다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량

Summary

본 연구는 다공성 막 삽입물을 이용해 축삭 mRNA를 분리하는 견고한 방법을 제시하여, 전체 뉴런과 신경돌의 분리 및 RNA 정제를 가능하게 합니다. RTddPCR과 결합하여 저복제 전사체의 절대적 정량화를 가능하게 하여, 높은 민감도, 재현성, 광범위한 실험적 적용성을 가진 mRNA 수송 및 국소 번역 연구를 용이하게 합니다.

Abstract

뉴런 내 mRNA 위치 및 번역의 공간적 역학은 신경 연결성, 시냅스 가소성, 손상 반응 등 다양한 신경 기능 메커니즘에 필수적입니다. 뉴런의 극성 때문에 이러한 기능들은 축삭이 특정 전사체를 국소적으로 번역하는 능력에 의존합니다. 하지만 이러한 세포 내 RNA 집단을 정량화하는 것은 기술적으로 여전히 어려운 과제입니다. 여기서는 배양된 설치류 뉴런으로부터 분리된 체세포 및 축삭 농축 구획을 얻고, 구획 특이적 mRNA 발현을 정량화하는 재현 가능한 접근법을 설명합니다. 1차 설치류 배아 또는 성체 신경세포는 크기가 1-3 μm 크기의 다공성 막을 가진 삽입물에서 배양하였다. 이 막들은 축삭에만 허용되어 체성 구획과 축삭 구획을 물리적으로 분리할 수 있게 합니다. 이후 전체 신경세포와 축삭 농축 분획에서 RNA를 분리하여, 유전자 특이적 프라이머를 이용한 역전사효소 드롭렛 디지털 PCR(RTddPCR)에 추가로 사용되었습니다. 이 시스템은 세포 내 구획 간 절대적인 정량적 비교를 제공하여 국소화된 전사체의 고민도 검출을 가능하게 합니다. 이 접근법은 정상 상태 RNA 풍부도를 측정하고, 신경영양 인자, 스트레스 또는 손상 모델에 따라 축삭 RNA 변화를 시간에 따라 관찰할 수 있도록 돕습니다. 물리적 구획화와 RTddPCR 분석의 결합은 교차 오염을 줄이고 희귀 전사체의 정확한 복제 수를 제공하여 높은 민감도, 재현성, 그리고 축삭 성장과 재생을 조절하는 저복제 mRNA의 검출을 제공합니다. 이 방법은 단백질 합성 측정, RNA 안정성 연구, siRNA 또는 특정 단백질을 차단하는 약물을 이용한 교란 실험과 같은 후속 검사에도 적용됩니다. 중요한 점은, 이 기법은 다양한 신경 하위 유형, 발달 단계, 또는 손상 모델에 맞게 적용될 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 접근법은 축삭 mRNA 위치의 분자적 기초와 그것이 신경 기능 및 질병 기전에 미치는 영향을 연구하는 데 유연하고 민감하며 재현 가능한 방법입니다.

Introduction

뉴런은 생물학에서 가장 구조적으로 복잡하고 극성이 강한 세포 중 하나입니다. 이들은 때때로 1미터를 넘는 거리까지 도달할 수 있는 긴 공정을 가지고 있습니다. 이 극성은 세포 소통과 단백질 항상성을 각각 복잡하게 만듭니다. 이러한 요구사항을 해결하기 위한 정교한 접근법은 mRNA를 축삭과 수상돌기와 같은 먼 구획으로 운반하여, 국소화된 신호 ^1,2,3에 반응하여 조절된 방식으로 번역을 촉진하는 것입니다. 국소 번역은 축삭이 시공간적으로 단백질을 합성할 수 있게 합니다. 이 과정은 축삭 발달, 시냅스 가소성, 손상 후 재생, 그리고 발달 및 세포외 자극에 대한 반응에 매우 중요합니다 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

축삭 내 국소화된 mRNA의 기능을 분석하는 능력은 정상 신경 기능과 병태생리학 맥락에서 이들의 역할을 이해하는 데 매우 중요합니다. 축삭 mRNA 번역의 조절 이상은 근위축성 측삭경화증(ALS)^17,18,19, 척수성 근위축증(SMA)^20,21, 알츠하이머병(^AD)과 같은 다양한 신경퇴행성 질환과 연관되어 있습니다. 손상 후 축삭 재생은 세포골격 단백질, 신호 분자^{및 수용}체의 빠르고 정확한 번역에 크게 의존합니다 3,23,24,25,26,27,28. 이러한 새로운 개념에도 불구하고, 이 분야는 축삭 특이적 mRNA 집단을 효과적으로 정량화하고 포착하는 데 여전히 도전에 직면해 있습니다.

축삭 전사체학의 도전 중 하나는 소마와 축삭이 깨끗하게 분리되는 것입니다. 대부분의 mRNA가 체내에 풍부하게 작용하기 때문에, 세포체에서 오는 소량의 오염도 특정 mRNA의 축삭 성분 평가 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 마이크로플루이딕 챔버^{29, 30, 31, 32} 또는 캄페노 챔버³³ 등 기존의 기존적 기법은 방향성 축삭 성장과 두 구획 간의 명확한 분리를 제공하지만, 축삭 수율은 대량 RNA 시퀀싱(RNA-seq), RNA 공동면역침전 후 RNA 시퀀싱, 또는 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)과 같은 생화학적 연구에는 너무 낮을 수 있습니다. 대량 RNA-seq와 qPCR은 유익하지만, 축삭에서 저복제 전사체를 정확히 식별할 수 있는 감도가 부족하여 생리학적으로 중요한 종을 잘못 추정하는 경우가 많습니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 저희와 다른 연구자들은 축삭과 체세포 34,35,36,37,38,39,40,41의 물리적 분리를 위해 투과성 막 삽입물을 사용했습니다. 이 삽입물들은 미세다공성 표면에서 신경세포가 발달할 수 있게 하며, 축삭은 이를 통해 하단 구획으로 뻗어나갈 수 있지만 체성은 확장되지 않습니다. 이 기본적이지만 효과적인 구조 덕분에 소마와 축삭이 명확하게 분리된 상태에서 엄청난 수의 뉴런을 배양할 수 있습니다. 막 기반 방법은 마이크로플루이딕 장치에서 발생하는 기술적 문제를 피하고, 분자 및 생화학 연구에 사용할 수 있는 대량의 축삭 물질을 제공하기 때문에 중요합니다. 인서트 시스템은 기계적 손상과 같은 경우에도 사용하기 쉬워 신경 수리와 관련된 다양한 실험 환경에서 유용합니다. 여기서 설명하는 방법은 배양 조건을 정제하고, 막 공의 특성을 조정하며, 저수율 축삭 RNA 샘플에 대한 역전사효소 드롭릿 디지털 PCR(RTddPCR) 기반 검증을 포함하여 신경 수율과 순도를 더욱 최적화합니다.

축삭 분획이 순수한지 확인하는 것도 중요합니다. 우리는 상부 표면에 남은 체세포 물질을 조심스럽게 제거한 후에만 하부 챔버에서 축삭을 추출합니다. 프라이머 검증 결과, 축삭 마커가 강하게 풍부해지고 체세포 마커는 없거나 무시할 수 있는 것으로 나타났습니다. 분자 확인은 이 구분을 강화합니다: 축삭 분획은 Gap43과 같은 알려진 축삭 mRNA로 풍부해지고, Actγ⁴²의 발현은 낮습니다. 이는 인서트 시스템이 소마 함량이 거의 없는 축삭 샘플을 만들어내며, 추가 검사에 적합함을 보여줍니다.

농축된 축삭 분획을 분리한 후, 다음 난관은 매우 낮은 복사본 수로 존재하는 mRNA를 측정하는 것입니다. 축삭 분획에서 얻은 시작 물질이 적고 축삭 내 낮은 복사 수 mRNA의 존재는 표준 곡선을 사용하는 기존 역전사효소 정량 PCR(RT-qPCR)의 감도 한계를 밀어붙입니다. 더불어, RT-qPCR은 특정 전사본의 절대 복사 번호도 제공하지 않습니다. 반면 RTddPCR은 cDNA 샘플을 수천 개의 방울로 분리하여 포아송 통계를 이용해 정확한 전사체 수를 구하는 데 도움을 줍니다. 이로 인해 전체 RNA 5,6,7,43 단일 나노그램 내에 전사체가 소수만 존재하더라도 전사체를 신뢰성 있게 찾을 수 있습니다.

이 논문에서는 삽입물에 부착된 서로 다른 성체 또는 배아 설치류 신경세포 배양, 축삭 농축 구획 중 전체 뉴런에서 RNA를 분리하는 방법, 축삭 순도 검사, 그리고 mRNA 복사본의 RTddPCR 기반 절대 정량 검사를 포함한 간소화된 접근법을 제시합니다. 이 방법들은 기저 조건에서 축삭에 국한되는 특정 mRNA의 수준과 액소절제술 시 또는 성장 인자 자극 또는 신경독성 신호에 반응하여 어떻게 변화하는지 결정하는 데 활용될 수 있습니다. 이 방법을 단백질 공동면역침전과 결합하면 축삭 내 리보핵 단백질(RNP) 복합체의 역학도 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 축삭 Ras GTPase 활성화 단백질 결합 단백질 1(G3BP1) 과립에 존재하는 mRNA를 연구하는 데 이 방법을 광범위하게 사용했습니다. G3BP1은 스트레스 과^{립의 핵심} 성분이며, 이전 연구들은 이 단백질이 축삭 단백질 합성을 억제하고 그 결과 PNS와 중추신경계 축삭 재생을 모두 차단한다는 것을 보여주었다^. 더 나아가, 이 방법은 ALS, SMA, AD 등 다양한 병리생리학적 상태에서 축삭 번역 조절 이상의 역할을 조사하는 데 활용될 수 있습니다.

이 연구의 목표는 민감하고 재현 가능하며 확장 가능한 축삭 mRNA 측정 방법을 개발하고 시험하는 것입니다. 구획화된 삽입 기반 배양과 RTddPCR 기반 정량을 결합함으로써, 우리는 축삭 전사체학의 지속적인 문제에 대한 해답을 제공합니다. 이 방법론은 국소 번역에 관한 필수적인 발견을 가능하게 할 뿐만 아니라, 신경 회복과 신경퇴행에 대한 치료 개입에 초점을 맞춘 번역 연구의 기초를 마련할 것입니다.

Protocol

1. 세포 시딩을 위한 삽입물 준비

1. 적절한 구멍 크기의 인서트를 6웰 플레이트에 배치하세요.
   참고: 축삭을 소마에서 분리할 때는 1 μm 공 크기를 사용하고, 모든 신경 돌기(축삭 및 수상돌기)를 세포에서 분리할 때는 3 μm 공 크기를 사용하세요.
2. 6웰 플레이트에 100 μg/mL 폴리-L-라이신(PLL)을 삽입물 하단과 상단에 닿도록 첨가합니다(웰당 2 mL, 삽입물 1 mL).
3. 37°C에서 하룻밤 배양하세요.
4. 우물(삽입물 하단)과 삽입물 상단을 멸균 초순수수로 세척하세요 - 4회 세척× 5분씩.
5. 배뿌리 신경절(DRG) 뉴런의 경우, 5 μg/mL 라미닌(2 mL/웰, 1 mL/삽입물)을 추가하고 최소 1시간 동안 37 °C에서 배양합니다. 인서트의 위아래가 고르게 코팅되었는지 확인하세요.
6. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4)에 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신 함유 세척 - 5분× 2회 세척.
7. 해양을 진행하여 배아 피질⁵, 해마⁴⁵, 기저 전뇌 콜린성 뉴런^31,32 × 10^{6 개 세포}/삽입물을 시드합니다. 성체 쥐 DRG의 경우 6-8개의 DRG/^{삽입물 5,7}을 플레이트 부착합니다(그림 1).

2. 6웰 삽입물에서 신경세포 이하 분획 수집

1. 각 인서트당 1.5mL 마이크로 원심분리관과 6웰 플레이트의 웰/인서트 1개에 각각 250 μL 트라이졸을 할당합니다. 옆에 두세요.
2. 또 다른 6웰 플레이트에 멸균 PBS 2mL/웰을 추가합니다. 웰/플레이트의 수는 인서트 수에 비례해야 합니다.
3. 인서트의 위아래에서 배양 배지를 흡입하고, 인서트를 PBS가 포함된 6웰 플레이트로 옮깁니다.
4. 겸자를 사용해 삽입물을 부드럽게 놓고 그 위에 2mL의 PBS를 추가하세요. 인서트의 위아래에서 매체를 흡입하고 반복하세요. 총 두 번 PBS로 세척한 후 신선한 PBS에 두세요(인서트 상단과 하단에 각각 1mL와 2mL).
5. 전체 뉴런 분획의 분리
   1. 멸균 세포 스크레이퍼를 사용해 전체 뉴런 분획(인서트 상단)을 긁어내세요. 세포가 떨어지기 시작할 정도로 적절한 압력을 가하지만 막이 깨지지 않도록 하세요(그림 1).
   2. 삽입물에서 전체 뉴런을 채취하여 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
   3. 튜브를 10000-15000g에서 2분간 원심분리합니다.
   4. 상청액을 버리고 용해액을 250 μL 트리졸에 재현탁합니다.
   5. 이 튜브를 전체 뉴런 분획으로 라벨링하세요.
   6. 신경돌기 분획 채취를 계속하세요.
6. 신경돌 분획의 분리
   1. 멸균된 면봉을 가져와서 한쪽 끝을 사용해 전체 뉴런 쪽을 위에서 아래로 지그재그 모양으로 천천히 움직입니다. 인서트를 90도 회전시키고, 면봉의 반대쪽 끝도 이 과정을 반복하세요(양면 면봉을 사용할 경우, 또는 단면 면봉을 사용할 경우 새 면봉을 사용). 이 면봉은 버리세요(그림 1).
   2. 새 면봉을 사용해 인서트 중앙에서 시작해 바깥쪽으로 동심원을 그리며 움직입니다. 벽(둘레)도 꼭 청소하세요.
   3. 막 삽입물을 뒤집어 신경돌기 쪽이 위를 향하게 하고, 새로운 멸균 메스 칼날로 겸자로 막을 절단하세요. 주변에 ~2-3mm 정도 남겨두세요.
   4. 절단된 막을 TRIzol이 들어있는 6웰 플레이트에 뉴라이트 쪽이 아래로 향하게 하여 넣습니다. 반드시 물에 잠겨 있어야 해.
   5. 6웰 플레이트에서 뉴라이트 용해액이 포함된 TRIzol을 수집하여 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
7. 전체 신경세포와 신경돌 용해체 모두에 대해 RNA 분리를 진행하거나 용해액을 -80°C에 보관하여 나중에 처리하는 것이 좋습니다.

3. RNA 분리 및 정량

1. RNA 분리
   참고: 이 부분에서는 항상 RNase가 없는 환경에서 전용 멸균 플라스틱기구와 장갑을 착용하세요.
   1. TRIzol 1mL당 클로로포름 0.2mL를 첨가하고, 15초간 세게 흔든 후 실온에서 2-3분간 배양합니다. 12,000 g × 원심분리기에서 4 °C에서 15분간 분리하여 유기층, 간상층, 그리고 RNA를 포함한 수층으로 분리합니다.
   2. 상부 수상을 새로운 관으로 옮기고, 간기를 피하세요. RNA를 침전시키려면 1부피의 이소프로판올을 첨가하고 부드럽게 섞으세요. 실온에서 10분간 배양하고(더 높은 수율을 위해 -20°C에서 더 오래 배양) RNA를 침전시킵니다. 12,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리기로 RNA를 페릿 채취합니다.
   3. 상원액은 버리고 75% 에탄올 1mL로 페를렛을 세척합니다. 4 °C에서 7,500 × g 에서 5분간 소용돌이 및 원심분리기를 잠시 수행.
   4. RNA 용해: 에탄올 세척제를 조심스럽게 제거하고 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조시키며 완전히 건조하지 않도록 하세요. 소량의 RNase 무첨가물 또는 1개의 Tris-EDTA(TE) 버퍼에 재현탁하여 55-60 °C에서 배양하여 완전히 용해합니다. 정제된 RNA는 -80 °C에 저장합니다.
2. RiboGreen 분석법을 이용한 RNA 정량
   참고: 아래 RiboGreen 분석법은 핵산에 특이적인 형광 염료를 사용하여 자외선 흡수법보다 더 높은 감도와 특이성, 완전한 RNA를 검출할 수 있는 능력을 제공합니다. DNA 오염이 문제라면 DNase 처리를 고려하세요.
   1. TE 버퍼 1개를 준비하고, 제공된 20x TE 버퍼를 RNase 무첨가물로 20배로 희석합니다. 리보그린 작업 용액을 준비하고 빛에 민감한 염료는 호일로 보호하세요. 고범위 분석에서는 1x TE에 1:200을 희석하고(10 ng/mL-1 μg/mL), 저범위 분석(2.5 ng/mL-50 ng/mL)에서는 1:2000을 1x TE에 희석합니다. 키트의 RNA 표준을 1x TE로 연속 희석하여 예상 샘플 범위를 커버하여 RNA 표준을 준비합니다. 표준은 3부로 사용하세요.
   2. 분석의 동적 범위에 맞게 RNA 샘플을 1x TE로 희석하여 샘플을 준비합니다. 샘플을 3배로 분석하세요.
   3. RiboGreen 작업 용액과 RNA 표준 또는 샘플(예: 각각 100 μL)을 같은 양으로 추가합니다. 빛을 차단한 실온에서 2-5분간 배양하세요. 적절한 설정(여기 ~500 nm, 방출 ~525 nm)을 사용하여 형광을 측정합니다. 시약 빈 값(1x TE + RiboGreen 염료)을 측정하고 빼세요.
   4. 분석 및 정량화: 표준의 형광 값과 농도를 비교하여 표준 곡선을 그립니다. 이 곡선을 사용하여 샘플 내 RNA 농도를 결정합니다(그림 2).

4. cDNA 합성

1. 모든 부품을 얼음 위에 해동하세요. 각 튜브를 살짝 튕기며 부드럽게 섞고 사용 전에 잠시 아래로 돌려 주세요. 얼음 위에 PCR 튜브를 설치하면, 각 반응마다 다음 성분들을 결합합니다:
   RT 마스터 믹스 (5배): 4 μL
   RNA 샘플: 가변 (총 RNA 최대 1 μg 이하)
   뉴클레아제 없는 물: 총 부피 20 μL
   참고: 무주형 대조군(NTC)의 경우, RNA 샘플을 뉴클레아제가 없는 물로 대체하세요.
2. 튜브를 부드럽게 섞고 돌려 바닥에 있는 내용물을 모아 열순환기 프로그램을 실행하세요.
   프라이머 어닐링: 25 °C에서 2분
   cDNA 합성: 55 °C에서 10분 동안
   열 비활성화: 95 °C 1분 동안

5. 프라이머 설계 및 검증

참고: RTddPCR 프라이머 설계는 일반적으로 정량적 qPCR과 동일한 원리를 따르지만, 양음 방울의 명확한 분리를 위해 추가적인 주의가 필요합니다. 이 과정을 용이하게 하기 위해 NEB, IDT, 또는 ThermoFisher의 프라이머 설계 도구를 사용하세요. 성공적인 RTddPCR 분석은 높은 특이성과 견고한 증폭으로 정의되며, 증폭된 (양성)과 증폭되지 않은 (음성) 액자 사이에 뚜렷한 분리가 생성됩니다. 다음 NCBI RefSeq 가입 ID가 PCR 프라이머 설계에 사용되었습니다:

액트그레이션: NM_001127449.1
포워드 1: CAGTCTAACAGGGTGGGGGAAAG
뒷면 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAACA
앰플리콘 길이: 98
포워드 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
뒷면 2: GACTTTCCCACCCTGTTAGAC
앰플리콘 길이: 118

갭43: NM_017195.3
포워드 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
뒷면 1: GACTCCTCAGAGAGGAACAT(GACTCCTCAGAGAGAACAT)
앰플리콘 길이: 122
포워드 2: 캐그트캣트가아트트그치크
뒷면 2: CATTGCACACACACACTTGG
앰플리콘 길이: 116

1. 권장 프라이머 길이 18-30염기쌍과 GC 함량 40-60%를 가진 프라이머를 설계하세요. 용융 온도(Tm)가 55-65 °C 사이이고, 전방과 후진 프라이머가 서로 2-5 °C 이내로 떨어져 있도록 하세요. GC 클램프를 사용하고, 3피트 끝의 마지막 다섯 베이스 내에 G 또는 C 베이스 하나 또는 두 개를 넣어 결합 특이성을 높이되, G나 C의 긴 연속을 피하세요.
2. 국립생명공학정보센터(NCBI) 기본 국소 정렬 검색 도구(BLAST)와 같은 정렬 도구를 사용하여 프라이머가 의도한 표적 서열에만 결합하도록 검증합니다. 증폭자는 50-200 염기쌍 사이를 설계하며, 최적은 ~100염기쌍을 선택하세요. 짧은 산물이 증폭 효율이 높으면서도 프라이머-다이머와 구별하기 쉽기 때문입니다.
   참고: 본 연구에서는 짧은 PCR 산물이 RT-ddPCR에서 긴 PCR 산물보다 더 높은 효율로 증폭됩니다.
3. 프라이머 이합체를 최소화하려면 GC 함량이 50-60%인 프라이머를 설계하고, 2차 구조를 피하며, 3' 상보성을 유지합니다. 프라이머 검증 시에는 아가로스 겔 전기영동을 사용하고, 프라이머 이합체 평가에는 항상 무주형 대조군을 사용하세요.
4. 2차 구조가 형성될 가능성이 높은 주형 영역에 프라이머를 설계하는 것은 증폭 효율에 방해가 될 수 있으므로 피해야 합니다.

6. RTddPCR

참고: QX200 ddPCR 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 제조사 지침과 Das 등(2022)⁴³이 이전에 설명한 대로 RTddPCR을 수행하되, 재현성을 높이기 위한 몇 가지 소소한 조정을 가하십시오.

1. ddPCR 즉석 사용 범용 혼합 및 표적 특이적 프라이머를 적절한 cDNA를 사용하여 RTddPCR 반응을 준비합니다.
2. 드롭렛 생성기를 사용해 드롭을 생성하세요.
3. 말단 형광을 드롭렛 리더로 읽고, 내장 소프트웨어로 데이터를 분석하세요.
4. 정확한 정량화와 재현 가능한 비말 형성을 보장하기 위해 다음과 같은 품질 관리 조치를 적용하세요:
   1. 프라이머 세트를 같은 행이나 열에 일관되게 배치해 판 효과를 최소화하세요.
   2. 소량 피펫팅을 줄이기 위해 마스터 믹스를 준비하세요.
   3. 기포를 방지하기 위해 낮은 유량으로 피펫을 사용하고, 균일한 샘플 분사를 위해 다중 채널 피펫을 사용합니다.
   4. 방울 생성 후에는 플레이트를 조심스럽게 다루고 즉시 밀봉하여 증발을 방지하세요.
   5. 모든 반응은 얼음 위에 준비하고, 시약에 대해 반복적인 냉동-해동 과정을 피하세요.
   6. 오염 모니터링을 위해 각 프라이머 세트에 템플릿 없는 대조군을 포함하세요.
   7. 10,000개 미만의 수용 액적을 포함하는 우물은 분석에서 제외합니다.
   8. 재현성을 보장하기 위해 모든 샘플에 대해 기술적 복제를 수행하세요.
5. 액상 형광 진폭 그래프를 수동으로 점검하여 자동 임계값 측정의 정확성을 검증합니다.

Results

PLL 코팅된 1 μm 삽입물에 부착된 1차 설치류 설치류 피질 신경세포, 해마 신경세포, BFCN은 강하게 부착되어 5-7 일 동안 뇌돌을 시험관 내에서 5-7일 동안 막을 가로질러 확장됩니다. 11 DIV가 되면 배양 체계는 밀집된 네트워크를 보입니다. 성체 쥐 DRG의 경우, PLL 코팅된 3 μm 인서트에 라미닌 코팅을 추가하면 5 DIV 정도의 유사한 축삭 신장을 달성할 수 있습니다. 이러한 관찰은 삽입물이 장기적인 신경 성장을 지원하고 하류 RNA 추출을 위한 충분한 축삭 물질을 제공할 수 있음을 확인시켜 줍니다. 확장이 필요할 경우, 여러 인서트를 조합해 충분한 재료를 확보합니다.

개별 삽입물에서 추출한 TRIzol은 역전사와 이후 ddPCR에 충분한 RNA를 생성합니다. RiboGreen 정량 분석 결과, 전체 신경세포 분획에서는 RNA 수율이 일관되게 유지되고(212.85 ng/삽입물), 신경돌기 분획에서는 낮은 수율(42.75 ng/삽입물)이 나타났음을 확인했습니다(그림 2). 일반적으로 신경 세포 분획에서 약 5-7배 RNA를 얻는 반면, 신경돌 농축 분획에서는 그렇지 않습니다.

모든 프라이머는 RTddPCR 실험 전에 검증됩니다. 각 표적 전사체에 대해 최소 두 개의 프라이머 세트를 주문하여 동일한 신경 샘플에서 생성된 cDNA에 대한 기존 PCR을 사용해 검사합니다. 가장 강하고 특이적인 밴드를 생성하는 프라이머 쌍이 RTddPCR에 선택됩니다(그림 3A). 예를 들어, Gap43의 프라이머 세트 1을 선택했습니다. Actγ와 같이 모호한 결과가 있는 경우, 어닐링 온도를 최적화하기 위해 구배 PCR을 수행합니다(그림 3B). 이로 인해 절대 정량화에는 잘 검증된 프라이머만 사용되어 액적 분리 시 아티팩트 발생 가능성을 줄입니다.

긁고 면봉 채취 시술을 통해 체성 구획과 신경성 구획을 신뢰성 있게 분리합니다. 전체 신경 세포에서 분리된 RNA는 Actγ 46,47,48,49와 같은 전사체의 풍부함을 보인다(그림 4). 반면, 축삭/신경돌기 분획은 제한된 부피와 일치하여 총 RNA 수치가 현저히 낮지만, Gap43과 같은 원거리 돌기로 국소화되는 전사체의 풍부화를 보입니다(그림 4). 소모 제한 전사체의 최소한의 교차 검출은 삽입물을 신중하게 다루고 최적의 밀도로 플레이트를 부착할 때 구획 순도가 높음을 나타냅니다.

긍정적인 결과는 다음과 같은 점이 특징입니다: (1) 명확한 축삭 연장을 가진 온전한 신경 형태, (2) 막 파열 없이 구획의 깔끔한 분리, (3) 양과 음의 비말 간 뚜렷한 분리를 만드는 검증된 프라이머, (4) 축삭 전사체에 대한 강한 RTddPCR 신호. 최적의 실험은 낮은 RNA 수율, 신경돌기 분획 내 소마 마커로 나타나는 교차 오염, 또는 프라이머 이합체화로 인한 방울 '비' 증가와 같은 RTddPCR 인공물을 초래합니다. 이러한 문제들은 주로 삽입막 손상, 과도한 긁힘, 또는 프라이머 어닐링 온도 최적화 부족과 관련이 있습니다.

그림 1: 막 삽입물을 이용한 구획 특이적 RNA 분리 개요. 설치류 뉴런은 1-3 μm 크기의 반투과성 삽입물에서 배양되었으며, 이는 신경돌 확장을 허용하면서 소모를 제한합니다. 전체 신경세포 준비를 위해 상부 구획의 세포를 멸균 세포 스크레이퍼로 긁어내어 펠릿으로 제거한 후 TRIzol에 용해하여 RNA 분리, cDNA 합성, RTddPCR을 진행했습니다. 잔여 세포 찌질은 멸균 면봉으로 삽입막에서 제거되었습니다. 신경돌 준비를 위해 신경돌기만 포함된 삽입막을 뒤집어 메스로 절단한 후 TRIzol에 직접 담근 후 RNA 분리, cDNA 합성, RTddPCR을 시행했습니다. 이 그림의 확대판을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: RiboGreen 분석법을 이용한 표준 RNA 농도 곡선. (A) 희석 RNA 표준 연속에서 RiboGreen RNA 정량 분석법을 사용하여 형광 강도를 측정하였습니다. 선형 회귀 분석 결과, RNA 농도와 형광 신호 사이에 강한 상관관계가 있음이 밝혀졌습니다(R² = 0.9956). R² 값이 1에 가까운 것은 RiboGreen 분석법이 RNA 정량을 정확히 수행하는 데 있어 우수한 선형성과 신뢰성을 보여줍니다. (B) A에서 얻은 기울기의 방정식 (y=19.738x + 14.905)을 사용하여 각 분획에 대해 총 RNA를 계산했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 이용한 프라이머 검증. (A) Actγ 와 Gap43 을 위한 cDNA를 이용한 PCR 증폭 산물을 2% 아가로스 겔에서 분리하여 프라이머 특이성을 평가하였다. 각 유전자에 대해 두 개의 독립적인 프라이머 세트(세트 1과 세트 2)가 검사되었습니다. DNA 크기 마커(사다리)는 분자량(10 kb, 0.5 kb, 0.1 kb)이 표시된 인접 레인에 표시됩니다. 예상 크기의 단일 밴드가 선택된 프라이머 세트의 성공적인 증폭과 특이성을 확인시켜 줍니다. (B) PCR 증폭은 온도 구배(55-65 °C)를 따라 Actγ 프라이머 세트 2를 사용하여 최적의 어닐링 온도를 결정하였습니다. 증폭된 산물은 DNA 사다리(레인 2, 크기 표시)와 함께 2% 아가로스 젤에서 분리되었습니다. 시험 범위 전역에서 예상 크기의 단일 밴드가 일관되게 관찰되었으며, 가장 강한 증폭은 55 °C에서 감지되어 이 프라이머 세트에 최적의 온도임을 시사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 선택된 전사체의 RTddPCR 분석 및 mRNA 복사본의 정량화. (A,B) 액트γ와 (B) Gap43의 방울 분리를 보여주는 대표적인 1차원 진폭 플롯. 각 점은 단일 방울을 나타내며, 파란색 방울은 양의 증폭을, 회색 방울은 음의 증폭을 나타냅니다. Y축은 진폭을, X축은 ddPCR 플레이트의 웰 위치를 나타냅니다. 양성(파란색)과 음수(회색) 방울의 명확한 분리는 표시된 프라이머 세트로 표적 전사체의 견고한 검출을 확인시켜 줍니다. (C) 전체 뉴런 및 신경돌 분획에서 Actγ 및 Gap43 전사체의 총 RNA 복사본/μL 및 ng당 복사본 수를 요약한 표. 복제수 추정은 ddPCR 방울 수(패널 A, B에 표시됨)를 이용한 절대 정량화를 통해 얻어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

재현성에는 여러 단계가 중요합니다. 인서트 코팅은 신경 부착을 촉진하기 위해 균일해야 하며; 불완전한 코팅은 신경돌기/축삭 성장을 방해합니다. 세포 플레이트 밀도도 똑같이 중요한데, 과도한 밀도는 수상돌기 교차를 증가시키고, 드문드문 플레이트는 축삭 RNA가 부족하기 때문입니다. 긁기-면봉 검사 과정은 정밀하게 수행되어야 합니다: 압력이 너무 낮으면 체성 오염이 생기고, 압력이 너무 높으면 삽입물이 손상될 위험이 있습니다.

프라이머 검증은 또 다른 중요한 단계입니다. 각 전사체마다 두 개의 독립적인 프라이머 세트를 실행하면 가장 신뢰할 수 있는 쌍을 선택할 수 있으며, 구배 PCR은 어닐링 온도를 더욱 정밀하게 조정할 수 있습니다. 이 방법은 프라이머-다이머 형성을 줄이고, 액적의 투명도를 높이며, 생물학적 복제 전반에 걸쳐 재현 가능한 정량을 보장합니다. 이 접근법은 높은 구획 순도를 달성하지만, 체세포 물질에서 발생하는 미량 오염을 완전히 배제할 수는 없습니다. 축삭 RNA 수율은 본질적으로 낮아 전체 전사체 시퀀싱과 같이 많은 입력이 필요한 분석 범위를 제한합니다. 이 방법의 치명적인 한계는 원위 축삭과 근위 축삭 내 전사체 위치를 다룰 수 없다는 점입니다. 특정 조건에서 막 구멍을 통한 교세포 또는 내피 확장이 보고된 바 있지만, 우리 배양 시스템은 이 가능성을 최소화합니다. 성인 DRG 배양에서는 사이토신 β-D-아라비노푸라노사이드(Ara-C^)5,7의 첨가와 피질, 해마, BFCNs5에 혈청 없는 배지를 사용하는 것이 교세포 및 내피세포 증식^{을 효과적으로 제한}합니다. 또한, 여기서 사용되는 단성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PC/PET) 막은 비탄성이며 활성 세포 이동에 허용되지 않습니다. 또한, DRG 배양에는 3 μm 기공 크기 삽입물을 사용하여 대구경 축삭의 통과를 가능하게 합니다. 반면, 피질 또는 BFCN 배양에서는 1 μm 크기의 공로 크기 삽입물을 사용하여 교세포의 이동을 더욱 제한합니다. 이러한 특성은 유연한 기공을 통한 내피 이동을 지원하는 PDMS 기반 마이크로장치와 우리의 세팅을 구별합니다. 이전 보고서 ^34,35,36,40과 일치하여, 본 연구의 분자 검증은 축삭 전사체(예: Gap43)의 강한 농축과 체세포 표지자(예: Actγ)의 검출이 거의 없음을 확인하여 막을 통과하는 물질의 신경 특이성을 뒷받침합니다. 물리적 제약이 교세포 이동을 완전히 없애지는 못하므로, 연구자들은 Gfap 역시 부정적 지표로 사용해야 합니다.

마이크로플루이딕 장치와 비교할 때, 인서트 시스템은 더 단순하고 확장 가능하며 일상적인 배양 워크플로우와 호환됩니다. 특수 장비를 피하면서도 재현 가능한 축삭-체세포 분리를 가능하게 합니다. 삽입물과 RTddPCR을 결합함으로써 접근성과 높은 감도를 제공하여, qPCR 검출 임계값 이하인 전사체를 절대적으로 정량할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 축삭 전사체 위치 변화 탐구, 발달, 신경독성 또는 손상 자극에 대한 국소 번역 평가, 신경퇴행성 질환 또는 신경발달 장애와 관련된 RNA 수송 결함 연구에 적합합니다. 향후 개선에는 다중 mRNA의 동시 정량을 위한 다중화 RTddPCR이나, 저입력 RNA 시퀀싱 접근법과의 통합을 통한 전사체 커버리지를 확장하는 것이 포함될 수 있습니다. 또한, 이 시스템을 인간 iPSC 유래 뉴런에 맞게 적용하면 질병 모델링 및 재생 연구에도 적용이 확장될 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6웰 플레이트용 세포 배양 삽입물, 1.0  μ m 모공 크기, 불임	코닝	353102	소모품
6-웰 플레이트용 세포 배양 삽입물, 3.0  μ m 모공 크기, 불임	셀트리트	230603	소모품
좁은 칼날의 셀 리프터	VWR	76036-006	소모품
CELLSTAR 6-웰 조직 배양 플레이트	VWR	82050-842	소모품
ddPCR 96-웰 플레이트	바이오 라디	12001925	소모품
ddPCR 드롭렛 리더 오일	바이오 라디	1863004	시약
QX200/QX100 드롭렛 제너레이터용 DG8 카트리지	바이오 라디	1864008	소모품
라미닌	깁코/피셔 사이언티브	23017-015	시약
루나스크립트 RT 슈퍼믹스 키트	NEB	E3010L	시약
형광 기반, 96웰, 검은색용 마이크로플레이트	써모피셔	M33089	소모품
PCR 플레이트 히트 씰, 호일, 피어싱 가능	바이오 라디	1814040	소모품
폴리-라이신	시그마	P1274	시약
PTC 템포 96 열 사이클러	바이오 라디	12015382	장비
QuantaSoft 소프트웨어	바이오-래드		PCR 데이터 분석 소프트웨어
Quant-it 리보그린 시약 및 RNA 분석 키트	써모피셔	R11490	시약
QX200 ddPCR 에바그린 슈퍼믹스	바이오 라디	1864034	시약
에바그린용 QX200 방울 생성 오일	바이오 라디	1864005	시약
QX200 액적 발생기	바이오 라디	17005227	장비
QX200 드롭렛 리더	바이오 라디	17005228	장비
트리졸 시약	인비트로젠	15-596-026	시약