방법 논문

골관절염 전임상 연구를 위한 표준화된 불안정성 유발 동물 모델

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DOI:

10.3791/69612

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2025년 12월 23일

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1Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Chinese Medicine), 2The First School of Clinical Medicine, Zhejiang Chinese Medical University, 3Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Hematology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Chinese Medicine), 4Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Orthopedics Research Institute of Zhejiang University, 6Key Laboratory of Motor System Disease Research and Precision Therapy of Zhejiang Province, 7Clinical Research Center of Motor System Disease of Zhejiang Province

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 골관절염 연구에 적합한 동물 모델을 구축하는 것을 목표로 합니다.

초록

전 세계에서 가장 흔한 관절 질환인 무릎 골관절염(OA)은 전 세계적으로 중요한 보건 부담을 나타내며, 그 발병 기전과 치료 전략에 대한 광범위한 연구가 이루어지고 있습니다. 수많은 연구에도 불구하고, 모델 구축을 위한 표준화된 방법론은 여전히 부족하다. 따라서 이 격차를 해소하기 위해, 우리는 불안정성에 의한 골관절염 동물 모델 개발을 위한 포괄적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시하는데, 특히 쥐의 내측 반월상 월상 연골 불안정화(DMM) 모델과 쥐의 내측 반월상 연골 파열(MMT) 모델이 그렇습니다. 더 나아가, 우리는 수술 후 통증 역치와 공간적 보행 안정성을 평가하는 간단하고 쉽게 구현 가능한 절차를 설명하여, 전임상 OA 연구에서 방법론적 일관성을 촉진하는 것을 목표로 합니다. 조직학적 및 행동학적 검증 결과, 두 모델 모두 성공이 확인되었으며, 골관절염 연구학회 국제(OARSI) 점수가 현저히 높았고, 보폭 길이가 유의미하게 변화했으며, 기계적 통증 역치가 대조군에 비해 크게 감소하여 두드러진 관절 퇴행과 과민반응이 나타났습니다. 이러한 검증 결과는 두 모델의 재현성과 번역적 관련성을 강조합니다. 따라서 상세한 영상 문서화를 제공함으로써 절차적 표준화를 촉진하고 실험실 간 일관성을 촉진하여 OA 연구 결과의 신뢰성과 비교 가능성을 높입니다.

서론

골관절염(OA)은 매우 흔한 퇴행성 관절 질환으로, 전 세계적으로 장애의 주요 원인 중 하나입니다 1,2. 광범위한 연구에도 불구하고 효과적인 질병 조절 OA 약물(DMOADs)의 개발은 상대적으로 더디게 진행되고있습니다. 현재 OA는 관절 연골, 연골하 뼈, 힘줄, 활막 4,5 등 여러 관절 주위 조직에 걸쳐 복잡한 병리학적 변화를 포함하는 다요인 질환임이 널리 인정되고 있습니다. OA의 다양한 병리학적 과정에 대한 효과적인 전임상 연구는 명확하고 적절한 동물 모델의 사용이 필요합니다. 다양한 OA 동물 모델이 확립되어 6,7,8,9,10,11이 보고되었음에도 불구하고, 많은 연구들이 여전히 부적합한 동물 모델을 사용하여 그 결과의 번역적 관련성을 제한하고 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 내측 반월판(DMM) 및 내측 반월상 연월판 파열(MMT)의 재현 가능한 불안정화 절차를 포함한 표준화된 불안정성 유발 OA 모델을 영상 형식으로 제시하여 전임상 OA 연구 및 모델 표준화에 실용적인 참고 자료로 활용합니다.

이전 연구에서 보고된 바와 같이, 반월상 연월상 연월상 반월상 불안정성은 임상 사례에서 무릎 관절 퇴행에 기여하는 주요 요인입니다. 따라서 쥐와 쥐에서 외과적으로 유도된 반월상 연골 불안정성은 OA의 실험적 유도에 효과적인 접근법이 됩니다. 이 맥락에서 우리는 쥐의 DMM 모델과 쥐의 MMT 모델을 포함한 두 가지 대표적인 불안정성 유발 OA 모델을 제시합니다. 마우스에서의 DMM 모델은 OA의 분자 메커니즘 연구에 특히 가치가 있는데, 마우스는 유전자 변형 조작이 가능하며, 이 모델은 점진적이고 장기적인 질병 진행을 보이며 인간 OA와 매우 유사합니다. 그러나 DMM 모델은 연골하 뼈의 병리학적 변화에 초점을 맞춘 연구에는 덜 적합하며, 대안 모델이 더 나은 번역적 관련성을 제공할 수 있다는 점을 유념해야 합니다.

더 나아가, 쥐 DMM 모델을 보완하기 위해 쥐에서 MMT 모델을 확립하였습니다. MMT 시술은 관절 연골과 연골하 뼈 모두에 더 광범위한 구조적 손상을 유발하여 임상 환경에서 관찰되는 골관절증의 진행된 병리학적 특징을 더 잘 반영합니다. 이로 인해 쥐 MMT 모델은 생체재료, 재생 치료, 관절 수리를 목표로 하는 약물 전달 시스템 평가 등 생명공학 및 중개 연구에 특히 적합합니다. 이전 연구에서 MMT와 DMM 수술 기법이 설명되었음에도 불구하고, 연구실 간 표준화, 재현성, 기술적 정밀도를 보장하는 포괄적이고 단계별 시각적 프로토콜은 여전히 부족합니다. 따라서 이 격차를 해소하기 위해, 동물 준비부터 수술 후 관리에 이르기까지 모델 구축의 각 핵심 단계를 상세한 영상 기반 시연으로 개발했습니다. 또한, 통증 역치 평가와 공간 보행 안정성 분석에 사용되는 두 가지 일반적으로 사용되는 행동 평가 방법을 도입하여 OA 유도 후 기능적 평가에 일관된 틀을 제공합니다. 따라서 외과적 및 행동적 프로토콜을 통합함으로써 본 원고는 전임상 OA 연구에서 방법론적 표준화를 촉진하여 연구 간 데이터 비교성과 번역적 관련성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 저장중화의과대학 동물윤리복지위원회의 지침에 따라 수행되었으며, 프로토콜 번호 IACUC-20251020-11로 승인되었습니다. DMM 수술에는 10-12주 크기의 수컷 C57BL/6마리 마우스가 사용되었고, MMT 수술에는 200-225g의 수컷 Sprague-Dawley 쥐가 선정되었습니다. 모든 동물은 특정 병원체 없는 환경(SPF) 환경에서 사육되었으며, 실험 전 1주일간의 적응 기간이 허용되었습니다. 표준 사육 조건이 유지되었으며, 동물 복지와 실험의 일관성을 보장하기 위해 식량, 물, 침구가 주 2회 이상 교체되었습니다.

1. 동물 준비

  1. 수술 전 기관 지침에 따라 적절한 진통제(예: 부프레노르핀)를 투여하십시오. 흡입 마취제(예: 2% 이소플루란을 분당 0.4L, 유도 챔버에서 4L/분의 신선한 가스 흐름)를 사용하여 마취하고, 시술 내내 코 콘을 통해 마취를 유지합니다. 페달 철회 반사가 없는지 확인하여 마취의 깊이를 확인하세요.
  2. 2-3mm 두께의 윤활성 안과 연고를 하눈꺼풀 결막에 바르고 부드럽게 마사지하여 연고가 안구 표면에 고르게 분포되도록 하세요.
  3. 오른쪽 무릎 관절 주변 털을 면도하고 수술 부위를 포비돈-요오드로 3단계 세척 후 70% 에탄올로 소독합니다. 동물을 멸균 수술대 위에 위치시키세요.

2. 마우스에서의 DMM 수술

참고: 이 수술은 그림 1에서 빨간색으로 강조된 내측 반월상공연골인대(MMTL)를 절단하여 관절 불안정을 유도하며, 이 인대는 일반적으로 내측 반월상월판을 경골 고원에 고정시키는 역할을 합니다.

  1. 마취된 쥐를 누운 자세로 놓고 오른쪽 무릎 위에 약 3-5mm 크기의 작은 내측 파슬라 피부 절개를 합니다.
  2. 위에 덮인 연조직을 조심스럽게 해부하여 관절낭을 노출시키세요. 슬개건 내측에 절개를 하고 슬개골을 부드럽게 옆으로 옮겨 무릎 관절을 시각화하세요. MMTL이 내측 반월상월판의 앞뿔과 경골 고원을 연결하는 얇고 인대적인 띠로 나타나는지 확인하세요. 입체현미경을 사용하여 시야를 높이고 관절 연골 손상 위험을 최소화하세요.
  3. 마이크로 가위, #11 메스 칼날, 또는 구부린 주사기 바늘을 사용해 MMTL의 경골 부착부를 조심스럽게 절단하세요. 구부린 주사기 바늘을 사용할 때, 둔한 가장자리가 기저의 관절 연골을 보호하는 데 도움을 줍니다. 내측 반월판의 불안정을 관찰하여 성공적인 절단을 확인한다.
  4. 절개 관절 캡슐을 8-0으로 닫아주세요 흡수성 봉합사를 시술한 후 상처 클립이나 6-0 봉합사로 피부 절개 부위를 봉합합니다.
    참고: 봉합 시 관절 연골을 피하고 절개 부위를 봉합할 때 관절 긴장을 적절히 유지해야 합니다.
  5. 동물이 온열 패드에서 회복할 수 있도록 하고, 완전한 움직임이 회복될 때까지 면밀히 관찰하세요.

3. 쥐에 대한 MMT 수술

참고: 이 수술은 내측 측부 인대(MCL) 절단 후 내측 반월상월판이 완전히 파열되어 관절 불안정성과 진행성 연골 퇴행을 유발하여 골관절증을 유발합니다.

  1. 마취된 쥐를 적절히 위치시키고 오른쪽 무릎 위에 약 6-8mm 길이의 내측 파슬라 절개를 합니다.
  2. 둔탁 해리를 시행하여 근육층을 분리하고 MCL을 명확히 노출시키세요(그림 2).
  3. 수술용 가위를 사용해 MCL의 중간부를 완전히 횡단하세요.
  4. 절단된 MCL을 부드럽게 당겨 기저의 내측 반월판을 노출시킵니다. 미세한 겸자를 사용해 반월판을 잡고 가장 좁은 부위에서 전층 절단을 하여 완전한 찢어짐을 만듭니다.
  5. 연부 조직을 재배치하고 절개 부위를 여러 겹으로 봉합하며, 근육과 근막에는 5-0 흡수성 봉합사를 사용한 뒤, 피부 봉합에는 상처 클립이나 5-0 비흡수성 봉합사를 사용합니다.
  6. 2.5단계에서 설명한 동일한 절차를 따라 동물이 회복할 수 있도록 하세요.

4. 행동 평가

  1. 수술 전 기초 평가를 실시하고, 지정된 수술 후 시점(예: 2주, 4주, 8주)에 재평가를 실시합니다.
    참고: 운영자 간 변동성을 최소화하기 위해, 실험 그룹을 알지 못한 동일한 훈련된 운영자가 행동 검사를 수행했습니다. 각 측정값은 동물당 세 번 반복되었고, 평균값은 분석에 사용되었습니다.
    1. 간소화된 기계적 철수 임계값 검사
      1. 쥐들을 돌출된 철망 플랫폼 위의 개별 구획에 넣고 최소 30분 이상 적응시키고 테스트하세요. 기계적 통증 민감도는 전자 폰 프라이 마취계를 사용해 평가합니다.
      2. 폰 프레이 필라멘트를 사용해 프로브를 쥐의 오른쪽 뒷발바닥 표면에 대고 힘12를 점차 증가시킵니다.
      3. 반응을 기록하며, 긍정적인 반응은 갑작스러운 발을 빼거나 움찔하거나 핥는 것으로 나타난다는 점을 기록하세요. 일관된 반응의 유무를 평가하여 시간에 따른 민감도 변화를 평가합니다.
    2. 보행 분석
      1. 자동 보행 분석 시스템을 활용해 평가하세요.
      2. 동물이 자발적으로 기구의 유리 통로를 건너게 하세요. 유효한 시련이란 동물이 멈추지 않고 일정한 속도로 움직이는 것으로 정의하라. 시스템 소프트웨어가 발자국을 자동으로 식별하고 여러 걸음걸이 매개변수를 계산할 때까지 기다립니다. 자세 단계 지속 시간, 스윙 속도, 발바닥 압력 등 오른쪽(수술된) 뒷다리의 주요 지표를 분석하고, 반대쪽 및 가짜 조작 대조군과 비교합니다.
        참고: 모든 동물은 기초 평가 전에 매일 훈련을 통해 검사 장비에 적응했습니다. 각 동물에 대해 시간대당 세 번의 달리기가 기록되었으며, 동물이 일관된 속도를 유지하며 멈추지 않은 경우에만 유효한 것으로 간주되었습니다. 모든 측정은 훈련된 조작자가 이중 맹검 설계 하에 수행하여 운영자 간 변동성을 최소화했으며, 반복 실행 시 평균 내어 데이터 재현성을 확보했습니다.

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결과

DMM OA 마우스 모델의 특성화 및 검증
1주일간의 적응 기간 후, 그림 1에 나타난 절차를 따라 마우스에서 DMM 유발 골관절염(OA) 모델이 확립되었습니다. 병리학적 및 행동 평가는 수술 후 2주 후에 수행되었습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, 가장 뚜렷한 퇴행성 변화는 내측 대퇴상막관절에 국한되었습니다. 연골 퇴행 정도는 OARSI 점수체계 13,14를 사용하여 추가로 정량화되었으며, 이 시스템은 DMM 모델 그룹에서 대조군에 비해 유의하게 높은 점수를 보였습니다(그림 2B). 모든 OARSI 점수 산정은 실험군에 눈을 가린 병리학자가 수행했습니다. 각 동물별로 내측 구획의 관상 단면을 채취하고, 세 번째 단면마다 분석하...

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토론

이 프로토콜은 두 가지 널리 사용되는 외과적 OA 모델의 유도 및 평가를 위한 표준화된 프레임워크를 제공합니다. 이 모델들은 인간 외상 후 골관절염의 병태생리학적 특징을 매우 밀접하게 재현하여 강한 번역적 관련성을 제공합니다. DMM 모델은 내측 반월상연골 인대의 절단을 포함하는 반면, MMT 모델은 내측 반월상연골을 직접 파열하는 것을 포함합니다. 우리 실험실에서는 DMM 시술이 쥐에서 일상적으로 시행되는데, 이 종은 내측 반월상월판을 정확히 식별하기 어렵고, 완전한 반월상월판 파열은 과도한 연골 손상을 초래할 수 있기 때문입니다. 또한, DMM 모델에서 연골하 뼈 손상이 MMT 모델에 비해 상당히 경미하다는 점을 관찰했습니다. 이는 DMM 모델이 연골 퇴행 및 기전 경로 연구에는 이상적이지만, 골관절염 이하 뼈 재형성 연구에는 덜 적합함을 시사합니다.

DMM과 MMT 시술 모두에서 성공의 중요한 결정 요인은 관절 연...

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공개 사항

모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 저장 중화의과대학 연구 프로젝트(보조금 번호 2025JKJNTZ09)와 중국 국가자연과학기금(보조금) 32401092호의 재정 지원을 받았습니다. 또한 본 연구의 성공에 필수적인 보행 분석 서비스를 제공해 준 항저우신야오생명공학유한회사에도 진심으로 감사의 뜻을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
보행 분석 시스템상하이 신루안 정보기술유한회사(Sha Xin Ruan Information Technology Co., Ltd)XR-FP202
지방식안과 연고
쥐들난징 모형 동물 연구소C57/BL6
통증 테스트 시스템상하이 신루안 정보기술유한회사(Sha Xin Ruan Information Technology Co., Ltd)XR-XZD전자 폰 프레이 마취계
쥐난징 모형 동물 연구소S/D

참고문헌

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