쥐의 전층 피부 상처 치유를 강화하는 유연한 전자기 코일 패치

요약

이 프로토콜은 유연한 구리 코일패치를 이용해 쥐에게 전층 원형 피부 상처를 만들고 치유를 촉진하는 방법을 시연합니다. 이 패치는 전자기장을 전달합니다.

초록

만성 및 큰 피부 상처는 치유 지연과 높은 감염 위험으로 인해 상당한 임상적 도전을 제공합니다. 펄스 전자기장(PEMF) 치료는 비침습적 접근법으로 조직 수리를 촉진할 수 있습니다. 본 연구는 유연한 인쇄 구리 코일 패치를 맞춤형 PCB 컨트롤러에 연결하여 전층 등쪽 상처에 국소 PEMF 자극을 전달하는 재현 가능한 쥐 상처 모델 프로토콜을 설명합니다. 반대쪽 상처는 치료받지 않은 대조군 역할을 했습니다. 치유 진행 상황은 정기적인 사진 촬영과 상처 부위 측정을 통해 평가하였다. 프로토콜은 다양한 상태에서 생 체 내 PEMF 기반 치료를 평가하고 최적화하기 위한 실용적이고 유연한 시스템을 제공하며, 재생 의학의 국지적 적용과 매개변수 조정에 중점을 둡니다. 매개변수 선택은 0.25-1.3 mT, 10-40 Hz, 하루 30-90분을 측정한 직교 CCK-8 섬유아세포 증식 스크린을 기반으로 하였으며; 주효과 분석 결과 1.3 mT, 30 Hz, 60분/일 최적 수준이 확인되어 생체 내 검사에 채택되었습니다.

서론

만성 피부 상처(예: 당뇨병성 궤양)는 점점 더 심각한 건강 문제로 이어지며, 종종 치유 장애, 감염, 절단으로 이어집니다¹. 전통적인 치료는 시간이 오래 걸리고 비용이 많이 들 수 있어, 조직 회복을 가속화할 수 있는 보조 요법에 대한 관심이 높아집니다². 전자기장 치료는 비침습적이며 전임상 및 임상 환경에서 치유 촉진 효과를 입증한 방법 중 하나입니다 2,3,4,5. 극저주파(~1-100 Hz) 범위의 펄스 전자기장(PEMF)은 혈관 신생과 성장인자 방출 등 수리에 중요한 세포 과정을 자극할 수 있습니다^.

예를 들어, PEMF 노출은 당뇨병 및 건강한 설치류에서 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2)를 상향 조절하고 혈관신생⁸을 증가시켜 상처 봉합을 유의미하게 가속화했습니다. 마찬가지로, 치유 장애 모델(예: 당뇨병 쥐)에서는 PEMF 치료가 치유율을 높이고 새로 형성된 조직의 인장 강도를 증가시키는 것으로 나타났습니다^. 임상적으로 PEMF 치료는 만성 상처 환자에서 연구되어 왔습니다. 당뇨병성 족부 궤양 환자를 대상으로 한 무작위 임상시험에서는 PEMF 노출 시 미세순환 혈류가 증가하고 상처 봉합이 빨라지는 경향이 보고되었습니다¹⁰. 일반적으로 PEMF는 다른 상처 유형에서도 유익한 효과를 보여주었는데, 예를 들어 펄스 자기장으로 치료된 화상 상처에서 치유 개선이 관찰되었다¹¹. 이 연구들은 전자기 자극이 상처 치료를 위한 보완 치료로서 잠재력을 강조합니다 8,9,10,11.

기존 유선 자극기와 비교할 때, 자기 작동은 경피적 커넥터가 필요 없고 하드웨어 관련 합병증 위험을 줄여줍니다. 무선 자기 시스템은 다른 맥락에서도 조직 특이적 자극을 달성했는데, 예를 들어 전도성 신경 유도 도관은 교류 자기장 하에서 유도 미세전류를 생성할 수 있으며, 전류 진폭은 자기장^{매개변수 12}에 의해 간접적으로 결정됩니다. 자기 전략은 혈관 형성을 지원할 수도 있는데, 이는 피부 치유의 중요한 병목 현상으로, 정적 또는 동적 자기장이 단독으로 또는 자기 반응성 생체재료와 결합되어 내피 행동과 혈관 생성 신호를 조절하는 것으로 입증되었기 때문입니다¹³. 이러한 선례들은 착용형 접근법 개발에 동기를 부여했는데, 이는 상처 베드에 PEMF를 집중시키면서 비침습성과 외부 프로그래밍 가능성을 유지하는 맞춤형 분리형 코일 패치입니다^12,13. 다음 프로토콜에서는 쥐 전층 상처 모델에서 이 PEMF 치료를 적용하는 단계, 장치 적용, 자극 요법, 결과 평가를 자세히 설명합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 강남대학교(JN) 기관동물 관리 및 이용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 번호 2025-0630S0360-915[408]). 우리는 수컷 SD 쥐(6-8주, 약 200-250g)를 사용해 프로토콜을 시행했습니다. 실험 이전에는 쥐를 개별적으로 방양하여 자유롭게 음식과 물을 공급했으며, 12시간의 밝고 어두운 주기로 실험실 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 유지되었습니다.

1. 전층 절제 상처의 생성

1. 동물과 수술 필드를 준비하세요.
   1. 유도 챔버에서 3-4% 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 교정 반사가 사라진 후에는 코 콘을 통해 마취 ~2%를 유지하세요.
   2. 쥐를 멸균된 수술 표면 위에 엎드린 자세로 눕히세요. 전동 클리퍼를 사용해 등쪽 흉부 부위(어깨뼈부터 요추 중간 부위, 옆구리 포함)를 면도하세요.
   3. 참고: 수술적 접근과 코일 배치가 명확하도록 중앙선 양쪽 최소 5× 5cm 이상의 털을 제거하세요.
   4. 면도한 부위를 70% 에탄올로 소독한 후 아이오도포르 용액을 사용하세요. 에탄올/요오드 스크럽을 세 번 반복해서 마지막에 요오드로 마무리합니다.
   5. 수술 부위를 멸균 거즈로 덮고, 계획된 상처 부위만 노출시키세요.
2. 양측 전층 절제 상처를 만듭니다.
   1. 멸균 수술용 마커를 사용해 등쪽 옆구리에 지름 2cm의 원형 두 개를 그려 앞다리 뒤쪽 중앙선 양쪽에 각각 하나씩 위치시킵니다.
      참고: 두 원이 크기가 같고 대칭적으로 배치되어 동물 내 비교가 가능하도록^14,15.
   2. 멸균 가위나 메스로 표시된 원형 피부 부위를 절제하세요. 표피, 진피, 그리고 판니쿨루스 카르노수스를 제거하여 전층 상처(~3.14 cm²)를 만듭니다.
   3. 멸균 거즈로 부드럽게 압박하여 지혈을 달성하세요. 같은 기법으로 반대쪽 옆구리에 동일한 2cm 상처를 만듭니다.
      참고: 상처 침대는 노출된 근막이나 근육으로 구성되어야 하며, 잔여 진피가 없어야 합니다.
   4. 상처 생성 직후 즉시 진통을 투여하세요(예: 리도카인 4 mg/kg 피하 투여).
3. 실험 그룹을 배정하세요.
   1. 한 상처는 PEMF 치료를 받고 반대쪽 상처가 대조군으로 사용되는 피험자 내 설계를 사용한다.
   2. 장치 존재를 제어하기 위해 별도의 코호트가 가짜 장치(동일한 비전원 코일)를 받는 것을 포함하세요.
   3. 전자기 효과와 취급 또는 드레싱 효과를 구분하기 위해 처리되지 않거나 가짜 처리된 통제를 유지하세요.

2. PEMF 장치의 적용

1. 상처를 치료하고 코일을 위치시키세요.
   1. PEMF 치료가 지정된 상처 위에 멸균 얇은 거즈나 반투과성 막을 직접 덮어주세요. 상처 부위를 완전히 덮어야 합니다.
   2. 유연한 구리 코일 패치를 드레싱된 상처 위에 위치시킵니다(그림 1). 코일을 중심에 맞춰 상처가 코일 중앙 아래에 위치하도록 하세요.
      참고: 코일 직경(~5 cm)은 상처 가장자리를 넘어 확장될 수 있습니다; 상처가 유효 자기장 구역 내에 머무르도록 하세요.
2. 코일을 고정하세요.
   1. 코일을 의료용 접착 테이프로 몸통에 부드럽게 감아 고정하세요. 코일과 드레싱 사이에 흉부를 압박하지 않고 밀착 상태를 유지하세요.
   2. 필요하다면 위치 안정을 위해 코일 위에 유연한 알루미늄 스트립을 덮어도 됩니다. 호흡이나 국소 혈류를 제한하지 마세요.
   3. 납선을 몸체에서 멀리(예: 머리 쪽) 멀리 배치하여 엉킴을 방지하세요.
3. PEMF 자극을 투여하세요.
   1. 코일을 PCB 컨트롤러에 연결하고 장치를 활성화하세요 (그림 2). 자극 매개변수를 30Hz 주파수와 ~1.3 mT 자기장 강도로 설정하여 하루 60분간 진행합니다.
   2. 매일 같은 시간(±1시간)에 자극 세션을 수행하여 일정한 간격을 유지하세요.
      참고: 이 매개변수들은 직교 CCK-8 스크리닝(0.25-1.3 mT, 10-40 Hz, 하루 30-90분, 표 1)을 기반으로 선택하여 1.3 mT, 30 Hz, 60분을 최적으로 확인했습니다(표 2).
   3. 동일한 비활성 코일을 통제 상처 위에 1시간 동안 씌워 가짜 치료를 하세요. 혼동을 피하기 위해 가짜 코일을 명확히 표시하세요.
4. 장치를 제거하고 상처를 검사하세요.
   1. 60분 후에 컨트롤러를 끄세요. 코일과 접착제를 조심스럽게 제거하세요.
   2. 상처 부혈, 부종, 부작용 여부를 점검하세요. 필요하다면 멸균 거즈를 교체하세요.
      참고: 코일 표면 온도는 1시간 자극 동안 주변 온도에 가깝게 유지됩니다; 유의미한 가열은 관찰되지 않았다.
5. 치료 후 관리를 제공합니다.
   1. 자기 피해를 막기 위해 엘리자베스 시대 목걸이를 착용하세요. 호흡이나 수유에 지장을 주지 않으면서 적절한 착용감을 확보하세요.
   2. 뒷다리에 가볍게 거즈를 감아 등 상처의 긁힘을 줄이세요.
   3. 쥐가 마취에서 완전히 회복될 때까지 관찰하세요. 진통을 계속 복용하세요(예: 리도카인 4 mg/kg을 12시간마다 2-3일간 또는 기관 프로토콜에 따라 투여).
   4. 연구 기간 동안(예: 14일) 매일 PEMF 치료를 반복합니다.

3. 상처 모니터링 및 데이터 수집

1. 상처 영상을 촬영하세요.
   1. 부상 후 0일, 3일, 7일, 10일, 14일의 상처 사진. 필요하다면 동물에게 가벼운 마취를 하여 움직임을 막으세요.
   2. 각 이미지에 측정 눈금을 포함시키고, 카메라를 상처에 수직으로 고정된 거리^14,15에 위치시키세요.
2. 상처 부위를 측정하세요.
   1. ImageJ에서 참조 자를 사용해 이미지 스케일을 보정합니다. 상처 가장자리를 따라 이동해 면적을 mm² 단위로 계산하세요.
   2. 각 시점에서 상처 면적을 기록하고 기준선 대비 상처 폐쇄 비율을 계산합니다.
   3. PEMF 치료 및 통제 상처를 정량적으로 비교하세요.
3. 조직학을 위해 조직 채취(선택 사항).
   1. IACUC가 승인한 절차에 따라 실험 종료점에서 동물을 안락사시키십시오.
   2. 상처 조직 샘플을 절제하고 포르말린을 고정하여 조직학적 처리를 수행합니다.
   3. 콜라겐 침착, 재상피화, 혈관 신생을 평가하기 위해 파라핀 삽입 및 염색(예: H&E, Masson's trichrome)을 수행하세요^13,16.

4. 데이터 분석 및 해석

1. 상처 닫힘 곡선을 생성하세요.
   1. 각 그룹의 시간에 따른 상처 폐쇄 비율을 그래프로 분석합니다.
   2. 치유 속도와 미리 정해진 폐쇄 임계값까지의 시간을 계산하세요.
2. 통계 분석을 수행하세요.
   1. 모든 동물의 상처 부적 데이터를 수집하고 각 시점의 평균 ± SD를 계산합니다.
   2. 정규성(샤피로-윌크 검정)과 분산의 동질성을 확인한다(레빈 검정).
   3. "치료"와 "시간"이라는 요소를 포함한 양방향 ANOVA를 사용하여 차이를 분석합니다. 유의미한 상호작용이 감지되면 Tukey's 사후 검사를 수행하세요.
   4. 통계적 유의성을 *p < 0.05, **p < 0.01로 정의합니다.

결과

이 전층 쥐 상처 모델에서 유연한 코일 패치를 통한 일일 PEMF 치료는 대조군에 비해 상처 봉합 속도가 유의미하게 빨라졌습니다. 효과를 엄밀히 평가하기 위해, 쥐들은 프로토콜 섹션에서 제시한 실험 설계에 따라 세 그룹으로 배정되었습니다: 피험자 내 대조군(각 쥐는 PEMF 치료 상처 1개와 반대쪽 치료받지 않은 상처 1개, 분석을 위해 데이터를 통합), 가짜 대조군(PATCH: 전원이 없는 코일로 덮인 상처), 그리고 치료되지 않은 대조군(CTRL: 표준 상처 치료만 가능합니다). 그림 1, 그림 2, 그림 3 은 14일간의 상처 치유 진행 과정을 이들 그룹에 걸쳐 보여줍니다. 0일 시점에 쌍 상처 크기가 두 그룹 모두 동일하여 초기 상태가 일관됨을 확인하였다. 3일째 시점에 대조군과 PEMF 그룹 모두 상...

토론

중요한 단계로는 대칭적인 전층 상처를 만들고, 코일 패치가 틈 없이 멸균 장벽 위에 평평하게 놓이도록 하며, 일일 노출을 일정하게 유지하는 것이 포함됩니다; 편차는 필드 전달을 줄이고 치유 결과의 변동성을 증가시킬 수 있습니다.

이 연구는 연구 결과를 해석하고 번역 잠재력을 평가할 때 고려해야 할 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 이 프로토콜은 급성 절제 상처를 가진 건강한 수컷 SD 쥐(6-8주, 200-250g)에서 입증되었으므로, 당뇨병, 허혈, 감염, 노화, 면역억제 등 임상적으로 손상된 치유 환경을 완전히 포착하지 못했습니다. 또한, 단일 PEMF 매개변수 세트(1.3 mT, 30 Hz, 60분/일)만 생 체 내에서 평가되었으며, 이 요법은 시험관 내 섬유아세포 증식 스크리닝을 기반으로 선택되었습니다; 최적의 투여량은 종, 상처 유형과 깊이, 드레싱 또는 장벽 두께, 그리고 표적...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 세포 배양 플레이트	바이디	H908002	CCK-8 분석에 대해
ADHDESION 현미경 슬라이드	그리고 nbsp; 치토테스토	P/N.80312-3161	장비는... H& E/Masson 염색
진통제(리도카인 하이드로클로라이드 주사)	후아무	70011657	오피오이드 진통제, 4 mg/kg (통증 조절용)
마취기	RWD 라이프 사이언스 (선전, CN)	R520-ISO	산소 공급이 가능한 이소플루란 증기
자동 면역조직화학 염색기	라이카	21.2201	그리고 nbsp; 자동 면역조직화학 염색
생검 펀치 (20mm)	인테그라 밀텍스	#33-37	원형 피부 펀치, 직경 2cm
카메라, 디지털	화웨이 메이트 70 프로	해당 없음	≥ 상처 영상 촬영을 위한 12 MP
CD31 항체	앱캠	ab182981	IHC의 내피 마커 (그림 4B)
CD34 항체	앱캠	AB81289	IHC의 내피 마커 (그림 4B)
세포 계수 키트-8 (CCK-8)	바이오샤프	BS350B	시험관 내 PEMF 매개변수 스크리닝(OD450)에 사용됨
세포 배양 접시 (10cm)	바이디	H802004	섬유아세포 배양을 위한 10 cm (100 mm) 조직 배양 접시;
세포 배양 배지 (예: DMEM + FBS)	바이디	L100-500	CCK-8 스크린에서 섬유아세포 배양을 위한 검사
CO2 인큐베이터	열학	BB150-2TCS-L	섬유아세포 배양을 위해
코일, 유연한 구리	맞춤 제작(사내 제작)	해당 없음	나선형 인쇄 코일 (직경 5cm, 폴리이미드)
제어판 (PEMF 발전기)	맞춤 제작(자체 설계)	해당 없음	커스텀 PCB, 코일을 30Hz, ~1.3 mT 구동
전기 헤어 클리퍼	Wahl 또는 Oster (반려동물 미용)	모델 9160	동물 털 면도용 미용 이발기
엘리자베스 시대 목걸이 (설치류)	뮤케바이오	MK-EC-01	상처 간섭 방지
임베딩 스테이션	에프레디아 히스토스타	A81000002	조직학 처리 (시행 시)
그리고 nbsp; 마스크	베뎅	V531596	마취 유지
섬유아세포 (세포주 L929)	프로셀	CL-0137	CCK-8 증식 선별에 사용되는 세포
유한 요소 시뮬레이션 소프트웨어(예: COMSOL Multiphysics)	컴솔	CM010004	자기장 시뮬레이션 (그림 5B-C)
유연한 알루미늄 스트립 스플린트	디아고	1592	코일 변위 방지를 위한 지지
겸자	마제스틱	01625	수술 중 피부와 드레싱을 다루기 위해
헤마톡실린 & 이오신 (H& E) 자동 염색 및 밀봉 유니	DRS-프리즈마-P+필름	61770249	일상적인 조직학 염색을 위한 소모품
이미지 분석 소프트웨어	국립보건원(NIH)	버전 1.54	상처 면적 측정(예: ImageJ)
이미지 분석 소프트웨어	국립보건원(NIH)	버전 1.54	상처 면적 측정(예: ImageJ)
유도실	RWD 라이프 사이언스 (선전, CN)	802-00132-00	이소플루란 마취 유도
적외선 열화상 카메라	히크마이크로	H11	코일 표면 온도 모니터링 (그림 5A)
요오드 포비돈 소독제 10%	하이노트	해당 없음	피부 소독제(요오도포르)
이소플루란	RWD 라이프 사이언스 (선전, CN)	20037015	흡입 마취제(USP 등급)
리도카인 주사 10%	산마	해당 없음	수술 후 진통을 위해
매송의 트리크롬 스테인 키트	바소	C250202	콜라겐/ECM 시각화용 소모품
의료용 피부 마커 및 자	톤다우스	해당 없음	상처 사진에 비늘을 포함하세요
마이크로플레이트 리더	열학	A51119500C	CCK-8 분석법에서 OD450 측정을 위한
미세토름	에프레디아 HM 340E	23900670	조직학/IHC를 위한 절절 절단 (시행 시)
폴리포름알데히드 조직 고정제	공유-소개	SB-C009	동물 조직 표본의 고정
쥐 사육 우리	펑차오	CP-JM	개별 사육용 표준 쥐 사육 케이지입니다.
랫츠, 스프래그 도울리 (남성, 6– 8주)	위경위 쑤저우	SCXK2024-0004	200– 250g; 개별 거주; IACUC 승인 사용
메스	진환	35W0602	절제 상처 생성을 위한 목적
반투과성 필름 드레싱	ZD	Q20189	대체 상처 차단 방법
통계 분석 소프트웨어(예: GraphPad Prism 또는 R)	소프트웨어 마케이브	10.6.9(890)	양측 ANOVA 및 사후 다중 비교
멸균 거즈	ZD	3141626	상처 드레싱/보호 장벽
멸균 수술용 커튼	ZD	V271617	피부 준비 후 수술 부위를 드레이핑하기
외과용 가위	마제스틱	01627	절제 상처 생성을 위한 목적
주사기와 바늘	미난크	20193141643	피하 진통 투여를 위해
전체 슬라이드 스캐너	3 DHISTECH	해당 없음	디지털 슬라이드 스캔