방법 논문

감염성 실험 환경에 적응하는 신생아, 유아, 성체 쥐 폐에서 폐포 유형 II 상피세포 분리

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DOI:

10.3791/69581

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2025년 12월 19일

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1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 신생아, 유아, 성인 쥐 폐(감염 여부 모두)에서 생존 가능한 폐포 유형 II 상피세포(AECII)를 분리하는 유동 세포분석 기반 방법을 제시합니다. 이 접근법은 AECII의 분자 및/또는 기능 연구를 통해 폐 염증 및 감염 시 AECII의 역할을 규명할 수 있게 합니다.

초록

폐포 II형 상피세포(AECII)는 폐의 면역 조절에 결정적으로 기여하며, 따라서 폐 항상성을 조율하는 핵심 요소입니다. 이러한 기능들은 AECII가 하기도 상피를 표적으로 삼아 폐포 완전성을 파괴하는 호흡기 바이러스 감염 맥락에서 특히 중요하게 만듭니다. 전임상 마우스 모델은 폐 염증 및/또는 감염 맥락에서 AECII의 역할을 밝히는 데 중요한 도구입니다. 이 프로토콜은 신생아, 유아, 성체 단계에서 쥐 폐에서 생존 가능하고 고도로 정제된 AECII를 분리하기 위한 상세하고 재현 가능한 파이프라인을 제시합니다. 이 방법론은 기계적 해리, 효소 소화, 그리고 이후 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 결합하여, 분자 및 기능 분석에 적합한 고농축 AECII 집단을 산출합니다. 병원성 바이러스가 관련된 응용의 경우, 프로토콜에는 선택적으로 파라포름알데히드(PFA) 고정 단계가 포함되어 있어, RNA 무결성을 해치지 않으면서 낮은 생물안전 조건에서 안전하게 취급할 수 있습니다. 발달 단계별 최적화된 세포 회복을 통해 성인 폐당 최대 1.0 ×10개의 6 AECII 세포를 생성할 수 있어, 이 프로토콜은 바이러스 발병기전, 상피 기능, 재생 능력 등의 전임상 연구를 지원합니다.

서론

폐 발달, 생리, 면역, 수리 과정에서 다면적인 역할을 하기 때문에, 폐포 II 상피세포(AECII)는 폐 손상 후 항상성 유지와 재확립에 중요한 역할을 합니다. AECII는 인플루엔자 A 바이러스(IAV)나 SARS-CoV-2와 같은 팬데믹 바이러스의 주요 세포 표적이기 때문에, 이들의 운명과 기능은 감염 생물학 연구의 주목을 받고 있습니다. 이러한 맥락에서 이전 연구들은 내재적(예: 유전 상태 1,연령 2,3) 및 외재적 단서(예: 미생물 자극4) 모두 AECII 표현형과 공기 중 병원체와 같은 환경 유발에 대한 반응성에 큰 영향을 미친다고 보고했습니다. 특히 폐 염증은 AECII 5,6의 전사체, 단백질체, 후생유전학적 상태에 지속적인 변화를 남기는 것으로 나타났습니다. 폐 내 AECII의 복잡한 세포 상호작용과 다양한 생체 및 비생물적 요인이 AECII 생물학에 기여하는 점은 이러한 세포를 더 자세히 관찰할 수 있는 적합한 생체 내 모델의 중요성을 강조합니다.

FACS는 인간과 동물 조직에서 1차 세포를 풍부하게 하고 정제하는 데 있어 현재 골드 스탠다드 기법으로, 다중 매개변수 선택(또는 배제)을 동시에 구현할 수 있고, 크기, 과립도, 자가형광과 같은 세포 내재적 특성을 선택/배제 워크플로우에 신뢰성 있게 통합할 수 있는 유일한 방법입니다. 현재까지 일부 발표된 프로토콜은 FACS를 기반으로 한 1차 쥐 AECII 분리 방법론을 제공합니다. Sinha와 Lowell은 성체 마우스에서 AECII 분리 방법을 보고했는데, 이는 유사한 조직 처리 및 유동 세포 분석 워크플로우를 특징으로 하며, FACS 이전에 비표적 세포에서 비드 기반 자기 고갈을 통한 AECII 농축을 포함했다7. 또 다른 프로토콜은 EpCAM 양성 폐세포의 자기성 구슬 기반 분리 또는 조건부 리포터 마우스모델 8을 이용해 SPC 양성(GFP+) 세포를 식별하여 AECII를 FACS 기반 분리하는 형질전환 마우스를 사용하는 방법을 설명합니다. SPC 발현은 쥐 폐에서 AECII를 신뢰성 있게 식별하지만, 이 방법은 전용 마우스 리포터 균주와 결합할 때만 적용되므로 야생형 쥐로부터의 AECII 분리는 불가능합니다. 중요하게도, AECII의 수율과 순도는 유사했으나, 이들 프로토콜 중 어느 것도 신생아, 유아, 감염된 숙주로부터 AECII를 분리하는 데 적합한 적응을 제공하지 못했다.

이를 위해 본 프로토콜에는 FACS와 결합된 효소 소화를 이용해 쥐로부터 고순도로 생존 가능한 AECII를 분리하기 위한 적응된 워크플로우 세트가 포함되어 있습니다. 이 최첨단 방법론은 이전에 개발된 FACS 기반 AECII 격리 프로토콜9 를 기반으로 하며, 추가 식별 및 배제 마커 추가를 통해 AECII의 순도를 향상시키는 중요한 개선점을 포함하고 있습니다. 중요한 점은, 이 업데이트된 프로토콜이 AECII를 "터치된" 정렬과 "터치되지 않은" 정렬 전략 모두 를 통해 검색할 수 있다는 것입니다. 더불어, 출생 후 폐 발달은 세포 구성 및 구조 재조직에 관한 주요 변화와 관련이 있기 때문에, 이 프로토콜은 신생아, 청소년, 성인 폐에서 AECII 채취를 최적화하기 위한 적응을 포함합니다. 이를 통해 폐 성숙이나 감염 생물학 연구와 같은 발생 과정에서 AECII 생물학을 검토할 수 있습니다. 이 접근법은 이후 체 외 배양 및 IAV 감염을 위한 유효한 AECII를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜에는 화학 고정제인 파라포름알데히드(PFA)를 이용한 고정 절차가 포함됩니다. 이 단계는 폐 세포 현탁액에서 다양한 호흡기 병원체(예: SARS-CoV-2, IAV)를 비활성화하는 것을 정당화하며, 이는 이후 생물 격리 조치가 낮은 시설에서 샘플 처리(FACS 기반 AECII 격리 포함)를 가능하게 합니다. PFA 기반 고정은 기능적 연구를 위한 이후의 AECII 체외 배양을 불가능하게 하지만, AECII의 전사체 프로파일링을 위해 상당량의 온전한 RNA를 회수하여 호흡기 감염 맥락에서의 생물학적 역할을 밝히는 데 도움을 줍니다.

프로토콜

모든 동물은 헬름홀츠 감염연구센터 내 동물 시설에서 특정 병원체 무첨가(SPF) 조건과 국가 및 기관 지침에 따라 사육되었습니다. 이후 AECII 분리를 위한 순생 쥐의 안락사는 실험동물과학회(GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde)의 국가 지침에 따라 수행되었습니다. C57BL/6 유전적 배경을 가진 수컷 마우스를 2일(신생아), 3주(유년기), 8-12주(성체)에서 사용하였습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 마우스 폐 준비

  1. 마우스를 희생시키기 (기관에서 승인한 프로토콜에 따라):
    1. 성체 및 어린 쥐의 경우: 복막 내 주사를 통해 마취 과다복용(예: 케타민/자일라진)을 투여하십시오.
    2. 신생아 쥐에게는 목을 베는 것.
      참고: 성체 및 어린 쥐의 경우 기관에 손상을 줄 수 있으므로 경추 탈구는 피해야 합니다.
  2. 쥐 털을 70% (v/v) 에탄올로 멸균하세요.
    주의: 인화성 액체. 눈 자극. 열은 피하세요. 용기를 단단히 닫고 복측 중앙선에 절개를 하여 내부 장기를 노출하세요.
  3. 피부와 복막을 조심스럽게 제거하세요.
  4. 양쪽 경정맥과 대정맥을 절단하여 피를 빼내는 것입니다.
  5. 심장과 폐를 노출시키기 위해 횡격막을 조심스럽게 제거하세요.
    참고: 폐를 다치지 않도록 주의하세요. 폐 조직의 천공은 이후 효소 매개 폐 조직 소화의 효율성을 크게 저해할 것입니다.
  6. 가위로 갈비뼈를 열어.
  7. 심장 우심실에 캐뉼라를 삽입하고 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)를 관류하여 폐에 남은 혈액이 배출되고 폐 조직이 창백해질 때까지 투여합니다:
    1. 성체 쥐의 경우: 26G 캐뉼라를 사용하고 폐에 10mL PBS를 관류하세요.
    2. 신생아 쥐에게는 30G 캐뉼라를 사용하고 폐에 1mL PBS를 관류하세요.
      참고: 폐혈관 내 과도한 압력으로 인해 폐포 구조가 파열되는 것을 방지하기 위해 어린 쥐의 폐에 관류를 주입하지 마십시오. 염증이 있는 폐에서는 관류가 덜 효과적일 수 있고, 폐 조직의 색 변화도 덜 뚜렷할 수 있습니다. 필요 시 성체 및 어린 쥐에서 다음 단계 전에 기관지 폐조 세척을 시행할 수 있습니다.

2. 폐 조직의 효소 소화

  1. 성체 및 어린 쥐:
    1. 침샘과 주변 근육을 제거하여 기관을 노출시킵니다.
    2. 22G 삽입 캐뉼라를 기관에 삽입하고 바늘을 제거한 후 플라스틱 카테터를 폐 쪽으로 옮깁니다.
    3. 기관과 카테터 모두에 실을 단단히 묶어 고정하세요.
    4. 폐 조직을 분산 주입하여 준비하세요.
      주의: 흡입 시 알레르기, 천식 증상, 호흡 곤란을 유발할 수 있습니다. 먼지 흡입을 피하세요. 호흡기 보호구를 착용하세요. 내용물이나 용기는 승인된 폐기물 처리 시설에 폐기하세요.) 기관에 삽입된 카테터를 통해:
      1. 성체 쥐의 경우: 2mL의 분산 주입.
      2. 어린 쥐에게는 500 μL 분산 주입.
        참고: 2.1.4와 2.1.5 단계 사이에 주사기 교환을 용이하게 하기 위해 루어 슬립 연결부가 있는 주사기를 사용하세요. 폐 조직의 효소 소화를 효율적으로 하기 위해서는 기관지폐조 공간에 효소가 완전히 채워지는 것이 필수적입니다.
    5. 주사기를 교환한 후 저융도의 아가로오스(1% (w/v), 45 °C)로 반복하여 가공 중 구조를 유지합니다.
      1. 성체 쥐의 경우: 저녹도의 아가로스 500 μL 사용.
      2. 어린 쥐에게는 저녹도의 아가로스 200 μL 사용.
        참고: 액체의 역류를 방지하려면 주사기를 그대로 두세요.
        참고: 사용 전: 저융 아가로스를 열(95 °C)으로 녹인 후 아가로스 용액을 45 °C까지 식히고, 예: 열차단 안에 넣으세요.
    6. 폐를 실험실 휴지로 덮고 얼음을 넣어 아가로스가 2분간 굳어지도록 하세요.
    7. 얼음, 휴지, 주사기, 카테터를 제거하세요.
    8. 기관을 막도록 실을 묶어 효소가 하부에 머무르도록 하세요.
    9. 심장과 흉선을 제거하세요.
    10. 실 위쪽의 기관을 잘라내고 가슴에서 온전한 폐를 제거하세요.
    11. 폐를 미리 가열한 분산제(37°C)가 담긴 15mL 튜브로 옮기고, 실온(20-25°C)에서 분산된 폐 조직을 45분간 배양합니다.
      1. 성체 쥐의 경우: 폐를 2 mL 분산 상태로 배양하세요.
      2. 어린 쥐의 경우: 폐를 1.5 mL 분산 용량에 보관하세요.
  2. 신생아 쥐
    1. 2mL 튜브 뚜껑에 가위로 단일 폐엽을 모아 다져보세요.
    2. 500 μL 분산 분량을 추가하고 뚜껑을 닫은 후 튜브를 뒤집어 전체 조직이 분산 물질로 덮이도록 합니다.
    3. 폐 조직을 실온에서 분산 상태로 45분간 배양하세요.

3. 폐 조직 준비

  1. 성체 및 어린 쥐에 대해:
    1. 폐를 분리 부위에서 분리하고 폐엽을 기관지 줄기에서 분리하세요.
    2. 폐엽을 7 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL(최종 농도) 항-CD16/32 차단 항체, 100 μL DNAse(최종 농도 ~600 Kunitz 단위)가 들어 있는 페트리 접시(직경: 8.5 cm)에 넣습니다.
      주의: 흡입 시 알레르기, 천식 증상, 호흡 곤란을 유발할 수 있습니다. 먼지 흡입을 피하세요. 호흡기 보호구를 착용하세요. 내용물이나 용기는 승인된 폐기물 처리 시설에 폐기하세요.
    3. 겸자를 이용해 폐 조직을 분해하세요.
      참고: 폐 조직의 효소 소화를 원활하게 하려면 철저한 기계적 조직 분해가 필수적입니다.
    4. 200rpm에서 부드럽게 흔들면서 상온에서 10분간 배양하세요.
      참고: 셀 현탁액은 필요 시 다음 단계까지 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
  2. 신생아 쥐를 위해:
    1. 소화 조직을 포함한 분산 세포를 3 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL(최종 농도) 항CD16/32 차단 항체, 100 μL DNAse(최종 농도 ~ 600 Kunitz 단위)가 들어 있는 페트리 접시(직경: 5.4 cm)로 옮깁니다.
    2. 200rpm에서 부드럽게 흔들면서 상온에서 10분간 배양하세요.
      참고: 셀 현탁액은 필요 시 다음 단계까지 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
  3. 모든 연령대를 위한 계속 진행:
    1. 세포 현탁액을 100 μm - 70 μm - 40 μm 크기의 나일론 셀 거품으로 필터링하여 이물질과 큰 덩어리를 제거합니다.
    2. 세포 손실을 최소화하기 위해 세포 체와 튜브를 조심스럽게 헹구세요. 샘플이 모여 있을 경우, 같은 그룹의 쥐 세포 현탁액을 동일한 세포 체를 통과시킬 수 있습니다.
      참고: 막힘이 생기면 셀 체를 교체하세요.
    3. 부피에 따라 여과된 세포 현탁액을 하나 이상의 15 mL 튜브로 옮기고, 4 °C에서 140 x g 압력에서 12분간 원심분리합니다.
    4. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 적혈구 용해 버리기(ACK 버퍼)에 재현탁합니다.
      1. 성체 및 어린 쥐의 경우: 적혈구 용해 버퍼 2mL를 사용해 2분간 배양하세요.
      2. 신생아 마우스의 경우: 적혈구 용해 완충제 3mL를 사용하고 3분간 배양하세요.
    5. 적혈구 용해를 멈추려면 15mL 튜브에 DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS를 채우고 다시 140 x g , 4 °C에서 12분간 원심분리합니다.

4. 형광 활성화 세포 분류를 위한 항체 염색

  1. DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS에서 조제한 항체-F4/80, 항-CD93, 항-CD11c, 항-CD19, 항-CD31, 항-CD11b, 항-CD16/32, 항-CD45, 항-CD24, 항-CD326 형광색소 결합 항체가 포함된 항체 염색액에 세포를 재현탁합니다.
    참고: 최적의 염색 결과를 위해서는 사전 적정된 항체만 사용하세요. AECII가 세포 분류에 영향을 받지 않아야 할 경우, 항체 염색액에 항-CD326을 포함하지 마십시오.
    1. 성체 쥐의 경우: 폐당 600 μL 항체 용액을 사용하세요.
    2. 어린 쥐의 경우: 폐당 400 μL 항체 용액을 사용하세요.
    3. 신생아 마우스의 경우: 폐당 200 μL 항체 용액을 사용하세요.
  2. 항체와 함께 세포 현탁액을 4°C에서 어두운 환경에서 10분간 배양하세요.
  3. 배양 후에는 DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS로 튜브를 채워 세포를 세척합니다.
  4. 140 x g , 4 °C에서 12분간 원심분리기.
  5. 세포를 재현탁 DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS:
    1. 성체 쥐의 경우: 폐당 300 μL에 재현탁하세요.
    2. 어린 쥐의 경우: 폐당 200 μL에 재현탁.
    3. 신생아 마우스의 경우: 폐당 100 μL에 재현탁하세요.

5. AECII 분류

참고: 기기 준비: FACS 장치를 사용하여 AECII를 분류하기 위해 100 μm 노즐을 설치하세요.

  1. 분류 직전에 셀을 50 μm 셀 체로 필터링합니다. 과도한 세포 손실을 방지하기 위해 DMEM과 HEPES 및 10% (v/v) FBS를 보충하여 세포 체를 헹구세요:
    1. 성체 쥐: 폐당 300 μL로 세포 체를 헹구세요.
    2. 어린 생쥐: 폐 양쪽에 200 μL의 세포 체를 헹구세요.
    3. 신생아 마우스: 폐 양쪽에 100 μL의 세포 체를 헹구세요.
  2. 분류하기 전에 바로 소용돌이로 세포를 다시 현지하세요.
  3. AECII의 게이트는 I) 높은 측면 산란(SSC높음), II) 계통 형광색소 음성, III) CD326 형광색소와 항체가 결합된 CD326 형광색소에서 양성인 사건을 식별함으로써 이루어집니다.
    참고: 비AECII와 AECII를 구분하기 위해 밝기 지수가 높거나 매우 높은 플루오로크롬(예: APC, PE, BV785)을 사용하세요. 염색액에서 항-CD326을 제외하는 순수 분류 방식에서는 AECII가 계통 음성, SSC고세포, 자가형광양성/고 세포로 식별됩니다. AECII 자가형광은 FITC나 GFP 검출기와 같은 녹색광 검출기에서 식별할 수 있습니다.
  4. 전방향 산란 높이와 함께 더블릿이나 집합체를 제외합니다 . 면적(FSC-H 대 FSC-A) 및 측면 산란 높이 대 면적(SSC-H 대 SSC-A).
  5. 분리된 세포를 HEPES와 10%(v/v) FBS를 보조한 DMEM이 포함된 튜브에 수집하고, 원심분리기를 사용하여 추가 분석 또는 배양을 진행합니다.

6. PFA 고정 AECII로부터 RNA 분리 (선택 사항)

참고: AECII를 호흡기 바이러스 병원체에 감염된 쥐에서 분리할 경우, 병원체에 따라 BSL2 또는 BSL3 조건 하에서 분리되어야 합니다. 실험자가 적절한 안전 조건 하에서 세포 분류에 접근할 수 없는 경우, 위에서 설명한 프로토콜로 분리된 AECII는 항체 염색 후 PFA로 고정할 수 있습니다. 이 단계는 병원체를 비활성화하여 이후 유세포 AECII 분류가 BSL1 조건에서 이루어질 수 있습니다. 고정 과정 때문에 더 이상 기능적 분석에 사용할 수 없지만, 분자 분석에는 적합하다.

  1. 바이러스 불활성화를 위해서는 항체 표지된 단일 세포 현탁액을 4% PFA 500 μL에 고정합니다.
    주의: 인화성 고체. 삼키거나 흡입하면 해롭습니다. 피부 자극과 심각한 눈 손상을 유발합니다. 알레르기 피부 반응, 호흡기 자극, 암을 유발할 수 있습니다. 유전적 결함을 유발한 것으로 의심됩니다. 열은 피하세요. 삼켰다면: 몸이 좋지 않으면 독물 센터나 의사에게 연락하세요. 흡입 시: 신선한 공기로 옮겨 숨 쉴 수 있도록 편안하게 유지하세요. 몸이 좋지 않으면 독극물 센터나 의사에게 연락하세요. 눈에 넣었다면: 몇 분간 물로 조심스럽게 헹구세요. 콘택트렌즈가 있다면 제거하고 쉽게 착용하세요. 계속 헹구세요. 노출되었거나 걱정된다면: 의료 상담과 주의를 받으세요.
    참고: 3R 가이드라인을 준수하여 본 연구에서는 감염되지 않은 쥐에서 채취한 AECII를 사용했습니다. AECII는 상온에서 10분 고정되었습니다. 고정 시간은 인간과 환경에 잠재적 위험을 초래할 각 병원체별로 개별적으로 테스트해야 합니다. S1 조건에서의 후속 분류는 PFA 고정 후 복제 가능한 바이러스가 존재하지 않는지 BSL2 또는 BSL3 실험실에서 사전 검증이 필요합니다.
  2. 고정 후에는 DMEM과 원심분리기로 세포를 140 x g에서 15분간 세척합니다.
  3. 세포를 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS에 재현탁하고, 세포 현탁액을 100 μm 세포 체를 통과시킵니다.
  4. 과도한 세포 손실을 방지하기 위해 추가로 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS 배지로 세포 체를 세척하세요.
  5. 5단계에서 설명한 대로 셀을 정렬하세요. "AECII 분류".
    참고: 어떤 바이러스든 4% PFA 처리로 비활성화되었음을 의무적으로 실험적으로 검증한 후, AECII는 BSL1 조건에서 분류될 수 있습니다.
  6. PFA 고정 세포에서 RNA 분리를 위해서는 RNeasy FFPE 키트를 사용하세요.
    주의: 이 키트에는 유해 화학물질이 포함되어 있습니다. 제조사의 지침을 따르세요. 포함된 안전 데이터시트와 다음 조정 사항을 주의 깊게 확인하세요:
    1. 분류 후에는 세포를 140 x g 온도에서 4 °C에서 15분간 원심분리합니다.
    2. 세포를 150 μL 버퍼 PKD에 재현탁한 후 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
    3. 단백질효소 K 10 μL를 추가하여 56 °C에서 15분간 배양한 후, 세포 수에 따라 최대 15분간 80 °C에서 배양합니다( 표 1 참조).
  7. 프로토콜에 따라 RNase 처리, 세척 단계, 30 μL RNase 무첨가물에서의 최종 용출 과정을 포함하여 RNA 분리 과정을 계속 진행하세요.

결과

여기서 제시된 프로토콜은 신생아부터 유생아, 성체 쥐에 이르기까지 다양한 발달 단계의 쥐 폐 조직에서 AECII를 분리하고 분석하는 최적화되고 상세한 방법을 나타냅니다. 이 방법론은 기계적 및 효소적 폐 해리와 최적화된 유동 세포 분류 워크플로우를 결합하며, BSL1 조건 하에서 감염된 동물 샘플을 처리하여 후속 유량 분류에 적합한 맞춤형 프로토콜을 활용합니다.

실험 데이터는 이 분리 절차(그림 1에 요약됨)가 생존 가능하고 매우 순수한(>95%) AECII 개체군 생산에 높은 효능을 보여주었습니다. 유동 분류는 순수 AECII 집단을 생성했으며, 정렬 후 분석에서는 확립된 세포 표지에 대해 거의 100% 특이성을 검증했습니다(그림 2). 분류 후 세포 샘플의 정량 분석 결과, 신생아 폐에서 전체 폐 준비 단위로 0.15 × 106 유효 AECII와 성인 샘플에서 1.0 × 106 세포 사이의 높은 수확량을 나타냈습니다(그림 3A). 분리된 AECII는 격리 과정 전반에 걸쳐 전형적인 형태(그림 3B)와 세포 무결성을 유지했습니다(그림 3C). 또한, 마우스 적응 IAV(H1N1, 균주 A/푸에르토리코/8/34)를 이용한 mCherry 리포터 단백질(IAV-mCherry12)을 통한 성공적인 체외 감염을 통해 기능적 연구 적용 가능성이 확인되었으며, 세포가 바이러스 복제를 지원하는 능력이 입증되었습니다(그림 4).

샘플 고정이 필요한 실험 워크플로우를 지원하기 위해, 프로토콜에는 PFA 고정을 이용한 특수한 RNA 추출 접근법이 포함되어 있습니다. PFA 고정 AECII에서 다양한 처리 시점에서 RNA 품질을 철저히 조사한 결과, 하위 분자 분석에 적합한 고품질 RNA가 고정 샘플에서 신뢰성 있게 추출될 수 있음이 확인되었습니다(표 1). 추출된 RNA의 품질은 추출 절차 중 80 °C에서 열처리 시간과 직접적인 연관관계를 보였으며, 특정 실험적 필요에 따른 명확한 최적화 지침을 제공했습니다(표 1, 그림 5). 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR) 분석을 통한 검증 결과, PFA 고정 샘플과 신선한 대조군 제제를 사용하여 하우스키핑 유전자(리보솜 단백질 S9, Rps9)와 AECII 특이 마커(계면활성제 단백질 C, Sftpc)의 증폭에 성공했습니다(그림 6).

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그림 1: 효소 조직 소화와 유세포 세포 분류를 이용한 신생아, 유생아 및 성체 마우스 폐에서 AECII 분리를 위한 개략적 워크플로우. 도표는 다양한 연령대의 쥐 폐를 체계적으로 처리하는 과정을 보여줍니다. 쥐 안락사와 폐 추출 후에는 조직 분해를 위한 분산제를 포함한 다단계 효소 소화가 이어집니다. 기계적 파괴 후, 세포는 기공 크기가 점점 줄어드는 일련의 여과 단계를 통해 정제됩니다. 그 후 적혈구가 용해됩니다. AECII의 특이 농축은 조혈 마커(CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), 내피 표지 CD31, 혈소판 표지 CD93, 기관지 상피세포 표지 CD24에 대한 항체 표지, 그리고 특징적인 SSC고치 에 기반한 유세포 분류를 통해 상피세포를 양성 선택함으로써 달성됩니다 세분 AECII의 프로파일. 이 프로토콜은 상위 순도(≥ 95%)의 유효한 1차 AECII를 분리하여 기능 및 분자 분석을 가능하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: 성체 쥐에서 AECII 분리에 사용된 대표성 게이팅 전략. (A) 폐 단세포 현탁액은 다음 항원에 대한 항체로 염색되었습니다: F4/80, CD93, CD11c(APC와 결합), CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24(PE와 결합), CD326(BV785과 결합). (B) 재분석 (A) 순도 분석을 위해. 분류된 AECII는 97.2% 순도를 확인하기 위해 재분석되었습니다. (C) 분류 후 AECII의 대표적인 형광 현미경 이미지. 핵은 DAPI(파란색)로 염색되었습니다. 세포 내 염색은 1차 항-SPC 항체(종: 토끼)를 사용했고, 2차 염색은 염소-항토끼 IgG를 Alexa 594(빨간색)에 결합하여 수행했습니다. AECII는 DAPI와 2차 항체로만 염색되었고, 1차 및 2차 항체로 염색된 비장세포는 관련 대조군으로 작용하여 항-SPC 및 항-래빗Alexa 594의 특이적 결합을 나타냈다. 스케일 바: 20 μm. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

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그림 3: 형광 활성화 세포 분류 후 AECII의 수율, 형태 및 활력. (A) 신생아, 유생아, 성체 쥐에서 폐당 얻은 생존 가능한 AECII 총 수. (B) 분류 후 분류된 AECII의 광학 현미경 이미지. 스케일 바: 75 μm. (C) 분류 후 트리판 블루 염색으로 관찰된 AECII 생존 가능성. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: IAV-mCherry를 이용한 분류된 AECII의 체외 감염. 성체 쥐에서 분리한 AECII 세포는 부착을 위해 마트리젤 코팅 조직 배양판에서 체 외 밖에서 하룻밤 배양했습니다. 이후 세포들은 IAV-mCherry(감염 2번의 다중도)에 8시간 동안 감염되었습니다. mCherry 신호 세기가 시간에 따라 증가하는 것이 관찰되었습니다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

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그림 5: 4% PFA 고정 AECII에서 나온 RNA 무결성. Qiagen FFPE RNeasy 키트를 사용해 수정한 RN 분리 후 PFA의 대표적인 RNA 프로필을 고정하고 정렬한 AECII입니다. 18S 및 28S rRNA의 특정 피크와 RNA 품질 수(RQN)는 PFA 고정 AECII에서 분리된 온전한 RNA의 RNA 무결성과 품질을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 6: 대조군(미처리)과 4% PFA 고정 AECII에서 Rps9 하우스키핑 유전자 및 AECII 특이 유전자 Sftpc 의 증폭 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

샘플80 °C에서의 부화 시간28S/18SRQNRNA 컨디션. [ng/μ]
컨트롤 0,5x106-2105.8
컨트롤 1x106-1.91012.3
PFA 고정 0,5x106526.45.5
PFA 고정 0,5x106101.98.13.7
PFA 고정 0,5x106151.88.22.76
PFA 고정 1 x106528.26.26
PFA 고정 1 x106101.18.45.12
PFA 고정 1 x106150.98.55

표 1: 4% PFA 고정 AECII에서 분리된 RNA 품질 - 고정 시간의 영향. AECII에서 추출한 RNA는 제조사 프로토콜(FFPE RNeasy Kit)에 따라 분리되었으며, 6단계에서 설명된 수정이 있었습니다. 고정된 세포들은 80°C에서 5분, 10분 또는 15분 동안 배양하여 샘플에서 RNA를 희출했습니다. RNA 무결성은 Agilent의 Fragment Analyzer를 사용하여 측정되었습니다

토론

여기 제시된 최적화된 프로토콜은 신생아, 청소년, 성인 연령에서 쥐 폐 조직에서 AECII를 분리하고 분석하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 접근법을 제공합니다. 또한, 분류 전에 선택적으로 PFA 고정 단계를 제공하여, 이전에 호흡기 병원체에 감염된 쥐라도 BSL1 조건 하에서 AECII를 분류할 수 있게 합니다. 신중하게 수행된 폐 노출과 관류, 이어서 기관내 기관내 염소 주입과 저용해 아가로스를 폐에 투여함으로써 조직 구조가 유지되어, 후속 분석을 위한 고품질 단세포 현탁액 회수가 가능합니다. 측면 산란 특성에 대한 유세포 분류, 계통 음성 게이팅, CD326 양성 세포에 대한 양성 선택을 추가하여 AECII의 매우 순수한 집단이 나타났습니다. 이러한 순도는 분자 및 기능적 분석이 AECII 생물학의 본질을 대표하고 오염된 세포 유형에 의해 혼동되지 않도록 하는 데 특히 중요하며, 이는 유전자 발현 및 바이러스-숙주 상호작용 연구의 해석 가능성을 향상시킵니다.

앞서 언급한 프로토콜은 백혈구 및 비백혈구 항원에 대한 다양한 형광 표지 항체를 사용하여 비AECII를 배제하고, 이후 상피세포 특이적 분자인 CD326의 측면 산란 특성과 발현 을 통해 AECII를 양성 선택하는 방식을 특징으로 합니다. 이 방법론은 SPC를 사용해 매우 순도의 AECII 집단을 얻는 것으로 나타났으나, 지금까지는 분류 후 세포 내 염색으로만 얻은 집단의 순도가 확인되었습니다. 이 프로토콜은 주로 바이러스의 표적이 되고 세포 적응이 뚜렷한 세포 적응을 보이는 SARS-CoV-2 및 인플루엔자 바이러스 감염 폐에서 AECII를 분리하는 데 적용할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 폐암 생물학 연구 맥락에서 쥐 AECII를 분리하는 데 적합하지 않을 수 있는데, EpCAM(CD326)은 쥐와 인간의 폐암세포에서도 발현되기 때문입니다13. 이 연구들에서는 Spc 프로모터의 전사 조절 하에 형광 단백질을 발현하는 형질전환 마우스 균주를 사용하는 것이 1차 AECII의 신뢰성 있는 분리에 더 적합한 접근법을 제공할 수 있습니다.

신생아 폐당 0.15 × 106개의 유효 AECII와 성인 폐당 최대 1.0 × 10 6개의 세포 수확률은 프로토콜의 효율성과 확장성을 보여줍니다. 대량의 AECII 분리에 큰 장애물은 비효율적인 효소 소화와 폐 조직의 기계적 붕괴입니다. 따라서 2.1.4단계에서는 기관지 폐조 공간을 효소로 완전히 채우고, 3.1.3단계에서는 기계적 조직 분해를 신중하게 수행하는 것이 중요합니다. 효과적인 효소 소화는 가시적 응집체의 기여가 최소화된 탁한 세포 현탁물을 만들어내며, 이는 다음 필터 단계에서 플런저를 사용해 분해할 수 있습니다. 세포 체를 통과할 수 없는 더 큰 응집체는 보통 효소 소화가 부족할 때 발생합니다. 효소 소화 시간을 연장하는 것은 권장되지 않으며, 이는 이후면역염색에 부정적인 영향을 미치고 따라서 FACS 기반 AECII 분리의 정확도에 영향을 줄 수 있습니다.

효소 및 기계적 조직 분해의 효율성 외에도, 유전적 배경이 AECII 수율에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜에는 C57BL/6 배경에 있는 마우스가 사용되었습니다. 보고된 발달15, 면역16, 생리학적 17,18,19 균주 특이적 차이에 따라, 다른 실험실 마우스 균주(예: BALB/c, DBA)를 사용하면 서로 다른 AECII 수율이 나올 수 있습니다. 더불어, 염증이 생긴 폐(감염성 또는 비감염성 폐)에서 발생하는 AECII 수확량은 크게 감소할 수 있습니다. 이는 IAV20,21과 SARS-CoV-2 22,23,24의 주요 표적인 AECII의 간접(염증성) 또는 직접적(병원체 매개 세포 사사) 결과일 수 있습니다.

기계적 해리, 효소 소화, 유동 분류 과정에서 세포의 무결성 보존은 분자 및/또는 기능 분석의 추가 핵심입니다. 따라서 AECII의 생존 가능성과 세포 기능은 분류 후 평가되었습니다. AECII는 마트리젤에 부착할 수 있었고, 최소 24시간 동안 특징적인 층상 형태를 유지할 수 있었으며, 이는 분리 후 기능적 능력과 체외 배양(감염 모델 포함)에 적합함을 나타냅니다.

IAV-mCherry 리포터바이러스 12에 의해 분류된 AECII의 효율적인 감염과 강한 바이러스 복제 관찰은 이 시스템이 상피-내인 항바이러스 반응을 밝히는 견고한 플랫폼임을 입증합니다. AECII는 계면활성제 생합성, 폐포 재생, 선천면역에 관여하는 주요 과정을 조절하기 때문에, 정제된 AECII 집단에서 IAV 복제 동역학과 숙주 전사 반응을 조사하는 능력은 혼합 세포 제조에서는 얻을 수 없는 통찰을 제공할 것입니다.

이 프로토콜의 핵심 혁신 중 하나는 고정 절차를 포함하여 신선한 샘플과 비활성화된 샘플을 나란히 분석할 수 있게 한 것입니다. PFA 고정과 적응된 FFPE RNA 추출 과정은 성공적인 정량적 역전사체 PCR(qPCR)으로 입증되듯, 후속 전사체 분석과 가능한 수준으로 RNA 무결성을 유지합니다.

PFA 고정 시간은 염색의 질에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 FACS에 의한 AECII 회복에 영향을 줄 수 있습니다. 더불어, RNA의 수율과 품질은 일반적으로 고정 과정에 의해 영향을 받습니다. 사용되는 생체 감염 모델에 따라 이러한 측면들은 실험 설계에 고려해야 합니다. 긴 고정 시간을 피하고 대신 PFA 처리 시간을 최적화하여 해당 바이러스의 완전한 불활성화를 보장하는 데 실험적으로 입증된 최소 필요한 시간을 사용하는 것이 권장됩니다.

마이크로플루이딕스 기기를 이용한 리보솜 RNA(rRNA) 풍부도 평가는 생물학적 샘플 내 mRNA 품질을 추정하는 대리 역할을 합니다. 명시된 AECII 고정/RNA 분리 프로토콜은 28S/18S rRNA 비율 >1과 RNA 품질 수(RQN) 값 >8에서 확인할 수 있듯이, 하위 전사체 분석을 위한 충분한 품질을 가진 온전한 RNA를 분리할 수 있습니다. 80 °C 배양 단계는 RNA 수율과 품질을 심각하게 저하한다는 점을 유념해야 합니다. 열처리 시간의 적응은 선택적으로 RNA 수율과 품질을 높이기 위해 적용될 수 있습니다.

이러한 방법론적 개선은 건강, 감염병, 발달(신생아부터 성인까지) 맥락에서 AECII 생물학 연구를 위한 광범위한 도구 키트를 제공합니다. 이 접근법으로 분리된 AECII의 높은 수율과 순도는 다중 옴 프로파일링을 가능하게 하며, 전사체적, 단백질체적, 염색질 접근성 분석뿐만 아니라 기능적 분석(예: 체외 감염)을 포함하여 AECII의 관련 기전을 생 체 내에서 더 깊이 해부할 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자들은 전문적인 기술 지원을 제공해 준 Tatjana Hirsch와 Friederike Kruse, 유용한 토론을 해준 Lisa Hönicke와 Justine Smout, 그리고 IAV-mCherry 리포터 바이러스를 제공해 준 Yoshihiro Kawaoka에게 감사드립니다. 이 연구는 독일 연구재단(Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG)의 TRR 359 - 프로젝트 번호 491676693(D.B. 및 J.H.에게), COVIPA 이니셔티브(KA1-Co-02, 헬름홀츠 협회; D.B.에게), 그리고 독일 연구 재단의 보조금(BO 7036/1-1; J.D.B.에 지원)의 지원을 받았습니다. 오토 폰 게릭케 대학교 마그데부르크 의과대학 오픈 액세스 출판 기금의 지원을 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ACK 버퍼--8.29g NH4Cl, 1g KHCO3, 200 및 마이크로; L은 0입니다. 5M EDTA, 1000 mL 밀리-Q 추가, pH를 7.2에서 7.4로 조절
안티마우스 CD11be바이오사이언스12-0112-83클론 M1/70; PE 결합
안티마우스 CD11c바이오레전드117310클론 N418; APC 연결
안티마우스 CD16/32BD 생명과학553141클론 93; 정제됨
안티마우스 CD16/32BD 생명과학561727클론 2.4G2; PE 결합
안티마우스 CD19바이오레전드115508클론 6D5; PE 결합
안티마우스 CD24바이오레전드101808클론 M1/69; PE 결합
안티마우스 CD31바이오레전드102408클론 390; PE 결합
안티마우스 CD326바이오레전드118245클론 G8.8; BV785 연결
안티마우스 CD45BD 생명과학553081클론 30-F11; PE 결합
안티마우스 CD93e바이오사이언스17-5892-82AA4-1 클론; APC 연결
안티마우스 F4/80바이오레전드123116복제 BM8; APC 연결
안티마우스 SPC ABCAMab211326숙주 종: 토끼; 클론: EPR19839; 정제됨
아리아 퓨전BD 생명과학셀 소터(Cell Sorter)
아리아-II SORPBD 생명과학셀 소터(Cell Sorter)
바이오짐 플라크 아가로스바이오짐840101H2O 내 1% (w/v)
셀 스트레이너(100 및 마이크로; m, 70 & micro; m, 40 & micro; m)BD 팔콘352360, 352350, 352340
셀트릭스(50 및 마이크로; m)시스멕스04-004-2327
소 췌장에서 추출한 디옥시리보뉴클레아제 I, 2000 Kunitz 단위/바이알시그마-올드리치D4263330 및 마이크로에 신선히 용해된 1바이알 함량; L DMEM
분산, 100 mL (5000 카제이노리틱 단위)코닝354235멸균 여과 수행 (공극 크기 0.22 & 마이크로; m), 4 mL 이리코트를 15 mL 튜브에 준비하고, -20 & deg에서 보관합니다; C
DMEM깁코31885-049저혈당에 피루빈산을 추가하여 HEPES(최종 농도 25 mM)
FACS 디바BD 생명과학분류 소프트웨어
플로우조FACS 데이터 평가 소프트웨어
염소 안티-래빗알렉사 594 커플링
인딩 캐뉼라 인트로칸 22G브라운4252098B
RNeasy FFPE 키트치아겐73504
심포니 시즌 6 SEBD 생명과학셀 소터(Cell Sorter)

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감염성 실험 환경에 적응하는 신생아, 유아, 성체 쥐 폐에서 폐포 유형 II 상피세포 분리
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