이 방법은 3D 프린팅 챔버와 실험실에서 제작한 실리콘 막을 통합한 시험관 내 진드기 혈액 공급 시스템 개발을 개략적으로 설명합니다. 이 시스템은 진드기 인공 먹이를 가능하게 하여 다양한 먹이 단계에서 쉽게 샘플링할 수 있고, 혈액량도 적어 이조디드 진드기 연구에 매우 유용한 도구가 됩니다.
이 논문에서
요약
초록
이 연구는 고해상도 광고분자 수지로 만든 3D 프린팅 챔버를 이용한 인공 실리콘 막을 통한 진드기 먹이 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 먹이 챔버 설계, 실리콘 막 준비, 시스템 조립, 그리고 진드기 먹이를 위한 최적의 조건을 포함합니다. 진드기는 미국과 전 세계에서 질병의 주요 매개체 중 하나입니다. 진드기 연구는 진드기 매개 질병을 예방하고 감소시키는 효과적인 전략을 개발하는 데 필수적입니다. 의무적인 흡혈성 외부 기생충인 진드기는 생존을 위해 혈액을 먹어야 하며, 따라서 질병을 전파하기 위해 혈액 공급은 매개체-숙주 상호작용, 병원체 전파, 진드기의 생물학, 생리학, 해부학적 형태를 연구할 때 근본적인 과정입니다. 실리콘 막을 가진 진드기 먹이 시스템은 지난 수십 년간 널리 사용되고 발전해 왔습니다. 하지만 많은 기존 시스템은 단일 진드기 종, 생활 단계, 특정 조건에 맞춰 맞춤 설계되어 있습니다. 이 프로토콜에서 설명된 진드기 먹이 시스템은 Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus 성충 등 미국에서 가장 중요한 진드기 매개체 종들로부터 부분적으로 먹이는 개체와 완전히 부풀린 개체를 모두 얻는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 시스템은 Dermacentor variabilis 성충과 약충 A. americanum의 먹이를 시작하는 데 성공했으며, 성충 A. americanum에서 가장 높은 먹이 비율(>85%)이 관찰되었습니다. 따라서 본 연구에서 개발된 급식실은 100 μL까지 다양한 혈액 양의 저용량 혈액에 적응할 수 있어 병원체 전파 및 독성학 연구에 매우 중요합니다. 투명한 뚜껑과 방의 높이가 최소화되어 진드기 먹이 시간 동안 진드기 관찰이 용이했습니다.
서론
진드기는 필수적인 혈액 섭취 외부 기생충으로, 박테리아, 바이러스, 전 세계 동물과 인간에게 질병을 일으키는 기생충 등 다양한 병원체를 운반하고 전파할 수 있습니다. 미국에서 1위 질병 매개체이며, 전 세계 모기에 이어 2,3,5, 여러 진드기 종이 병원체 관련 질병을 전파할 수 있으며, 다른 종들은 알파-갈 증후군(AGS, 붉은 고기 알레르기라고도 함)과 같은 비전염성 질환을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이는 최근 몇 년간 전 세계적으로 점점 더 보고되고 있습니다. 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. 진드기 생물학, 생리학, 유전학, 매개체 역량을 이해하는 연구는 전염성 및 비전염성 진드기 매개 질병의 경제적·공중보건적 부담을 줄이기 위한 전략 개발에 필수적입니다. 진드기-숙주 상호작용을 연구하려면 특정 연구 질문을 해결하기 위해 부분적으로 먹이거나 완전히 부풀린 진드기가 필요합니다. 이는 살아있는 동물 먹이를 통해 진드기가 전체 생애 주기를 마칠 수 있도록 할 수 있습니다17. 진드기 먹이를 위해 살아있는 동물을 사용하는 것은 진드기 집단 형성과 유지에 매우 효과적이지만, 숙주 가용성 제한과 시설 규정 때문에 구현이 어려울 수 있고 모든 연구 가설에 적용되지는 않을 수 있습니다. 무엇보다도, 시험관 내 진드기 먹이 시스템의 성공적인 도입은 "동물 이용 대안(3Rs)" 프레임워크(대체, 감소, 정제) 하에서 중요한 목표인 생체 동물 사용을 줄이는 데 도움이 된다는 점입니다20.
인공 막 진드기 먹이 시스템을 연구에서 사용하는 것은 다양한 과학적 질문을 다룰 수 있는 다양한 기회를 제공합니다. 이들은 크게 세 그룹으로 요약할 수 있습니다; (1) 먹이 중 진드기 알파-갤 생성과 같은 다양한 혈액원을 이용한 숙주 혈액 변이 및 매개체-숙주 상호작용에 미치는 영향평가, (2) 혈액과 함께 화합물을 전달하는 아카리사이드 독성 평가22 및 흡혈 중 진드기 분비 화합물 회수23, (3) 혈액 공급을 통한 병원체 전달을 통한 벡터 역량 평가24, 25, 26, 27 등 여러 명이 있습니다. 더불어, 인공 막 급식 시스템의 특성상 숙주 관련 변이 없이 다양한 처리와 농도를 소규모 및 대량으로 시험할 수 있어 살아있는 동물의 필요성을 줄입니다.
인공 막을 통한 진드기 먹이 시스템은 연구에 널리 사용되어 왔으며, 진드기 군집 사육을 지원하는 데 19,28,29, 경우에 따라 진드기의 긴생애 주기 완성을 가능하게 합니다. 진드기 먹이 시스템과 그 재료의 최적화에 관한 많은 프로토콜이 다양한 진드기 종(32, 33, 34)에 대해 보고되었습니다. 그럼에도 불구하고, 시험관 내 진드기 먹이는 시스템 조건, 사용된 재료, 그리고 무엇보다도 진드기 종과 단계에 따라 매우 다양할 수 있다는 것은 잘알려져 있습니다. 더불어, 연속 유량 시스템27과 같이 많은 시스템이 대량의 혈액에 의존하는데, 이는 매우 효과적이지만 상당한 혈액량이 필요해 비용이 많이 들 수 있습니다. 이 프로토콜은 미국 내 다섯 종의 서로 다른 진드기 질병 매개체 성충 단계에서 성공적으로 작동하는 인공 막 진드기 먹이 시스템을 상세히 설명합니다. 여기에는 Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus, 그리고 Dermacentor variabilis가 포함됩니다.
프로토콜
진드기 먹이 실험은 상업적으로 구할 수 있는 제세동기 소 혈액(Hemostat Laboratories, CA, USA)과 제세동기 인간 혈액(Bioivt, CA, USA)을 사용하여 수행되었으며, 이 혈액은 기관동물관리 및 사용 위원회(IACUC)와 기관 검토 위원회(IRB)가 승인한 프로토콜과 지침에 따라 혈액을 수집하고 처리합니다. 이 연구에서는 진드기 먹이에 살아있는 척추동물을 사용하지 않았습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 진드기는 오클라호마 주립대학교 진드기 사육 시설에서 구입했습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 진드기 먹이 챔버
- 무료 3D 설계 소프트웨어를 사용해 35mm x 10mm 페트리 접시에 맞도록 챔버를 설계하세요. 인쇄 부품(그림 1A) 크기는 다음과 같습니다: 챔버 본체( 1부) 25mm(내경) x 20mm(높이), 바닥 벽 두께 3mm, 상단 덮개 링 (2부) 6mm 벽 두께(2부), 내경 30mm, 높이 5mm, 3.5mm 벽 두께와 외곽 링( iii부) 31mm(내경) x 5mm(높이), 3mm 두께.
참고: 뚜껑 링에는 자석을 넣을 수 있는 4개의 원형 3 mm x 높이 구멍이 포함되어 있습니다. 챔버 상단에는 자석을 부착할 수 있는 동일한 크기의 구멍이 있습니다(그림 1B). 3D 모델 설계는 가장 일반적인 3D 프린팅 파일 형식인 .stl 파일로 저장해야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 3D 설계가 포함된 파일은 요청 시 제공됩니다. - 10인치 14K LCD 3D 프린터와 회색 또는 흰색 광분자 수지(그림 1A)를 사용한 챔버 인쇄 또는 .stl 파일에서 3D 모델을 출력하는 다른 고해상도 3D 프린터/서비스.
참고: 이 프로토콜은 애리조나 대학교의 인쇄 서비스와 수지를 사용했습니다. 고해상도 수지를 사용하면 정교하고 내구성 있는 챔버를 만들 수 있습니다. - 장갑을 끼고 조립 전에 부품에 수지 잔여물이 없는지 세척하고, 필요 시 180에서 200방 고운 사포로 부드럽게 사포질을 하세요. 파트 i (그림 1A)의 평평한 바닥이 매끄럽게 만들어지도록 하세요. 이로 인해 실리콘 막이 제대로 접착되어 누출 위험을 줄일 수 있습니다.
- 모든 건조 조각을 UV 조명에 10분간 노출시켜 완전한 수지 중합을 보장합니다.
참고: 독성 수지를 인쇄에 사용하는 대부분의 3D 프린팅 서비스는 UV 조명을 사용해 수지를 경화시키고(모델을 경화시키고 수지 독성을 제거함), 하지만 가끔은 '완전히 완성되지 않았다'고 남기도 합니다. 완전히 경화되지 않은 모델은 만졌을 때 약간 끈적거리며, 편광되지 않은 수지가 들어 있어 독성이 있거나 다루는 시 자극을 유발할 수 있습니다. 추가적인 자외선 노출은 레진의 완전한 경화를 보장합니다. - 3mm x 2mm 원형 자석을 챔버와 뚜껑 링 상단의 슬릿에 투명 에폭시 접착제로 붙이세요. 실온(20–25°C/최소 16시간)에서 하룻밤 건조하세요. 자석의 극이 한 방향으로 향하도록 하여 뚜껑 링 상단의 자석 극들이 끌어당기는 힘을 맞추도록 하세요(그림 1A, 2부).
- 모델 내 모든 부품을 조립하여 모든 부품이 적절히 맞도록 하세요. 그림 1A–C에 나타난 것처럼.
2. 막 준비
- 깨끗한 표면에 30cm x 30cm 크기의 랩을 깔고, 평평한 표면에 늘려 가장자리를 테이프로 고정하여 구김 없이 유지하세요(그림 2Ai).
- 렌즈 세척용 종이 4장에서 5cm 간격으로 확장된 플라스틱 랩 위에 덮으세요(그림 2Aii).
- 아래에 제시된 성분과 양을 사용하여 실리콘 멤브레인을 준비하세요.
참고: 이 양은 4–5개의 막(7 cm × 12 cm)을 준비하기에 충분하며, 각 막은 최대 5–6개의 급식실을 수용하여 총 20–30개의 챔버를 수용합니다. - 실리콘 혼합물을 준비하려면 15g의 실리콘 클리어 코킹(경도 20–25 Shore A)과 4.5g의 실리콘 오일(전체 실리콘의 30%), 그리고 2.9g의 헥산(전체 실리콘의 19.3%)을 첨가합니다. 재료를 플라스틱 무게 측정대에 넣고 주걱으로 부드럽게 섞으세요(그림 2Aiii).
참고: 재료를 부드럽게 섞어 거품 형성을 최소화하세요. - 렌즈 종이의 작은 가장자리에 2–3g의 실리콘 혼합물을 바르고 플라스틱 랩에 고정하세요. 실리콘이 렌즈 용지를 통해 스며들 때까지 5–10초를 두세요(그림 2Aiv).
- 실리콘 혼합물을 렌즈 종이 시트에 고르게 펴 뚜껑, 자, 주걱 같은 직선 도구를 사용해 바릅니다. 사용되는 물체가 렌즈 용지 전체 면적을 덮도록 하세요(그림 2Av). 이로 인해 실리콘이 한 획으로 덮여 멤브레인 러플링과 물결 현상을 방지합니다.
- 스프레딩 도구를 시작 위치로 되돌려 멤브레인 내 모든 실리콘 혼합물이 사용되도록 하세요. 스프레딩 도구에 일부 실리콘 혼합물이 남아 있으므로, 도구를 다시 수집하면 틈을 피하기 위해 실리콘 혼합물이 모두 사용될 수 있습니다(그림 2Avi).
참고: 멤브레인은 물결 없이 균일하게 반투명해야 합니다(그림 2B). - 두께가 다른 막은 처음에 실리콘 혼합물을 더 많이 또는 적게 첨가하여 준비하는데, 두께는 막이 건조될 때까지 측정할 수 없습니다.
- 멤브레인을 실온(20–25°C/최소 16시간)에서 하룻밤 자연 건조시키세요.
- 디지털 외부 마이크로미터 측정 도구를 사용해 멤브레인 두께를 측정합니다. 성체 진드기 종마다 짧은 입 부분(막 두께 70 μm)부터 긴 입 부분(200 μm 두께)까지 다양한 막 두께가 사용됩니다.
- 이전에 조립된 챔버의 모든 부품을 제거하고 챔버 하단 가장자리에 실리콘 접착제를 바릅니다. 정확한 접착제 위치를 위해서는 1ml 주사기를 사용하고 실리콘 접착제를 채우세요(그림 2Ci).
- 접착제를 도포할 때 주사기 팁(바늘 대신)에 200 μL 피펫 팁을 붙이고, 바늘 끝과 마찬가지로 주사기 끝에 나사로 고정합니다(그림 2Ciii). 이렇게 하면 각 챔버의 하단 테두리에 미세한 접착제를 바를 수 있습니다(그림 2Civ).
- 챔버를 막 위에 올려놓고 무게가 달린 물체를 올려 침하를 보장합니다. 상온(20–25°C/최소 16시간)에서 하룻밤 동안 방치하세요(그림 2D,E).
참고: 평평한 무게가 있는 물체를 사용하세요. 이 프로토콜은 2.5kg 크기의 아크릴 조각을 사용했습니다(그림 2E). - 곡선 가위를 사용해 챔버의 멤브레인 과잉을 잘라냅니다(그림 3A).
- 진드기 먹이를 위해 챔버를 사용하기 전에, 멤브레인이 준비되는 남은 플라스틱 랩을 제거하세요(2.1단계)(그림 3B).
- 챔버 부품을 다시 조립하고, 바닥에 35mm x 10mm 페트리 접시를 넣고, 접시의 뚜껑을 거꾸로 하여 자석 사이에 넣어 챔버의 뚜껑으로 사용하세요(그림 3C,D).
참고: 뚜껑을 뒤집어 사용하세요. 뚜껑 홀더 링이 뒤집히면 뚜껑에 딱 맞기 때문입니다(도표 3C,D 부품 설명 참조). - 챔버 멤브레인을 35mm x 10mm 크기의 페트리 접시 하단 부분을 증류수에 담가세요. 막을 실온(20–25°C/최소 16시간)에서 물에 하룻밤 두세요. 막이 처음에는 소수성이기 때문에, 혈액을 넣기 전에 물에 담가두면 갇힌 기포 형성을 줄이는 데 도움이 됩니다.
참고: 기포가 없다는 것은 소수성이 제거되었음을 확인시켜 줍니다.
3. 진드기 먹이 및 혈액 준비
- 각 챔버의 뚜껑에 2–3개의 작은 호흡구멍을 만드세요(35mm x 10mm 페트리 접시에서, 그림 1A의 4부). 이는 2.16단계(그림 3E)에서 언급된 것입니다. 가열된 금속 메스나 얇은 금속 주걱으로 뚜껑의 호흡구멍을 찔러보세요.
참고: 호흡 구멍은 챔버 하우징 내부에 습기가 흡수되도록 합니다. - 혈액에 겐타미신 황산염을 최종 농도인 50 μg/mL로 보충합니다. 1주일 이내에 사용할 혈액에는 항생제만 첨가하고 4°C에서 보관하세요. 소의 피(또는 다른 동물의 혈액)는 항생제 투여 전후로 4°C에서 유지하세요.
- 깨끗한 35mm x 10mm 양엽 접시에 2–3mL의 혈액을 넣고, 그 위에 챔버를 올려놓습니다. 조정 링을 회전시켜 챔버당 사용하는 혈액량을 늘리거나 줄이기 위해 챔버 높이를 조절할 수 있습니다(그림 1A의 3부). 챔버 높이를 조절하여 페트리 접시 바닥과 막 사이에 1–2mm 간격을 남겨두세요. 참고용으로 그림 4A의 마젠타 화살표를 참고하세요.
참고: 챔버의 조정 링 설계는 사용되는 혈액의 양을 조절할 수 있도록 합니다. 즉, 페트리 접시 바닥과 막 사이의 공간이 더 클수록 공간을 채우기 위해 더 큰 부피가 필요합니다. - 먹이지 않은 진드기를 수컷과 암컷이 같은 수로 보관실에 넣으세요. 항상 수컷 양쪽이 챔버에 포함되도록 해야 하며, 이는 먹이 속도에 영향을 줄 수 있습니다(그림 4B 는 방 안에 있는 성체 A. americanum 의 수컷 4마리와 암컷 4마리를 보여줍니다). 성체 단계에서는 다루기 쉽도록 챔버당 최대 10–15마리의 틱을 사용합니다.
참고: 미성숙 단계를 다룰 때는 진드기 수가 더 많아집니다(챔버당 20–50마리의 유충, 이 프로토콜에는 제시되지 않음). - 챔버를 37°C± 1°C의 덮개가 있는 건조 욕조에 넣고, 상대습도가 63%± 2%를 유지하는 습도원(즉 , 물컵)을 12:12시간의 밝은 어둠 광주기 아래 두세요(그림 4C).
참고: 이 요구사항은 진드기 종류와 실험실 조건에 따라 달라질 수 있습니다; 필요하다면 다른 습도 설정을 시도해보고, 실험실에 가장 적합한 환경을 평가하세요.
4. 혈액과 챔버 교체
- 혈액 교체 사이에 막을 헹궈낼 용액이 담긴 두 개의 분사 병을 준비하세요. 한 병에 증류수에 0.005% 나이스타틴 용액을 추가하고; 두 번째 병에는 증류수를 넣으세요.
- 12–16시간 후에는 신선한 피로 새 페트리 접시를 준비해 37°C의 건조 욕조에 넣은 후 챔버를 설치하세요.
- 신선한 혈액이 가열되는 동안, 사용한 혈액에서 챔버를 분리하고 막 아래쪽을 증류수로 3–5초간 세척한 후 0.005% 나이스타틴 용액으로 3–5초간 세척하여 곰팡이 오염을 방지합니다. 남은 나이스타틴 잔여물을 제거하기 위해 증류수로 멤브레인을 다시 세척하세요.
참고: 이 과정은 5분 미만으로 끝나며, 막에 부착된 진드기의 먹이 섭취에는 영향을 주지 않습니다. - 사용한 혈액과 씻은 물을 0.5% 차아염소산나트륨 용액(표백제 10%)이 든 용기에 버리세요. 혈액 폐기물은 기관 안전 프로토콜에 따라 폐기됩니다.
- 헹군 후, 혈액이 섞인 새 페트리 접시에 챔버를 넣습니다.
참고: 오염과 누수가 없다는 조건으로 세척 전 최대 2–3개월 동안 챔버를 사용하세요. 챔버와 멤브레인은 세척하지 않고 3개월 이상 사용하면 더러워지고 오염 위험이 있습니다. 이로 인해 진드기 먹이 속도가 감소합니다. 챔버를 최대 1.5년(~10회 세척 사이클)까지 재사용하세요. - 챔버는 0.5% 차아염소산나트륨(표백제 10%)에 최대 30분간 담근 후 주방 세제로 세척하세요. 향이 나면 침체실을 표백제에 장기간 노출하지 마세요(>30분). 냄새는 부착 속도를 줄이고, 시간이 지남에 따라 수지의 내구성을 약화시킬 수 있습니다.
참고: 표백제에 오래 노출되면 젖었을 때 유연해지고 마르면 부서지기 쉬워져 파손이 발생합니다. 이로 인해 반복된 관찰에 따르면 세척실은 4–5회 세척 사이클을 넘지 못합니다. 세척 없이 같은 챔버를 연속 사용(최대 3개월)은 최근에 세척한 챔버(부착 기간>보통 7일)보다 진드기 부착 속도가 더 빨라집니다(보관 후 1–3일 이내). 이는 진드기가 챔버에서 먹이를 먹는 배설물과 다른 페로몬 집단 냄새가 진드기 섭식을 자극하기 때문일 가능성이 큽니다35,36.
결과
진드기 종별 막 두께.
각 성체 진드기 종별로 다음 막 두께 기준에서 가장 높은 진드기 먹이 속도가 관찰되었습니다: Amblyomma americanum 100–200 μm; A. maculatum 100–250 μm; Rhipicephalus sanguineus 70–100 μm; 견갑 색소드 <150 μm, 더마센터 바리아빌리스 <150 μm. 모든 진드기 종은 먹이 시 습도와 온도(63% RH, 37 °C)에서 유지되었습니다(표 1).
이 프로토콜에서 사용되는 진드기와 혈액 출처
모든 진드기는 오클라호마 주립대학교 진드기 사육 시설에서 얻었으며, 상대습도 >90% 20°C, 12시간 12분 빛-어둠 광주기 하에 유지되었습니다. 모든 진드기는 다양한 진드기 종의 알파-갈(αGal) 수치를 조사하는 연구 프로젝트의 일환으로 제세균된 소 또는 인간의 혈액으로 먹이를 받았습니다. 이 연구는 연구팀이 수행한 알파-갤 증후군(AGS) 프로젝트의 광범위한 프로젝트 내에서 다양한 혈액원에 대한 영양 섭취의 영향을 비교하였습니다. 여기 설명된 대부분의 진드기 표본은 완전 유혈 전에 해부되어 부분적으로 먹인 진드기(2–5일간 먹이 주기)에서 αGal 정량 분석을 수행했습니다. Amblyomma americanum 진드기 중 일부(αGal 정량에 필요하지 않은 것들)만이 채워질 때까지 먹이를 먹을 수 있었습니다. 소 먹이와 사람 먹인 진드기 먹이 속도의 상세 비교는 여기서 제시되지 않았으나, 소 혈액을 먹인 진드기에서 완전 부혈(즉, 먹이 성공률)이 더 많이 달성되었다는 점은 주목할 만하다. 먹이통에 장기간 머물게 한 진드기(n = 35) 중 15마리가 완전 팽창하여 먹이 성공률이 42.8%에 달했습니다. 이 중 9마리는 소 피로, 6마리는 인간 피로 먹였으며(60% 소 사육 대 40% 인간 사료).
진드기 먹이 주기 vs. 진드기 먹이 성공률
이 연구에서 진드기의 먹이 속도는 부분적으로 먹이를 섭취한 진드기의 획득(2–5일간의 먹이 섭취)을 기준으로 결정되었으며, 먹이 성공률은 일반적으로 암컷의 알로스쿠툼 색상 변화로 표시되는 완전한 부혈으로 정의되었습니다( Amblyomma americanum에만 해당되는 데이터). 수컷의 먹이 속도는 2일 이상(2–5일) 연속 먹이를 하는 것으로 정의되었습니다. 전체 먹이 속도는 소와 인간 혈액을 먹인 진드기 데이터를 결합하고, 진드기가 챔버에 넣어 먹이를 섭취하거나 완전히 부풀어 오른 진드기의 비율을 계산하여 계산했습니다. 부착하지 않았거나 부착 후 <2일 후에 죽은 진드기는 먹이 속도 계산에 고려되었습니다. 혈액원이 진드기 먹이 속도에 미치는 영향에 대한 정량적 데이터는 제시되지 않았지만, 이 관찰 증거는 대부분의 진드기 종에서 2일에서 5일간의 먹이 주기 동안 소와 인간의 혈액 간에 부착 및 먹이 속도가 크게 다르지 않음을 시사합니다. 예외적으로 Rhipicephalus sanguineus는 3일째부터 5일째 사이에 소의 혈액에 비해 낮은 흡혈률을 보였습니다. 이 시험 관 내 진드기 먹이 시스템을 사용해 부분 섭식과 완전 팽창을 달성한 모든 진드기 종의 먹이 속도는 표 1에 요약되어 있습니다.
암블리오마 아메리카눔 암컷 체중 및 섭식 단계 분류
부분적으로 먹이를 받은 암컷 A. americanum 은 먹이 일수를 기준으로 다음과 같이 분류되었습니다: (1) 먹이하지 않은 상태, (2) 부분적으로 먹인 2–3일, (3) 부분적으로 먹인 4–5일, 그리고 (4) 부풀어 오른 상태(그림 5). 팽팽한 먹이 단계에는 급속 팽창 단계 시작 시점의 진드기(무게 48.9mg에서 109mg 사이)와 완전히 팽창한 진드기(무게 272.7mg에서 348.7mg 사이)가 포함되었습니다.
그림 1: 진드기 먹이 챔버 - 3D 모델 및 멤브레인이 포함된 인쇄 조립체. 폭발된 3D 모델 및 최종 조립된 챔버에는 개별 부품이 표시되어 있습니다: (i) 챔버 본체(틱 하우징), (ii) 뚜껑 홀더 링, (iii) 높이 조절 링, (iv) 40 mm x 10 mm 페트리 접시 뚜껑, (v) 혈액이 포함된 40 mm x 10 mm 페트리 접시 바닥 (A). 3D 프린팅 모델 조립과 개별 부품 크기는 mm (B) 단위로 표시됨. 조립된 챔버는 회색 8K 해상도 수지(C)로 인쇄됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2: 실리콘 막 및 챔버 어셈블리의 준비. (i) 30cm × 30cm 플라스틱 랩을 테이프로 고정하여 주름이 보이지 않게 하는 것, (ii) 렌즈 세척용 용지를 랩 위에 약 5cm 간격으로 놓고, (iii) 실리콘 성분을 주걱으로 원을 그리며 부드럽게 섞기, (iv) 각 렌즈 종이 가장자리에 1–2g의 실리콘 혼합물을 발라 고정하는 것, (v) 렌즈 종이보다 큰 직선 모서리 기기를 사용해 렌즈 용지에 고르게 바르는 실리콘 혼합물(사진은 유리 뚜껑 가장자리를 보여줍니다), (vi) 스프레딩 시 실리콘 혼합물의 양이 줄어드는 것을 확인하고, 도구에 남아 있던 실리콘을 다시 재분배하여 균일한 커버를 보장합니다 (A). 적절히 펼쳐진 막에서는 기포나 틈이 없었습니다(B). 접착제 도포를 위한 주사기 준비: (i) 실리콘 접착제로 채워진 1mL 주사기, (ii) 주사기 끝에 장착된 200 μL 피펫 팁, (iii) 누수 방지 밀봉을 위해 나사로 고정된 피펫 팁, (iv) 부품 i (C) 하단 가장자리에 접착제를 부착하는 것. 건조된 막(D) 위에 챔버를 놓고, 그 위에 무게가 달린 물체(두께 2.5kg의 아크릴 블록; 마젠타색 화살표)를 올려 단단한 접착을 보장합니다(E). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: 사용 전 챔버 및 멤브레인 준비의 마지막 단계. 곡선형 작은 가위로 챔버 주변 막 가장자리를 다듬기(A), 챔버 사용 전 랩 제거(B), 최종 모델 조립(C), 물이 담긴 40mm x 10cm 페트리 접시에 챔버 배치, 그리고 페트리 접시 llid를 챔버 뚜껑으로 사용(D)(숫자 i-v는 그림 1A에 명시된 부품을 나타냅니다). 그리고 호흡 구멍이 있는 챔버 뚜껑(마젠타색 화살촉으로 표시) (E). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 4: 혈액 공급과 진드기 배치. 챔버를 혈액이 채워진 접시에 넣고, 높이 조절 링이 강조되어 있습니다(마젠타 화살표) (A). 수컷과 암컷 진드기가 같은 수가 있는 방 내부 모습(B). 진드기 챔버는 습도원이 있는 건조 욕조에 위치하며, 상대습도(RH)± 63% ± 37 °C 온도를 유지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 5: Amblyomma americanum 의 크기 및 체중 변화. 먹이지 않은 진드기 크기와 부분적으로 먹인 진드기의 평균 체중이 표시됩니다. 이 이미지들은 각 급식 간격에서 기록된 평균 체중에 해당하는 전형적인 예시입니다. 첨부된 표는 각 먹이 시점별 평균 가중치, 표준편차, 분석된 틱 수, 중앙값, 그리고 1과 3의 4분위수를 제시합니다. 2–3일 동안 먹인 진드기는 최소 7.4 mg에서 최대 19.2 mg 사이의 무게 범위를 보였습니다. 4-5일 동안 먹인 진드기는 20.6mg에서 44.8mg 사이였습니다. 급격한 유혈 시작 시점의 진드기와 완전히 팽창한 진드기의 무게는 48.9mg에서 348.7mg 사이였습니다. 첨부된 암 컷 4-5일 후 먹이 상태(노란색 화살촉)와 완전히 부풀어 오른 암컷(마젠타색 화살촉) 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
| 진드기 종과 성별 | 먹인 틱 수/ 챔버에 배치된 총 틱 수 (죽은 틱 수) | 먹이 속도 (진드기 부착 기간 2-5일) | 평균 체중(mg) (표준수) | 사용된 막 두께(μm) |
| A. americanum 암컷 | 85/97 (12) | 87.60% | 37.3 (54.40)* | 100 - 200 |
| A. americanum 수컷 | 19/22 (2) | 86.30% | 기록되지 않았다 | 100 - 200 |
| A. maculatum 암컷 | 45/66 (21) | 68.20% | 122.4 (141.65) | 100 - 250 |
| A. maculatum 수컷 | 36/47 (11) | 76.60% | 기록되지 않았다 | 기록되지 않았다 |
| R. sanguineus 암컷 | 34/60 (26) | 56.60% | 기록되지 않았다 | 70 - 100 |
| I. scapularis 암컷 | 15/23 (8) | 65.20% | 기록되지 않았다 | <150 |
| *소 먹이를 먹인 성체 Aa 진드기 하위 집합에서 평가된 먹이 성공률은 (n=35) 42.8%였습니다. | ||||
표 1: 진드기 먹이 속도와 평균 체중.
보조 그림 1: 3D 챔버 부위에 이미 부착된 개별 진드기의 저용량(100 μL) 먹이 방식. 인공막 바닥에 실리콘 접착제로 부착된 작은 PCR 튜브에 100 μL의 혈액이 채워집니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
진드기 인공 막 먹이 시스템은 진드기 연구에 매우 효과적인 도구이며, 많은 연구실에서 살아있는 동물 먹이를 대체하는 실질적인 대안으로 광범위하게 사용되고 있습니다28,29. 이 시스템의 주요 가치는 병원체, 살충제, 진드기 유래 화합물 및 기타 조절 분자 등 다양한 물질을 혈액 식사를 통해 전달하거나 회수할 수 있는 능력에 있습니다 22,23,25,27. 인공 막 먹이 시스템의 최적화는 지속 가능한 진드기 집단 사육을 촉진하여 살아있는 동물에 대한 의존도를 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜에서 제시한 시험관 진드기 먹이 시스템은 성충 Amblyomma americanum과 Ixodes scapularis에서 특히 성공적이었습니다. 진드기 먹이 성공률은 먹이를 완전히 먹이를 먹는 데 성공한 진드기의 비율(또는 비율)으로 정의됩니다. 하지만 부분적으로 먹인 진드기(보통 먹이 시작 후 3–4일 후)만으로도 대부분의 진드기 생물학 또는 생리학 연구실에서 특정 실험 가설을 충족하기에 충분합니다. 이 인공 막 먹이 시스템 프로토콜과 알파-갤(αGal) 프로젝트의 특정 연구 목표를 다루기 위해, "진드기 먹이 속도"라는 용어는 부분적으로 먹이를 섭취한 진드기(2–5일간의 먹이 섭취)를, "진드기 먹이 성공"은 A. americanum의 완전 부혈을 의미하는 데 사용되었습니다. 가장 높은 먹이 비율은 A. americanum 암컷(87.6%)이었으며, 그 다음으로 A. americanum 수컷(86.3%), A. maculatum 암컷(68.2%), A. maculatum 수컷(76.6%), I. scapularis 암컷(65.2%), R. sanguineus 암컷(56.6%)이 순이었으며, A. americanum의 먹이 성공률은 42.8%였습니다(표 1). 부분적으로 먹인 암컷 A. americanum은 먹이 일수에 따라 4가지 범주(먹이 단계)로 분류되었으며, 이전 출판물에서 수정되어21가지로 수정되었습니다: (1) 먹이받지 않은 상태, (2) 부분적으로 먹인 2–3일, (3) 부분적으로 먹인 4–5일, (4) 팽만한 상태(그림 5). 부풀린 먹이 단계에는 급속 부혈 단계 시작 시점의 진드기(무게 48.9mg에서 109mg 사이)와 완전히 부풀어 오른 진드기(무게 272.7mg에서 348.7mg 사이)가 포함되었습니다(그림 5). 이 인공 막 진드기 먹이 시스템은 같은 연구 그룹과 협력자 내에서 소의 혈액에서 부분적으로 먹인 진드기를 생성하는 여러 연구를 가능하게 했으며, 이는 이후 쥐를 감염시키고 진드기에 물린 붉은 고기 알레르기인 알파-갤 증후군(AGS)의 전파 가설을 검증하는 데 사용되었으며, N-당당학 연구에서도11,21 37. 개별 설치의 편리함 덕분에 다양한 혈액원을 사용할 수 있었고, 투명한 뚜껑과 낮은 챔버 높이 덕분에 충분한 작업 거리를 확보한 입체현미경 아래에서 진드기를 시각화할 수 있었습니다.
최근에는 습도(수욕 90% RH)에서 건식 욕조(63% ± 2% RH), 온도(37°C에서 35°C, 다시 37°C), 막 두께(표 1)의 변화로 여러 진드기 종의 먹이를 성공적으로 먹이할 수 있게 되었습니다. 온도와 상대습도(RH)는 시험관 내 진드기 먹이 조절에 중요한 변수이지만, 막 두께와 강도는 다양한 진드기 종 간 성공적인 먹이를 보장하는 데 중요한 요소입니다33,38. 짧은 입 부분을 가진 진드기(예: Rhipicephalus sanguineus, Dermacentor variabilis)는 긴입 부분을 가진 진드기(예: Amblyomma spp, Ixodes spp)보다 더 얇은 막이 필요하다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 가장 높은 진드기 먹이 속도는 Amblyomma americanum과 A. maculatum에서 막 두께 100–200 μm에서 나타났으며; 두께 70–100 μm 사이의 Rhipicephalus sanguineus; Ixodes scapularis는 두께<150 μm), Dermacentor variabilis는 두께 <150 μm(표 1). 인공 막 진드기 먹이 섭취에서 주목해야 할 중요한 점은 먹이 속도의 변동이 여전히 발생한다는 것입니다. 이 시스템에서는 온도가 37°C에서 35°C로, 그리고 며칠 후 다시 37°C로 떨어지는 미세한 변화가 진드기의 먹이 속도를 증가시키거나 회복시키는 경우가 많습니다. 또한 건목에서 물욕으로 전환하면 Amblyoma 속과 Ixodes scapularis에서도 유사한 결과가 나오지만, Rhipicephalus sanguineus에서는 63% ± 2% 습관에서 더 효과적으로 먹이를 섭취하는 Rhipicephalus sanguineus에서는 이 효과가 관찰되지 않았습니다.
Ueti, M. 외(USDA-ARS)가 개발한 5단계 연속 흐름 시스템에서 개조한 다른 인공 진드기 먹이 시스템은 Yamasaki, Y. 등이 추가 진드기 종을 위해 수정한 것으로, 높은 효율성을 보여주어 지속적으로 높은 진드기 먹이 성공률을 보였습니다27,40. 하지만 부분적으로 먹인 진드기 해부를 위해 자주 시스템에 접근해야 하는 연구는 진드기 하우징 챔버를 반복적으로 열고 닫는 것이 번거로워 이러한 설치가 덜 적합하게 만듭니다. 이 프로토콜에서 설명된 3D 프린팅 챔버는 자석 확실 뚜껑과 개별 페트리 접시를 특징으로 하여, 진드기 먹이를 간편하게 다루고 시각적으로 검사할 수 있으면서도 설치를 방해하지 않습니다. 투명 뚜껑은 방해 없이 시각 모니터링을 가능하게 하며, Kröber와 Guerin22,29의 원래 설계에서 최적화된 일반적인 진드기 먹이 시스템과 달리 삽입된 자석을 통해 챔버에 안전하게 부착됩니다. 진드기 급식 시스템은 모든 급식 유닛이 하나의 플레이트에 통합되어 있어 개별 시각화가 불가능하며, 이는 피에서 급이 챔버를 분리해야 하고, 진드기 탈출을 막는 방법도 사용됩니다 시각화를 허용하지 않습니다. 더불어, 이 시험관 내 진드기 먹이 시스템은 더 적고 부위에 특화된 혈액 양을 전달할 수 있도록 더욱 정교화될 수 있습니다. 예를 들어, 암컷 진드기가 지정된 먹이 부위에 부착되면, 하단 페트리 접시는 부착 부위 바로 아래에 위치한 100 μL PCR 튜브 상단부와 같은 소형 저장소로 대체할 수 있습니다(보조 그림 1). 이 저용량 먹이 방식은 병원체 획득 및 전파에 관한 상세한 연구뿐만 아니라 진드기 독성 물질과 숙주 유래 항체의 영향에 대한 조사를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 다양한 성체 진드기 종에서 부분적으로 먹이를 섭취한 진드기를 얻는 데 성공하는 것으로 입증되었습니다. 본 연구에서는 산란 및 완전 유혈률을 평가하지 않았으며; 그러나 예비 관찰을 바탕으로 Amblyomma americanum과 Ixodes scapularis를 통해 진드기 자손을 얻기 위한 추가 최적화가 진행 중입니다. 이 시스템의 가장 혁신적인 특징은 소규모 실험적 조작에 대한 유연성으로, 처리와 환경 조건의 통제된 변화를 가능하게 하는 동시에 군체 사육 응용도 지원합니다.
시험관 내 진드기 먹이는 진드기 생물학, 생리학, 벡터 능력을 연구하는 연구자들에게 매우 유용한 도구입니다. 하지만 인공 막 진드기 먹이는 시간과 노력이 많이 드는 작업입니다. 이 프로토콜은 3D 프린팅 챔버와 슈어락 시스템, 그리고 실험실에서 제작한 간단한 멤브레인을 특징으로 하여, 챔버가 프린팅되고 멤브레인이 준비된 후 간단한 설치를 제공하여 장기간 사용할 수 있습니다. 또한 막 두께를 조절함으로써 시스템을 다양한 진드기 종에 효과적으로 적응시킬 수 있습니다. 챔버 크기와 막 두께 등 추가 최적화를 통해 다양한 틱 수명 단계에 적용할 수 있습니다.
공개 사항
저자들은 이 논문에서 설명한 연구와 관련된 실질적인 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자들은 진드기 먹이 주기와 진드기 챔버 및 막 설치를 도운 학부생 및 작업자인 Kara Golden, Sydney Ingham, Omayma Jaddou Najma의 성실한 노력에 감사드립니다.
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