치쿤구니야, 뎅기열, 지카 바이러스 감염의 동시 삼중 PCR 검출을 위한 현장 관리 플랫폼

Summary

이 글은 단일 샘플로 치쿤구니야, 뎅기열, 지카 바이러스의 공동 감염을 동시에 진단하는 완전 자동화 통합 시스템을 권장하며, 이를 통해 임상 및 1차 진료 실험실에서 검사 효율성을 최적화합니다.

Abstract

치쿤구니야열(CHIKF)은 모기를 통해 전파되는 급성 바이러스 질환으로, 1952년 탄자니아에서 처음 발견되었으며, 중국에서도 간헐적으로 확산되고 있으며, 지역적인 발병이 증가하고 있습니다. 2025년 7월까지 현재 발병 중심지인 광둥성은 4,824건의 지역 확진자를 보고했으며, 이 중 약 3,000건이 일주일 만에 신규 감염되었다. 이러한 급증은 첨단 진단 기술에 대한 긴급한 필요성을 불러일으킵니다. 이러한 도구들은 최전선에서의 봉쇄 노력을 지원하는 데 매우 중요합니다. 뎅기열(DENV), 치쿤구니야(CHIKV), 지카 바이러스(ZIKV) 감염을 신속히 동시에 감지하여 조기 유행병 예방 및 통제 역량을 강화하는 해결책을 제안합니다. 이 접근법은 국경 검문소와 1차 의료 시설을 위한 맞춤형 검사 프로토콜 개발을 포함합니다.

CHIKV와 DENV에 대한 전통적인 진단 방법은 공동감염 사례에서 민감성이나 특이성이 부족한 경우가 많습니다. CHIKV, DENV, ZIKV는 유사한 전파 패턴과 증상을 공유하기 때문에 동시 모니터링이 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 TaqMan 프로브를 이용한 삼중성 qPCR 방식을 제시하여 단일 튜브 내에서 90분 이내에 이 아르보바이러스를 검출합니다. 바이러스 배양 및 혈청학적 검사와 비교할 때, 이 방법은 활성 감염과 공생감염을 높은 특이도로 식별하면서 워크플로우를 단순화하고 특수 장비 요구를 없애어 효율성을 향상시킵니다.

임상 및 외부 품질 평가(EQA) 샘플과의 검증 결과, 골드 스탠다드 싱글플렉스 검사와 100% 일치함이 확인되었습니다. 이 방법은 특히 자원이 제한된 환경에서 신속한 발병 억제가 중요한 지역에서 열병을 모니터링하는 효과적인 도구로 작용합니다.

Introduction

치쿤구니야열(CHIKF)은 주로 모기 매개체인 이집트(Aedes aegypti)와 알보픽투스(Aedes albopictus)에 의해 전파되는 점점 더 확산되는 아르보바이러스 질병입니다. 열대 지역에서 반복적으로 발생하는 것이 특징이며, 임상적으로는 급성 열성 질환으로 나타나며, 종종 심한 관절통과 지속적인 관절염을 동반합니다^. 7월 26일 기준, 포산시에서 실험실에서 확진된 치쿤구니야 누적 확진자는 4,824명에 달했으며, 이 중 무려 87.2%가 순덕구에서 발생했다. 이러한 뚜렷한 지리적 집중은 지역 공중보건 인프라에 상당한 부담을 주며, 상당한 의료비와 더 넓은 거시경제^{적 도전을} 초래합니다.

CHIKV, DENV, ZIKV 바이러스의 점점 더 겹치는 유행 상황에서, 현재의 진단 방법론은 세 가지 주요 한계에 직면해 있습니다. 첫째, 혈청학적 검사는 바이러스 제거 후 항체가 장기간 지속되어 급성 감염을 구별하지 못합니다¹. 둘째, 바이러스 배양 기술은 민감도가 낮아 며칠이 걸려 적시에 임상 의사결정을 방해합니다. 셋째, 정량적 PCR 분석법은 높은 특이성(95% 이상)을 보이지만, 단일 반응 내에서 동시 감염을 검출할 수 없으며, 이는 인도에서 보고된 CHIKV-DENV 공동 감염률 12.8%를 고려할 때 큰 단점입니다^. 계통 모니터링은 패러다임 전환을 나타냅니다. 2019년부터 2022년까지 인도 유행 기간 동안 우세했던 ECSA 계통은 외피 단백질인 E1-A226V(모기 감염성 증진)와 E2-K252Q(면역 회피 관련 포함)에서 수렴 돌연변이를 획득했습니다. 이러한 돌연변이는 케랄라와 마하라슈트라³에서 최근 감시 연구에서 보고된 바와 같이 더 높은 병원성의 유전자형을 만들어냈습니다. 동시에 중국은 윈난 발병에서 확인된 ECSA 유전자형 수입과 여러 성에서 토착 전파가 보고된 다른 유전자형 문제로 어려움을 겪고^{있습니다.}

이러한 현실은 (i) 임상 증상이 겹치더라도 감별 진단을 위한 긴급하고 자원 제한적인 필요성을 만들어냅니다.⁵, (ii) 기존 실시간 정량 PCR(^qPCR)에서 일반적으로 요구되는 복잡한 기기를 제거하는 진단 검사법6, (iii) RT-LAMP와 CRISPR 기반 방법을 포함한 새로운 현장 진료 기술의 포괄적 검증⁵. 이러한 진단 과제를 해결하기 위해, 우리는 완전 자동화된 통합 시스템을 사용하는 신속 삼중 PCR 분석법을 제안하여 CHIKV, DENV, ZIKV를 단일 반응으로 동시에 검출할 수 있게 합니다. 우리는 3중성 qPCR 분석법의 성능을 기존 단일 분석법⁵와 직접 비교하여 검증했으며, 이 분석법은 기준 표준으로 사용되었습니다. 다음 절에서는 삼중성 분석법과 참조 단일 분석법 모두에 대한 절차를 자세히 설명합니다. 두 방법의 비교 분석은 대표성 결과 섹션에 제시되어 있습니다.

Protocol

본 연구는 중국 광저우 남방의과대학 광둥성 인민병원 윤리위원회(승인 번호: KY2025-510-01)가 정한 윤리 지침을 준수합니다. 이 연구에 사용된 재료(시약, 화학물질, 장비 및 소프트웨어)에 대한 자세한 정보는 재료표에서 확인할 수 있습니다.

1. 참가자 선발

1. 참가자 연령대는 18세에서 60세 사이입니다.
2. 증상 발현 12일 이내에 급성 열성 질환(겨드랑이 T ≥ 38 °C)으로 나타나고, 발진, 관절통 또는 경부 림프절병증이 있으며, 최근 치쿤구니야풍토병 지역을 방문한 참가자를 선정합니다; 또는 동일한 여행 이력을 가진 무증상 환자들.
3. 제외: 7일 이내에 항생제/항바이러스제 복용 또는 확진된 HIV 또는 악성 종양에 기인한 열성 질환.

2. 샘플 채취 및 처리

1. 샘플링 박스의 외부 포장이 손상되지 않았고 유통기한이 지나지 않았는지 확인한 후 내부 재료를 제거하세요.
2. 팔을 뻗은 채 피사체를 위치시키세요. 정중정맥을 확인하고, 지혈대를 감은 뒤, 70% 알코올 면봉으로 정맥 천자 부위를 소독합니다.
3. 항응고제가 없는 혈액 채취관을 사용해 피험자의 주관절 전정맥에서 1~3mL의 혈액을 채취합니다.
4. 튜브를 5-8번 부드럽게 뒤집고 실온에서 30분간 응고시키세요.
5. 혈액 샘플을 4°C, 1000 x g 에서 원심분리기로 10분간 원심분리합니다. 원심분리 후 얻은 혈청 샘플은 즉시 검사할 수 있습니다.
6. 상청액 혈청을 조심스럽게 멸균 마이크로 원심분리관에 분리해 넣으세요. 혈청을 즉시 검사용으로 사용하거나, qPCR을 통한 병원체 핵산 추가 분석까지 -80 °C에서 보관하십시오.

3. CHIKV, DENV, ZIKV의 자동 삼중성 qPCR 검출

1. 시약 및 튜브 준비
   1. 필요한 모든 시약을 저장 공간에서 꺼내 실온에서 해동하세요.
   2. 각 밀봉된 TD 감지관을 육안으로 점검하여 손상이나 밀봉 결함이 있는지 확인하세요. 손상된 튜브는 모두 버리세요.
   3. TD 핵산 추출 버퍼를 5초간 잠시 소용돌이로 하여 균일성을 확인합니다.
   4. 균질화된 버퍼 500 μL을 TD 추출 시약관(보라색 동결 건조 자기 구슬 포함)에 무균 방식으로 분사합니다.
   5. 혼합물을 30초 동안 격렬하게 소용돌이로 돌려 모든 성분이 완전히 용해되고 구슬이 완전히 다시 떠오를 때까지 반복합니다.
   6. 재구성된 전체 용액을 미리 라벨링된 TD 검출관으로 옮깁니다.
2. 샘플 로딩
   1. 준비된 TD 검출관에 투명하고 용혈되지 않으며 지혈증이 없는 혈청 200 μL 피펫을 투여합니다.
   2. 튜브를 단단히 밀봉하고 10번 뒤집어 균질하게 섞으세요.
      참고: 반전 시에는 파라핀층이 튜브 내에서 잠시 떠 있도록 하세요. 이것은 과정의 정상적인 부분입니다.
3. 기기 작동 및 데이터 수집
   1. 밀폐된 검출관을 분석기의 지정된 슬롯에 삽입하세요.
   2. 터치스크린 인터페이스에서 샘플 식별 정보를 입력하세요.
   3. Start Detection 을 누르면 완전 자동화된 폐쇄관 워크플로우가 시작됩니다.
      참고: 시스템은 바코드 스캔, 자기 구슬 캡처 를 통한 핵산 추출, 형광 PCR 증폭을 사용자 추가 개입 없이 자동으로 수행합니다. 표준 프로그램은 95°C에서 3분간 변성, 이어서 40회 증폭 과정을 포함합니다.
4. 결과 해석
   1. 실행 완료 후에는 세 표적(CHIKV, DENV, ZIKV)과 내부 제어의 증폭 결과를 동일한 화면에서 관찰하세요.
   2. 각 표적 병원체별로 자동으로 생성된 "양성", "음성", "무효"를 해당 형광 채널에 기록하세요.
      참고: 시스템 내부 소프트웨어는 자동 해석을 위해 사이클 임계값(Ct)인 37.0을 사용합니다. 수동 데이터 분석은 필요하지 않습니다.

4. 방법 비교를 위한 단일 플렉스 qPCR 분석법 참조

1. 핵산 추출 시약의 제제
   1. 키트에서 미리 포장된 96웰 플레이트를 꺼내세요. 96웰 플레이트를 부드럽게 두드려 시약과 자기 구슬이 모두 96웰 플레이트 하단에 농축되도록 합니다. 알루미늄 호일 밀봉 막을 조심스럽게 떼어내어 96웰 플레이트의 진동을 피하여 액체가 튀어나오는 것을 막으세요.
   2. 96웰 플레이트의 1과 7번 열에는 먼저 20 μL 단백질효소 K를 추가하고, 그 다음 추출할 샘플 200~300 μL을 추가합니다.
   3. 자동 핵산 추출 (자기 구슬 기반 방법)
      1. 샘플 포함 사전 포장된 96웰 플레이트가 자동 핵산 추출기 시스템의 해당 슬롯에 배치됩니다.
      2. 핵산 추출 과정은 다음과 같습니다: 실험실 챔버 내부의 자기봉을 이용해 핵산에 결합된 자기 구슬을 흡착합니다. 비드 복합물을 다음 지정된 시약 구멍으로 옮기세요. 저어 장치를 작동시켜 빠르고 반복적으로 저어 액체와 자기 구슬을 완전히 섞으세요. 자동 핵산 추출기가 다음 단계를 자동으로 수행하도록 허용합니다: i) 세포 용해: 25 °C에서 10분. ii) 핵산 흡착: 70 °C에서 15분, 자기 흡착 3회 수행. iii) 세척: 2분간 혼합(3회 반복), 이어서 자기 흡착을 두 번(각각 15초) 합니다. iv) 용출: 두 번(각 5분) 수행하며, 자기 흡착은 3회 수행됩니다. 결국 고순도 핵산을 얻게 됩니다.
   4. 즉각적인 검출을 위해 6번과 12번 열에서 핵산 함유 용액을 직접 흡입하세요. 장기 보관을 위해서는 남은 핵산 샘플을 -20°C로 옮기세요.
2. 증폭 시약의 준비
   참고: 싱글플렉스 PCR 반응의 경우, 세 가지 서로 다른 효소와 세 가지 대응 반응 혼합물을 사용하여 세 개의 별도 PCR 튜브를 준비합니다. 시약 준비는 세 단계로 나누어 완료됩니다. 준비 단계가 유사하므로, 아래에서는 CHIKV 검출 시약의 준비 단계만 시연하겠습니다.
   1. 키트에서 핵산 증폭 반응액과 CHIKV 반응액(CHIKV 특이적 프라이머/프로브)을 제거하세요. 해동 후에는 22~25 °C 환경에 두고, 격렬하게 흔들어 완전히 혼합한 후 짧은 원심분리(1000 x g, 15초, 22~25 °C)를 수행합니다.
   2. 총 반응 수를 N + 2로 계산하세요(여기서 N = 테스트 샘플 수, +2 = 음성 1회, 양성 품질 관리 1회). 각 반응마다 다음 재료를 조합하여 적절한 크기의 마이크로 원심분리관에서 마스터 믹스를 준비합니다: 17 μL 핵산 증폭 반응 용액(버퍼, dNTPs, DNA 중합효소, UDG 효소 포함), 3 μL CHIKV 반응 용액(프라이머, CHIKV 표적 유전자 탐침, IC 포함). 완전한 믹싱을 위해 마스터 믹스를 꼼꼼히 보텍스하세요. 튜브를 10,000 x g 에서 실온(22~25 °C)에서 15초간 원심분리하여 바닥에 용액을 수집합니다. 각 PCR 반응관에 마스터 믹스 20 μL을 분배합니다.
   3. 핵산 및 품질 관리 샘플 추가: 위에서 준비한 PCR 반응관(20 μL)에 각각 검사된 샘플(양성 대조군)과 음성군에서 5 μL의 핵산을 추가하여 최종 튜브당 25 μL 부피를 달성합니다; 튜브를 단단히 막고 순간적인 원심분리(1000 x g, 15초, 22~25 °C)를 수행한 후 튜브를 PCR 기기에 삽입합니다.
3. PCR 증폭
   1. 사이클링 프로그램을 다음과 같이 설정하세요: 프리 변성: 50 °C에서 15분, 그 후 95 °C에서 15분(두 단계가 합쳐져 1사이클을 구성함); 다음 2단계로 40사이클 동안 진행합니다: 94 °C 변성 15초, 55 °C 어닐링 45초.
   2. 형광 신호 검출 매개변수는 다음과 같이 설정합니다: CHIKV 유전자의 FAM 형광 표지; 키트 내부 대조군으로 사용된 IC 유전자의 VIC 형광 표지. 55°C에서 데이터를 수집하세요. 반응이 완료되면 데이터를 미래 분석을 위해 저장하세요.
   3. qPCR 전용 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다
      1. 샘플 정보: 소프트웨어의 웰 플레이트 레이아웃 다이어그램에는 샘플 적재 위치에 대응하는 샘플 유형(예: 양성 대조, 부정 대조, 미확인 샘플, 내부 참조 유전자 등)을 표시하세요.
      2. 반응관 배치: 기기 가열 모듈 뚜껑을 열고 밀봉된 PCR 플레이트/튜브를 내부에 고정시키고, 가열 모듈과 밀착되도록 확인한 후 온도 불균형을 방지하기 위해 모듈 뚜껑을 단단히 닫습니다
      3. 반응 시작: 소프트웨어의 프로그램 설정이 올바른지 확인한 후 실행 시작 을 클릭하고 실험 ID를 기록해 나중에 참고하세요.
      4. 작동 중지 및 튜브 제거: 프로그램이 완료되면 가열 모듈 온도가 50 °C 이하로 떨어질 때까지 기다립니다. 그 후 뚜껑을 열고 조심스럽게 PCR 플레이트나 튜브를 제거하세요. 필요에 따라 후속 분석이나 샘플 저장을 진행하세요.
      5. 데이터 분석 분석을 진행하기 전에 다음을 확인하십시오: i) 모든 샘플과 내부 통제군의 증폭 곡선이 특징적으로 S자형임; ii) 형광 임계값은 지수 상 내에 설정되어 38사이클≤ Ct 값을 얻습니다(CV < 5%); iii) 대조 결과가 유효하여 오염이 없음을 나타냅니다. 어떤 조건이 충족되지 않거나 샘플에 비정상적인 증폭(예: 비정형 곡선이나 임계 범위 Ct)이 나타나면, 전체 배치나 특정 시료를 재검사해야 합니다.
      6. 자동 선택 임계값을 사용하여 소프트웨어로 원시 데이터를 처리하여 Ct 값을 결정합니다; 샘플은 Ct < 38이고 증폭 곡선이 시그모이드 형태를 보일 때 양성으로 간주됩니다.

5. 생물안전 및 폐기물 처리

1. 모든 물질을 지정된 천공 방지 생물학적 위험 용기로 옮기고, 기관 의료 폐기물 시스템을 통해 최종 폐기물 처리하기 전에 오토클레이빙으로 오염을 제거하세요. 즉시 이 물질들을 누출 방지, 구멍 방지 생물학적 위험 용기로 옮기세요. 고위험 폐기물로 표시되어 있습니다. 기관 지침에 따라, 증폭된 제품을 포함한 모든 폐기물을 오토클레이빙(예: 121°C에서 30분간 가열)하여 병원체를 비활성화하고 핵산을 분해합니다. 마지막으로, 지정된 의료 폐기물 관리 시스템을 통해 멸균된 폐기물을 처리하세요.
   참고: 모든 절차를 생물안전 레벨 2(BSL-2) 관행에 따라 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 노출 위험을 최소화하십시오.

Results

삼중 PCR 검출 시스템의 안정성과 정확성을 검증하기 위해, 내부 실험실에서 임상적으로 대표성 있는 샘플 5개와 외부 EQA 블라인드 샘플 10개를 선정하여 검증을 진행했습니다. 이 다섯 가지 대표 임상 샘플은 음성 및 양성 사례(S1-S5)를 포함하며, CHIKV와 DENV 양성 샘플도 포함되어 있으며, 검사의 임상적 적용 가능성을 입증하고 검사 성능 내부 검증을 지원하기 위해 선정되었습니다(표 1). 2025년 EQA의 신생 모기 매개 병원체에 대한 눈가시 샘플 패널은 10개의 불활성화 혈장 샘플(DZC2511-2520)으로 구성되었습니다. 이 제품들은 CHIKV, DENV, ZIKV의 다양한 농도와 조합을 포함하고 있었습니다. 이러한 농도와 조합은 NCCL에 의해 사전에 정해졌습니다. 이 패널의 삼중 qPCR 플랫폼을 이용한 분석은 참조 결과(표 2)와 완전히 일치하여 검사의 견고성과 임상적 적용성을 확인하였습니다.

Discussion

CHIKV는 토가비리다과(Togaviridae) 7과에 속하는 알파바이러스 속에 분류되는 양성 단가닥 RNA 바이러스입니다. 가속화된 지구 온난화, 강화된 국제 상업, 확장되는 관광망은 종목 바이러스 위협에 대한 인간 노출 위험을 함께 높였습니다⁸. 지난 10년간 분자 진단의 급속한 발전은 감염병 관리의 지형을 근본적으로 변화시켰습니다. 이들 기술 중에서 qPCR은 빠른 처리 속도, 뛰어난 분석 민감도, 높은 정량적 정확성, 그리고 일상 작업 중 교차 오염 위험이 크게 줄어든 덕분에 중국 전역의 임상 실험실에서 특히 주목받고 있습니다^. 단일 혈액 채취와 CHIKV, DENV, ZIKV를 동시에 검출하는 삼중성 qPCR 플랫폼을 통합함으로써, 단일 분석 창 내에서 단일감염과 공동 감염을 모두 스크리닝할 수 있습니다. 이러한 간소화된 워크플로우는...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
자동 핵산 추출기	다안	스마트 32	DNA 추출을 위해
벡만 X-12	벡맨	ALA04H01	포  혈청 원심분리
BSC-1500IIA2-X	바이오베이스	세다 20143222263	생물안전 캐비닛
전자-원심분리기	웰텍		튜브 벽에 남아 있는 액체를 원심분리해 제거하세요
완전 자동 의료용 PCR 분석기	비우스타르&즈윈 그리고 nbsp;	UP0102	형광 정량 PCR 증폭
치쿤구니야 바이러스 핵산 검출 키트 (PCR-형광 탐침법)	DAAN	20250804	탐지  치쿤구니야 바이러스 유전자
뎅기열 바이러스 핵산 검출 키트 (PCR-형광 탐침 방법)	DAAN	202504003	탐지  뎅기열 바이러스 유전자
뎅기열바이러스, 지카바이러스, 치쿤구니야바이러스 핵산 검출 키트 (PCR-형광 탐침법)	비우스타르&즈윈 그리고 nbsp;	20250724	탐지  뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 유전자
지카 바이러스 핵산 검출 키트 (PCR-형광 탐침법)	DAAN	202508041	지카 바이러스 검출   유전자
핵산 추출 키트	다안		핵산 추출
SLAN 완전 자동 의료 PCR 분석 시스템	홍시		데이터 분석
SLAN-96S 실시간 PCR 기계	홍시	SLAN-96S	형광 정량 PCR 증폭
초저온 냉동고 (DW-YL450)	멜링	세다 20172220091	-20 & 도; C: 시약 저장
소용돌이-5	카일린 벨		혼합 시약을 위해