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방법 논문

마우스 피부의 촉각 감각 축삭 형태의 생명체 내 2광자 영상

840 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69589

⸱

2025년 12월 30일

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 생 체 내 2광자 영상 접근법을 통해 쥐의 앞발 피부에서 저역계 기계수용체(LTMR) 축삭 말단 구조를 시각화하는 방법을 제시합니다. 개별 축삭의 반복적이고 고해상도 영상을 사용하여 이 방법은 발달 과정과 성인에서 피부 감각 회로의 구조와 기능을 연구할 새로운 플랫폼을 제공합니다.

초록

저역치 기계수용체(LTMRs)는 진동, 머리카락 편향, 압력과 같은 무해한 가벼운 촉지 자극을 감지하는 체성감각 뉴런입니다. 이들은 말초에 아형별 축삭 말단을 형성하고, 축삭을 척수 중심으로 투사하여 촉각 정보를 전달합니다. LTMR 개발과 조직에 대한 현재의 이해는 축삭 배선과 재형성의 동적이고 시간적인 과정을 드러낼 수 없는 고정된 조직에서 나옵니다. 여기서는 발달 중 쥐 앞발과 성체에서 LTMR 축삭 형태를 시각화하기 위한 2광자 영상 방법을 제시합니다. 2광자 현미경은 온전한 피부 내에서 고해상도 영상을 구현할 수 있어, 동일한 축삭 말단을 출생 후 시점에 걸쳐 반복적으로 촬영할 수 있습니다. 2광자 영상은 새로운 마우스 유전학 도구와 결합하여 축삭의 발달을 아형에 특이적으로 밝힐 수 있습니다. LTMR의 만성 영상 검사는 손상 후 회로 조립 및 수리 연구를 가능하게 합니다. 이러한 접근법은 체성감각 축삭 발달과 재생을 조절하는 세포 메커니즘에 대한 새로운 통찰을 제공하는 생체 내 시스템을 제공합니다.

서론

촉각은 가장 이른 감각으로 발달하며, 유기체가 물리적 세계를 경험하고 반응하는 데 중심적인 역할을 합니다. 촉각은 저역치 기계수용체(LTMRs)에 의해 감지되며, 이는 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런의 아형으로, 움푹 들어간 부분, 진동, 머리카락 편향 등 무해한 기계적 자극을 감지합니다 1,2. LTMR은 가성단극성으로, 말초 축삭을 말초 조직으로 연장하여 아형별 말단을 형성합니다. 이들의 중심 축삭은 척수 신경세포와 시냅스 연결을 형성하여 촉각 정보를 중추신경계에 전달합니다. 하지만 촉각 회로가 어떻게 형성되고 유지되는지는 잘 알려져 있지 않습니다.

1960년대와 1970년대에 고양이를 대상으로 한 초기 기초 연구들은 털이많은 피부에서 기능적으로 구별되는 기계수용체와 그 반응 특성을 처음 규명했다. LTMR 하위 유형은 고유한 형태, 전도 속도, 반응 특성에 따라 분류됩니다. 주요 LTMR 아형은 Aβ 급속 적응(RA) 및 느리게 적응(SA) LTMR, Aδ-LTMR, C-LTMR 2,6,7입니다. Aβ RA-LTMR, Aδ-LTMRs, C-LTMRs는 모낭 주위에 종방향 창 복합체를 형성합니다2. Aδ-LTMR은 모낭 주위에 극성 창 말단을 형성하는데, 이는 모발 편향에 대한 방향 선택적 반응에 필수적인 특징입니다. 창문형 복합체의 축삭 말단은 모발 줄기와 밀접하게 정렬되어 있으며, 말단 슈반 세포에서 나오는 손가락 모양 돌기로 감싸여 영양 지원을 제공하고 축삭 형태형성에 영향을 미친다 8,9,10. 무두피에서 Aβ RA-LTMR의 축삭은 진피 유두에 위치한 타원형 구조인 마이스너 소구에서 끝나며, 이 구조는 피부를 가로지르는 움직임에 맞춰져 있습니다 2,11.

LTMR 축삭 말단의 조직은 발달 중 내재 프로그램과 피부 의존적 신호에 의해 조절됩니다12,13. 손상된 LTMR 기능 장애는 기계적 이색 부통(mechantic allodynia)과 같은 병리적 상태와 연관됩니다12,14. 그러나 LTMR이 온전한 피부에서 발생하고 유지하는 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 이들의 발달에 대해 알려진 많은 부분은 고정된 조직에서 비롯되며, 이 조직은 생체 내에서 일어날 수 있는 동적 과정을 포착할 수 없습니다. 예를 들어, Aβ RA-LTMR과 Aδ-LTMR은 출생 후 초기 발달 시 모낭 주변의 능동적 신경 지배와 축삭 전정을 보입니다19. 모낭 신경 지배와 유지 방식은 생체 내에서 어떻게 이루어지는지는 아직 알려지지 않았습니다.

2광자 레이저 주입 현미경은 살아있는 조직 내 형광 표지된 구조를 시각화할 수 있는 첨단 영상 기법으로, 동적 생리학적 과정의 고해상도 생체 내 영상 촬영을 가능하게 했습니다20,21. 2광자 영상 중에는 근적외선 빛의 짧은 펄스가 초점면에서만 형광체를 여기시켜 신호를 작은 부피로 제한하고 초점 어긋난 형광을 최소화합니다21,22. 이 구두는 광독성을 크게 줄여 20,23,24 구조물의 3차원 공간 해상도 영상을 가능하게 합니다. 더불어, 2광자 현미경에서 사용되는 긴 여기 파장은 조직 내에서 산란이 적어 복잡한 환경에서 더 깊은 관통과 낮은 잡음을 가능하게 합니다20, 25, 26. 예를 들어, 2광자 영상 검사에서 척수 등쪽 뿔 뉴런 27,28,29에서 구조적 시냅스 가소성과 신경 활동이 밝혀졌습니다. 또한, 생체 내 만성 2광자 모낭 영상을 통해 쥐 귀 피부에서 모낭의 항상성에 대한 통찰을 얻었습니다23. 따라서 2광자 현미경은 특히 발달 및 만성 변화를 추적하기 위해 반복적이고 장기 영상이 필요한 경우 생체 내 피부 내 LTMR 구조 연구에 매우 적합합니다.

형광 리포터를 발현하는 유전자 변형 마우스 계통과 결합되면, 2광자 현미경 검사는 피부 내 신경 형태를 밝힐 수 있습니다. 체감각계에서는 thy1 프로모터(Thy1-YFP)의 조절 하에 발현되는 황색 형광 단백질(YFP)30이 털이 많은 피부의 Aβ-LTMR 창술 복합체와 털 피부의 마이스너 혈구를 선택적으로 표지합니다30,31. Thy1-YFP 마우스에서 표지된 축삭은 수초화 Aβ 축삭의 표지자인 미엘린 염기성 단백질과 신경섬유에 대해 양성으로 나타난다30,31. 또한, TrkBCreER은 TrkB(트로포마이오신 수용체 키나제 B) 유전자 발현에 의해 타목시펜 유도 Cre 재조합효소(CreER)가 발생 중 Aδ-LTMR을 선택적으로 표지합니다. 피부에서는 마취된 마우스에서 LTMR을 이미징하는 데 2광자 현미경이 가장 효과적인데, 마우스의 움직임이 고해상도 이미징에 영향을 미치기 때문입니다. CreER 유도 발현 후 축삭 말단에서 형광 단백질을 시각화하는 데 시간이 걸리며, 각 형질전환 라인에 대한 최소 대기 기간을 결정해야 합니다. 일반적으로 이 방법론은 모든 발달 단계의 쥐와 성체에서 LTMR을 시각화하는 데 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 발달 중과 성체 쥐의 털이 많은 피부에서 LTMR 축삭 형태를 고해상도로 연구하기 위해 2광자 현미경 검사 절차를 설명합니다. 프로토콜에는 최적의 고해상도 및 만성 영상 촬영을 위한 여러 팁이 포함되어 있습니다. 이러한 통합적 접근법은 생체 내에서 촉각 감각 축삭의 조립과 가소성을 결정하는 세포 메커니즘을 연구할 수 있게 합니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 기관 동물 관리 규정을 준수하여 수행되었으며, 밴더빌트 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험자들의 안전을 위해 모든 시술은 실험복, 멸균 장갑, 마스크를 착용한 채 수행되었다. 모든 도구는 사용 전에 철저히 멸균되었고, 실험 표면은 각 실험 전후로 70% 에탄올로 세척되었습니다. 이 연구에 사용된 쥐는 청소년과 성별 동물로, Thy1-YFP, TrkBCreER, Ai140 균주에서 유래했습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 악기 준비

  1. 레이저 켜. 레이저가 예열될 충분한 시간을 주세요. 이 연구에서는 펄스 지속 시간이 100펨토초(fs), 반복 속도 80± 0.5메가헤르츠(MHz)를 가진 카멜레온 디스커버리 NX 레이저가 사용되었습니다.
  2. 2광자 현미경을 켜고 컴퓨터에서 제어 및 획득 소프트웨어를 열어.
  3. 마취 중 저체온증을 방지하기 위해 온열 패드를 켜고 37°C로 설정하세요.

2. 영상 촬영을 위한 마취 및 전발 준비

  1. 마취를 유도하기 위해서는 마우스를 유도실에 넣고 시스템을 3.5% 이소플루란으로 설정하여 마우스가 올바른 반사를 잃고 부드럽고 규칙적인 호흡을 보이게 됩니다(기관에서 승인한 프로토콜 준수). 실내 공기는 운반체로 사용되며 분당 1.0리터(L/min)로 설정해야 합니다.
  2. 마우스를 영상 플랫폼의 가열 패드 위에 올려놓고 이소플루란을 1.5%로 줄이고 산소를 분당 0.5L로 줄입니다. 이소플루란은 코 콘을 통해 투여해야 합니다. 출생 후 20일 미만의 쥐는 마취 유지를 위해 이소플루란 농도가 2-4%로 설정됩니다. 마취 깊이를 10분마다 모니터링하여 발과 손 반사의 손실, 호흡 속도와 깊이, 그리고 전반적인 근육 긴장도를 평가합니다.
  3. 영상 촬영 중 호흡 관련 움직임 등 움직임 아티팩트를 최소화하기 위해 쥐는 발과 별도의 스테이지에 배치해야 합니다. 이 프로토콜에서는 마우스 몸체가 발이 장착된 영상 플랫폼 바로 옆에 위치하지만 접촉하지 않는 플랫폼에 놓입니다.
  4. 영상 촬영 중 건조함을 방지하기 위해 안과 연고를 눈에 바르세요.
  5. 면봉으로 발에 부드럽게 제모 크림을 발라 털을 제거하세요. 피부에 1분간 두었다가 크림을 제거한 뒤, 70% 에탄올과 물로 쥐 발을 깨끗이 닦으세요.
  6. 피부를 부드럽게 늘려 피부 표면을 안정시키세요. 멸균된 30G 바늘과 검은 잉크를 사용해 의도한 이미지 영역 양쪽에 인접한 점 두 개를 넣어 피부와 문신을 부드럽게 찌릅니다. 점들은 약 2밀리미터(mm) 간격으로 배치하세요. 문신이 끝난 후에는 바늘을 날카로운 용기에 적절히 버리세요.
  7. 유리 현미경 슬라이드에는 모서리에 진공 그리스 점 네 점을 바르고, 슬라이드 중앙에는 약 1mm 두께의 점토(예: DAS 공기 경화 모형 점토)를 놓습니다. 슬라이드를 대물렌즈 아래에 놓고 마우스 발을 점토 조각 위에 직접 중앙에 둡니다(그림 1A,B). 쥐의 발을 슬라이드 위에서 살짝 굴려 평평하게 만들고 점토에 눌러주세요. 슬라이드를 고정하기 위해 발 위에 22mm x 60mm 크기의 커버슬립을 조심스럽게 올려놓으세요. 커버슬립의 각 모서리에 가벼운 압력을 가해 마우스 피부의 각도를 조절하여 커버슬립과 피부 표면이 영상 평면과 평행해지도록 합니다. 영상 촬영 시 부드러운 힘을 사용하면 잠재적인 피부 손상을 예방할 수 있습니다.
  8. 모무 피부를 촬영할 때는 슬라이드를 대물렌즈 아래에 놓고 마우스 발톱을 슬라이드 중앙에 위치시키세요. 2.7단계에서 설명한 대로 핀셋을 사용해 발을 돌려 투명한 피부가 위로 향하게 하세요. 핀셋의 평평한 끝을 사용해 발을 점토에 부드럽게 눌러 주세요. 발이 평평해지면 커버슬립을 위에 올려놓고 2.7단계에서 설명한 대로 아래로 누릅니다.

3. LTMR 형태학의 2광자 현미경 영상

참고: 다음 매개변수는 특정 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 이 실험에는 20배 수중 잠수 대물렌즈가 사용되었으며, 수치 조리개는 1이고 작동 거리는 2.00mm였습니다. 3.1-3.6단계는 Thy1-YFP 마우스의 오른쪽 앞발에 사용되는 구체적인 매개변수를 설명하며, 참고 가이드 역할을 할 수 있습니다.

  1. 표지 위에 증류수를 한 방울 떨어뜨려 쥐 발 바로 위에 떨어뜨립니다.
  2. 대물렌즈를 물기둥이 형성될 때까지 낮춥니다.
  3. 대물렌즈가 마우스 발 위에 중앙에 오르면 현미경 박스를 닫고 X 버튼, Y버튼, Z 컨트롤러 를 통해 LED 스크린을 사용해 샘플에 초점을 맞추세요. LED 스크린은 현미경 내장 LED에 의해 밝혀진 실시간 이미지를 표시합니다.
    참고: LED 모드는 대물렌즈가 관심 시야에 중심에 있는지 확인하기 위해 사용되며, 이후 2광자 모드로 전환됩니다. LED 이미지는 혈관과 모낭과 같은 표면 특징을 보여주며, 정렬과 표적 지정을 위한 시각적 가이드 역할을 합니다. 쥐 발에 새겨진 문신은 LED 화면에 검은 점으로 나타납니다. 이 랜드마크들을 이용해 검은 점들 사이의 영역을 찾아 집중하세요. 이렇게 하면 쥐 발의 같은 부위가 반복적으로 촬영됩니다.
  4. 샘플을 찾으면 LED 화면을 끄세요. 조직에서 2광자 이미징을 수행하려면, 현미경 오른쪽 상단의 레버를 뒤집어 미 러 설정에서 이색 성 설정으로 전환합니다.
  5. 암막 커튼을 닫고 탐지기를 켜서 YFP를 시각화하세요.
  6. 프레리 뷰를 사용해 셔터 를 열고 소프트웨어를 이미징 모드로 전환하세요. Thy1-YFP 이미징을 위해서는 960나노미터(nm)로 설정한 조정 레이저를 700-800 이득으로 설정하세요. GFP 영상 촬영 시 조정 가능한 레이저를 920nm로 설정하세요.
    1. 출생 후 10일 이내 쥐의 경우 초기 레이저 출력을 50으로 설정하고, 원하는 신호 강도가 나올 때까지 점차 증가시킵니다. 이 낮은 초기 레이저 출력은 빛 투과와 광손상 위험을 최소화합니다. 레이저 파장, 이득, 출력이 설정된 후 스캔을 시작하세요.
      참고: 고해상도 1.00배 시야각 이미지나 무모 손끝으로 마이스너 혈구 이미지를 촬영할 때는 1024 x 1024 이미지 크기, 601.9 μm x 601.9 μm의 영상 시야각, 0.588 μm x 0.588 μm의 픽셀 크기를 사용하는 것이 권장됩니다. 모낭 주변의 창문형 말단을 촬영할 때는 8.00배 확대 시 이미지 크기가 1024 x 1024, 영상 시야각은 75.2 μm x 75.2 μm, 픽셀 크기는 0.147 μm x 0.147 μm가 권장됩니다. 줌 설정에 따라 영상 시야와 픽셀 크기가 변한다는 점을 유의하는 것이 중요합니다.
  7. X, Y, Z 컨트롤러를 사용해 영상 필드를 찾고, 필요에 따라 줌을 조정한 뒤 이미지 획득을 시작하세요. 최적의 이미지는 일반적으로 피부 표면 아래 약 10-20 μm 지점에서 얻어집니다.
    참고: 털이 많은 피부의 고해상도 이미지는 일반적으로 1 μm 또는 2 μm 크기이며 약 40-120개의 슬라이스를 포함합니다. 반면, 무머리 피부의 고해상도 이미지는 일반적으로 2 μm에서 4 μm 사이이며 약 80-100개의 슬라이스를 포함합니다. 이로 인해 일반적인 z-범위는 100-250 μm이며, 전체 최대 영상 깊이는 약 300 μm입니다.
  8. 이소플루란 노출 시간을 최소화하고 마취 관련 부작용 위험을 줄이기 위해 영상 촬영 시간은 25분으로 제한됩니다. 여분의 이소플루란은 마취용 숯 필터 캔에 흡수되며, 일반 쓰레기통에 버릴 수 있습니다.

4. 수술 후 관리

  1. 마우스 발을 유리 슬라이드에서 떼어내고 다시 회수 케이지로 옮기세요.
  2. 쥐가 완전히 마취할 때까지 온열 패드 위에 쥐 우리를 따뜻하게 유지하세요.
  3. 쥐를 다시 집 우리에 넣고, 추가로 30분 동안 관찰하여 새장 동료들과 잘 어울리는지 확인하세요.

5. LTMR 형태의 생 체 내 만성 영상

  1. 마우스를 2광자 현미경 아래에 두는 방법은 2.4-3.3 단계를 따라 합니다.
  2. LED 스크린을 사용해 이전 촬영 세션에서 발견한 잉크 점을 찾아보세요. 원하는 영역이 포착되었는지 화면을 점 사이에 배치하세요. 현미경 스캔 모드에서는 큰 신경이나 모낭 패턴과 같은 랜드마크를 확인하여 동일한 부위를 찾도록 합니다.
  3. 영상 부위를 찾으면 3.4-3.6단계를 따라 영상을 계속 진행하세요.
  4. 두 광자 여기로 피부 부위를 얻은 이미지의 품질과 강도, 그리고 주요 축삭의 형태를 확인하세요. 이미지 필드가 이전 영상 세션에서 촬영된 것과 비교 가능한지 확인하세요.

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결과

이 연구에서는 발달 과정과 성인 피부 내 Aβ RA-LTMR 및 Aδ-LTMR 축삭 구조를 시각화하기 위해 2광자 현미경을 사용했습니다. 생후 20일경 이상에서 발생한 성숙한 창문형 말단은 완전히 발달했으며19,32. 성체 쥐의 털이 많은 피부에서 축삭 말단의 전반적인 조직이 최대 강도 투영(그림 2A)에서 나타났습니다. 이 축삭 말단의 깊이와 형태는 Aβ 장-LTMR, Aβ RA-LTMR, 그리고 일부 미확인 Aβ 아형 축삭을 포함한 3차원 재구성을 통해 관찰할 수 있다(영화 1). 이 영상 영역 내에서 모낭은 자가형광으로 식별할 수 있습니다(그림 2A). 수장형 말단은 가드와 송곳/어쥬른 모낭 주변에서 15.8개의 말단/mm2 밀도로 시각화할 수 있으며, 고해상도로 ...

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토론

이 연구는 신생아 및 성체 마우스의 온전한 피부에서 LTMR 형태를 조사하기 위해 2광자 현미경을 사용했음을 입증합니다. 이 종단 영상 접근법은 조직 고정의 한계를 극복하여 온전한 조직에서 축삭 구조를 실시간으로 관찰할 수 있게 합니다. 2광자 영상을 통해 시각화된 Aβ, RA-LTMR 및 Aδ-LTMR 축삭 형태는 이전 PFA 고정 조직 2,6,7,19,33,34에서 관찰된 것과 일치합니다. 만성 영상 검사에서 눈에 띄는 염증이나 형태학적 변화가 없었기 때문에 레이저 출력이 국소 피부 가열이나 손상을 일으킨다는 관찰...

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공개 사항

저자들은 관련 공개를 보고하지 않았습니다.

감사의 글

이 연구 전반에 걸쳐 지원과 도움을 주신 한나 엘람 박사, 스니다 무커지 박사, 라셸 라리비, 테기 J. 바다칸 박사에게 감사드립니다. 이소플루란 시스템 구축에 도움을 준 라이언 마이클 누에라에게 감사드립니다. 이 연구는 하워드 휴즈 의학 연구소 한나 그레이 펠로우십(Grant# GT17518)의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
대물렌즈 20배 및 ndash; 슈퍼 NA 1.0올림포스1-U2B9652광자 현미경 설치
22x60 표지 슬립VWR16004-3302광자 현미경 설치
공기 경화 모델링 클레이DAS2광자 현미경 설치
마취 공기 펌프(HF), 110VRWD 라이프 사이언스 주식회사R510-30이소플루란 시스템
마취 동심원 마스크RWD 라이프 사이언스 주식회사R510-M이소플루란 시스템
마취 유도실 및 ndash; 쥐와 쥐RWD 라이프 사이언스 주식회사V105이소플루란 시스템
브루커 울티마 인베스티튜터 플러스 레이저 주사 현미경브루커 나노, Inc. 2광자 현미경 설치
버터플라이 바늘피셔 사이언티브14840412광자 현미경 설치
카멜레온 디스커버리 NX TPC와 함께: 듀얼일관성13857772광자 현미경 설치
신생아 쥐용 튜브가 있는 콘 마스크RWD 라이프 사이언스 주식회사68680이소플루란 시스템
이중 방출 필터(et525/70m 및 et595/50m)와 t565lpxr  이크로익 빔 스플리터니콘INVP-012광자 현미경 설치
에피-형광 필터 세트 ET-GFP ET470/40x 및 ET252/50m; 이색성 T495LPXR 니콘5180652광자 현미경 설치
에탄올디콘 연구소 주식회사2광자 현미경 설치
원적외선 워밍 패드와 컨트롤러 (AC 전원)켄트 사이언티픽RT-05152광자 현미경 설치
GaAsp 검출기 (2) 하마마츠 포토닉스 HED-UP-2  2광자 현미경 설치
가스 필터 캐니스터RWD 라이프 사이언스 주식회사R510-31-6이소플루란 시스템
고진공 그리스시그마 올드리치Z273554영상 시스템
이소플루란, USP (250 mL)피라말 중환자 치료6679-017-25이소플루란 시스템
레이저 커버 박스  테코 테크놀로지영상 시스템
마우스: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/J잭스27214
마우스: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/J잭스30220
마우스: B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J찰스 강3709
나이어 헤어 리무버 크림아마존280012광자 현미경 설치
원시 데이터 파일제노도10.5281/zenodo.17370834
대형 직사각형 인서트 홀더가 있는 단단한 스탠드토를랩MP15M2광자 현미경 설치
소동물 마취 수술 플랫폼RWD 라이프 사이언스 주식회사R510-PGL이소플루란 시스템
진정 윤활 눈 연고바우쉬 + 롬2광자 현미경 설치
슈퍼프로스트 플러스 현미경 슬라이드피셔 사이언티브12-550-152광자 현미경 설치

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