다. 세포 내 ROS는 37°C에서 ROS 민감 형광 프로브로 20분간 인큐베이션하여 검출되었고, 488/525 nm15 여기/방출 파장에서 형광 이미지를 촬영했습니다.

서부 블롯

세포 단백질은 RIPA 버퍼를 사용해 용해한 후, 13,000 × g에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 정제하였습니다. 단백질은 10분간 끓여 변성시켰고, 동일한 양(샘플당 20 μg)의 단백질을 전기영동 분리에 거쳐 PVDF 막으로 전달했습니다. 1시간 동안 차단한 후, 막을 1차 항체와 함께 하룻밤 배큐했습니다. 이후 PBST 세척 후 HRP 결합 2차 항체로 인큐베이션되었고, 증강 화학발광(ECL) 기질16을 사용하여 검출되었습니다. 항체 세부 정보와 시약 식별자는 재료표에 나열되어 있습니다.

SA-β갤 노화 염색

HK-2 셀은 12웰 플레이트에 도금되었으며, 웰당 1× 10⁵ 셀의 밀도로 도금되었습니다. 세포가 60-70% 합류에 도달하면 D-갈락토스로 12시간 전처리되었습니다. 제조업체 프로토콜에 따라 SA-β-갤런 염색이 이루어졌고, 착색된 세포는 광학 현미경으로 관찰되었습니다17.

미토콘드리아 막 전위 측정

미토콘드리아 막 전위는 공급업체의 지침에 따라 JC-1 형광 탐침을 사용하여 평가되었습니다. JC-1 단량체는 여기/방출 파장 490/530 nm에서 검출된 반면, JC-1 집합체는 525/590 nm에서 검출되었습니다. 명확한 빨간색 또는 녹색 형광 신호가 관찰되었을 때 이미지를 획득했습니다.

통계 분석

데이터는 막대 또는 점선 플롯으로 제시되었고, 참조된 소프트웨어를 사용해 분석되었습니다. 서부 블롯 밴드 강도는 ImageJ를 사용하여 정량화되었습니다. 데이터는 분산분석(ANOVA)과 후속 t-검정을 통해 그룹 간 비교를 통해 분석하였다. 통계적 유의성은 P 값 0.05<로 정의되었습니다. 기호는 대조군(*) 또는 D-gal 그룹(#)과의 비교를 나타냅니다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

D-갈락토스는 마우스 노화 모델을 구축하는 데 사용되었으며, 비타민 E는 일반적으로 사용되는 항노화 양성 대조군으로 사용되었습니다. 노화 생쥐에게는 다양한 용량의 동충하초 다당류(CCP)가 투여되었습니다. 노령 쥐는 요로 단백질, 혈청 요산, 크레아티닌 수치 증가로 입증된 심각한 신장 기능 장애를 보였습니다(그림 2B-D). 비타민 E와 CCP 보충제 모두 이러한 이상을 완화시켰습니다. SA-β-갤 염색은 CCP 처리 마우스에서 신장 세포 노화 감소를 보였으며, 비타민 E 그룹에서 관찰된 효과와 유사한 효과를 보였습니다(그림 2E).

신장 조직의 H&E 염색 결과, 대조군 쥐에서 관 구조와 정상적인 세포 형태가 보존되어 있음을 확인하였습니다(그림 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

본 연구는 동충하초 다당류가 신장 세뇨관 상피 세포에 미치는 보호 효과를 입증하며, ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3 신호 전달 경로를 조절하여 HK-2 세포의 염증성 노화를 완화한다는 증거를 제공합니다. 이 발견들은 급성 및 만성 신장 질환 치료에서 코디셉스 시넨시스 유래 화합물의 효과 기전을 더욱 명확히 하며, 향후 노화 방지 치료 전략 연구에 참고 자료를 제공합니다.

세포 노화는 복잡한 생물학적 과정이며 여러 장기에 영향을 미치는 퇴행성 질환의 주요 원인입니다. 신장은 노화 관련 손상에 특히 취약하며, 이는 점진적인 기능 저하와 특징적인 조직학적 변화를 동반합니다. 신장 노화(RS)는 만성 신장 질환(CKD)과 밀접하게 연관되어 있으며,...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학기금(번호 8217150545, 82575032)의 지원을 받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Casepase1/절단된 토끼 pAbWL03450중국 셩양, 완레이
CCK-8 키트C0037바이요타임, 상하이, 중국
CCPB21296위안예 바이오, 셩양, 중국
크레아티닌 검사 키트C011-2-1중국 난징 건청
D-걸  HY-N0210MCE, 미국
ERK 래빗 pAb4695CST, 미국AB_390779
가프드 토끼 pAbAC033아클론, 우한, 중국
H & E 염색 키트G1120솔라비오, 베이징, 중국
JC-1 키트  C2003S바이요타임, 상하이, 중국
매송의 스테인 키트G1340솔라비오, 베이징, 중국
NLRP3 토끼 pAbWLH3383중국 셩양, 완레이
P21 래빗 pAb64016CST, 미국AB_2892063
p38 토끼 pAb9212CST, 미국AB_330713
50쪽 토끼 pAb3035CST, 미국AB_330564
p65 토끼 pAb8242CST, 미국AB_10859369
p-ERK 토끼 pAb4370CST, 미국AB_2315112
인산-SAPK/JNK m항체4668CST, 미국AB_823588
p-p38 토끼 pAb4511CST, 미국AB_2139682
ROS 염색 키트S0033S바이요타임, 상하이, 중국
SAPK/JNK 항체9256CST, 미국AB_2250373
SA-&베타-걸 킷C0602바이요타임, 상하이, 중국
요산 검사 키트C012-2-1중국 난징 건청
요로 단백질 검출 키트C035-2-1중국 난징 건청
비타민 ES27812위안예 바이오, 셩양, 중국
프라이머>
유전자명포워드 프라이머리버스 프라이머
카스파제-15'-TACAGACAAGGGTGTGTGAACAA-3'5'-CGGAATAACGGAGTCAATCAA-3'
가프드5'-AGAAGGTGTGAAGCAGGCGTC-3'5'-AAAGGTGGAGGAGTGTGTGTCG-3'
NLRP35'-GATCTTCGCTGCGATCACAAG-3'5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'

참고문헌

  1. Rex, N., et al. Cellular senescence and kidney aging. Clin Sci (Lond). 137, 1805-1821 (2023).
  2. Huang, W., et al. Cellular senescence: the good, the bad and the unknown. Nat Rev Nephrol. 18, 611-627 (2022).
  3. Pawelec, G. Aging as an inflammatory disease and possible reversal strategies. J Allergy Clin Immunol. 145, 1355-1356 (2020).
  4. Zhang, J., et al. Aging in the dermis: fibroblast senescence and its significance. Aging Cell. 23, e14054(2024).
  5. Li, X., et al. Inflammation and aging: signaling pathways and intervention therapies. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 239(2023).
  6. Azman, K. F., Zakaria, R. D-galactose-induced accelerated aging model: an overview. Biogerontology. 20, 763-782 (2019).
  7. Zhang, H. W., et al. Cordyceps sinensis for treating chronic kidney disease. Cochrane Database Syst Rev. 2014, CD008353(2014).
  8. Krishna, K. V., Ulhas, R. S., Malaviya, A. Bioactive compounds from Cordyceps and their therapeutic potential. Crit Rev Biotechnol. 44, 753-773 (2024).
  9. Das, G., et al. Cordyceps spp.: a review on its immune-stimulatory and other biological potentials. Front Pharmacol. 11, 602364(2020).
  10. Wu, X., et al. New insights into the biosynthesis of typical bioactive components in Cordyceps militaris. Front Bioeng Biotechnol. 9, 801721(2021).
  11. Shevchuk, Y., Kuypers, K., Janssens, G. E. Fungi as a source of bioactive molecules for longevity medicine development. Ageing Res Rev. 87, 101929(2023).
  12. Zheng, Y., Li, L., Cai, T. Cordyceps polysaccharide ameliorates airway inflammation via TGF-β1/Smad signaling. Respir Physiol Neurobiol. 276, 103412(2020).
  13. Liu, Y., Li, Q. Z., Li, L. D. J., Zhou, X. W. Immunostimulatory effects of intracellular polysaccharides from Ophiocordyceps sinensis. J Ethnopharmacol. 275, 114130(2021).
  14. Shao, N., Cai, K., Hong, Y., Wu, L., Luo, Q. USP9X suppresses ferroptosis in diabetic kidney disease by deubiquitinating Nrf2 in vitro. Ren Fail. 47 (1), 2458761(2025).
  15. Lee, S., et al. ROS-responsive graphene-hyaluronic acid nanomedicine for renal ischemia/reperfusion injury. Theranostics. 16, 618-636 (2026).
  16. Zhang, J., et al. Artesunate-nanoliposome-TPP attenuates cisplatin-induced acute kidney injury. Int J Nanomed. , 1385-1408 (2024).
  17. Rattananinsruang, P., Noonin, C., Yoodee, S., Thongboonkerd, V. Markers of H2O2-induced senescence in renal tubular cells. Environ Toxicol Pharmacol. 97, 104039(2023).
  18. Ram, C., et al. Biochanin A ameliorates diabetic nephropathy via NF-κB/NLRP3 axis. Antioxidants (Basel). 12, 1052(2023).
  19. Chen, J., et al. Cellular senescence of renal tubular epithelial cells in acute kidney injury. Cell Death Discov. 10, 62(2024).
  20. Luo, P., et al. Pentraxin 3 induces tubular cell senescence and renal fibrosis via β-catenin signaling. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869, 166807(2023).
  21. Yang, S., Yang, X., Zhang, H. Extracellular polysaccharide biosynthesis in Cordyceps. Crit Rev Microbiol. 46, 359-380 (2020).
  22. Wu, N., et al. Polysaccharide biosynthesis in Cordyceps militaris. Int J Biol Macromol. 260, 129336(2024).
  23. Qi, W., et al. Cordyceps sinensis polysaccharide inhibits colon cancer via mTOR signaling. Carbohydr Polym. 237, 116113(2020).
  24. Ahmad, S., et al. Fisetin rescues mice brains against D-galactose-induced oxidative stress. Front Pharmacol. 12, 612078(2021).
  25. Hajam, Y. A., et al. Oxidative stress in human pathology and aging. Cells. 11, 552(2022).
  26. Papaconstantinou, J. Inflammation and oxidative stress signaling in senescence and aging phenotypes. Cells. 8, 1383(2019).
  27. Afonina, I. S., Zhong, Z., Karin, M., Beyaert, R. Limiting inflammation: negative regulation of NF-κB and NLRP3 inflammasome. Nat Immunol. 18, 861-869 (2017).
  28. Zhang, M., Wei, W., Zu, H. DHCR24 knockdown-induced cholesterol deficiency triggers tau hyperphosphorylation. Cell Signal. 138, 112254(2026).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

DMAPKNLRP3
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.