필링, 클리어링, AI 기반 이미지 분석을 이용한 기공 및 표피 특성 특성

요약

이 프로토콜은 표피 필링, 투명화 기법, AI 보조 영상 분석을 활용하여 두 가지 서로 다른 종의 기공과 표피 특성을 비교 평가하는 방법을 제시합니다. 목표는 농업 응용과 광범위한 식물 연구를 위해 기공 기능의 기저 세포 구조를 고처리량, 재현 가능하게 정량화하는 것입니다.

초록

기공 형태와 주변 표피 형질의 정확한 특성 파악은 기공 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 두 가지 상호 보완 기법인 표피 필링과 잎 제거를 사용하여 생태학적으로 구분되는 두 쌍둥이 쌍둥이엽식물인 Fraxinus excelsior 와 Taraxacum officinale의 기공 및 표피 세포 크기, 형태, 밀도를 평가하는 비교 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜에는 비용 및 노동 효율적인 수동 측정(조직 제거 및 필링)을 통한 샘플 준비, 영상 촬영, 형질 정량화, 그리고 AI 지원 영상 분석을 포함한 상세한 절차가 포함되어 있어 고처리량 응용을 촉진할 가능성이 있습니다. YOLOv8 기반 기공 검출 모델, 세포 분할을 위한 일반 딥러닝 도구, 픽셀 기반 분류기라는 세 가지 분할 도구가 각 방법론에서 정확도와 적합성을 평가하였습니다. 수작업 및 AI 분석 모두에서 기공과 투명화 기법 간에 기공과 표피 특성의 유의미한 차이가 일관되게 관찰됩니다. AI 도구는 재현 가능한 정량화를 가능하게 했으며, YOLOv8 기반 기공 탐지 모델(StoManager1)이 기공 특성에 가장 좋은 성과를 내고, 표피 분절을 위한 일반 딥러닝 딥러닝 도구인 세포 분절 연구를 가능하게 했습니다. AI 기반 형질 탐지는 T. officinale 에서 매우 일관성이 높았으나 F. excelsior에서는 제한적이었으며, 결과는 여전히 수동 측정과는 달랐으며, 이는 종별 해부학과 이미지 품질이 방법 적합성에 미치는 영향을 보여줍니다. 이러한 결과는 AI 보조 분석이 기공 및 표피 특성 정량화에 유용한 틀을 제공하지만, 더 넓거나 고처리량 적용 전에 전문가의 검증과 파일럿 테스트가 여전히 필수적임을 시사합니다.

서론

기공은 표피에 있는 미세한 구멍으로, 식물 가스 교환과 증산을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 따라서 기공 기능의 형태학적 기초를 이해하는 것이 작물 성능 향상의 핵심이다^. 기공 구조와 기능에 대한 대부분의 연구가 기공 형태에만 집중하지만, 기공 반응성을 완전히 이해하려면 주변 표피 세포의 크기와 형태를 특성화하는 것도 필요합니다. 이러한 특성의 정확한 정량화는 가스 교환과 작물 개선의 구조-기능 관계를 이해하는 데 근본적입니다.

작물 개선이 점점 더 고급 유전자 편집 방법에 의존함에 따라, 광합성, 내재적 수분 사용 효율성, 탄소 획득에 영향을 미치는 기공과 같은 주요 형태학적 특성들을 이해하는 것이 매우 중요합니다. 이러한 필요성은 특히 지속적인 환경 변화 속에서 시급한데, 가뭄과 폭염이 잦아지는 가뭄과 폭염 속에서 광합성 능력과 수확량을 모두 유지하는 회복력 있는 작물에 대한 수요가 증가하고 있기 때문입니다 ^2,3. 따라서 표준화된 영상 및 분석 프로토콜에 대한 강한 필요성이 있습니다. 바니시/매니큐어를 이용한 기공 벗김은 기공과 표피의 크기, 형태, 밀도를 측정하기 위해 잎 표면 자국을 얻는 가장 간단한 방법입니다 ^4,5,6. 이 절차는 빠르고 비파괴적이어서 샘플을 신속하게 처리할 수 있습니다. 조직 정화 방법은 정맥 네트워크의 동시 특성화와 잠재적으로 잎 수압의 보다 포괄적인 특성 분석을 가능하게 하는 대안적 접근법입니다.

화학적 투명화는 조직을 부드럽게 하고 광학적으로 투명하게 만들어, 기계적 손상 없이 기공과 표피 세포의 현장 영상을 가능하게 합니다. 클리어링은 건조 또는 섬세한 표본을 포함한 다양한 조직 유형에 널리 적용되며, 기공 영상뿐만 아니라 정맥 네트워크, 형광 영상, 내부 해부학적 구조 시각화에도 활용될 수^{있습니다.} 7,8,9,10,11,12 따라서 기공 형질을 다른 기능적 형질과 함께 분석할 수 있게 되었습니다. 유기 용매, 수용액, 과수화, 또는 하이드로겔 임베딩(^13,14,15)을 포함한 다양한 정화 방법이 존재합니다. 이 검사들은 치료 기간, 영상 적합성, 시약 가용성 면에서 차이가 있습니다. 여기서 사용하는 프로토콜은 간단하고 비용 효율적이며 전문 기술이 필요하지 않습니다. 두 기법 모두 화학적 고정, 삽입, 시료 절단이 필요한 광학 현미경이나 주사 전자현미경과 같은 노동 집약적인 방법에 비해 저렴하고 빠릅니다.

기공 및 표피 특성을 분석하는 전통적인 방법은 종종 수작업으로 현미경 이미지를 분할하는 데 의존하는데, 이는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 관찰자 편향이 있어 처리량이 제한되고 분석 파이프라인의 효율이 저하됩니다¹⁶. 더불어, 트리코움과 불규칙한 세포벽과 같은 해부학적 특징은 일관된 형질 정량화에 추가적인 도전 과제를 제기합니다. 자동화된 이미지 분석 도구는 고처리량 데이터 추출에 큰 가능성을 제공하지만, 특정 식물 조직에 최적화되어 있어 잎 종류와 준비 방법 간에 쉽게 전이되지 않습니다. 예를 들어, StoManager1(보조 그림 1)은 YOLOv8 기반 객체 탐지 모델을 사용하여 기공 탐지에 높은 정확도를 제공하지만, 기공 특성에 특화되어 훈련되었습니다. 세포 자세(보조 그림 2)는 동물 세포와 소기관을 기반으로 한 사전 학습 모델(예: cyto, cyto2)과 유사한 입력 데이터가 잘 작동할 때 우수한 성능을 보이는 대형 사전 학습 분할 모델입니다. Ilastik(보조 그림 3)는 사용자 정의 주석에 의존하는 픽셀 기반 분류 도구입니다. Cellpose와 Ilastik 모두 사용자 친화적이지만, 이미지 품질, 배경 아티팩트, 조직 특이적 특징의 차이를 반영하기 위해 재학습이나 미세 조정이 필요할 수 있습니다.

더불어, 기공과 표피 형태는 종 간에 큰 변동성을 보인^다. 기공 밀도와 크기와 같은 특성은 특히 다양하지만, 일반적으로 반비례하여 종 간 기공 동역학 차이를 결정합니다. 더 큰 기공은 밀도 감소를 부분적으로 보완할 수 있지만, 일반적으로^{운동 속도가} 느려 빠르게 반응하는 폭염 속에서는 탄소 동화를 유지하고 과도한 수분 손실을 방지하는 데 중요한 기공 반응이 불리할 수 있습니다. 이러한 변동성은 기공 특성 측정을 복잡하게 만들고, 선택한 프로토콜의 타당성과 AI 기반 결과의 견고성을 저해할 수 있습니다.

이 프로토콜은 두 가지 고전적 준비 기법인 표피 필링과 화학적 클리어링을 특징 분할 및 측정을 위한 현대 인공지능(AI) 및 머신러닝(ML) 도구를 통합합니다. 서로 다른 생태학적 전략을 가진 두 가지 빛을 요구하는 흔한 쌍자잎식물 종(F. excelsior 와 T. officinale)을 사용하여 기공과 표피 특성의 변이를 조사하여 세 가지 방법이 어떻게 비교되는지, 그리고 어디서 잠재적 부정확성이 발생할 수 있는지 평가했습니다. 세 가지 AI 도구인 StoManager1(기공 탐지를 위한 YOLOv8 기반 딥러닝 모델), Cellpose(범용 딥러닝 분할 도구), ilastik(표피 조직을 위한 픽셀 기반 분류기)의 성능을 평가하였습니다. 이러한 통합적 접근법은 기공 및 표피 형질의 재현 가능하고 고처리량 정량화를 가능하게 하여, 생태학 및 농업 연구 모두에서 표현형 분석을 위한 견고하고 확장 가능한 프레임워크를 제공합니다. 하지만 조밀한 트리코움, 두꺼운 큐티클, 낮은 세포-경계 대비와 같은 해부학적 특징은 분할 정확도를 떨어뜨릴 수 있으므로 필링과 클리어링 방법 중 선택할 때, 그리고 AI 기반 정량화 시 고려해야 합니다.

우리가 아는 한, 이 프로토콜은 표피 벗기와 화학적 클리어링 접근법을 여러 AI 기반 분할 도구와 결합하여 기공과 표피 형질 정량화를 직접 비교한 최초의 단계별 프로토콜입니다. 고전적인 현미경 기법과 접근 가능한 ML 워크플로우를 결합함으로써 프로토콜은 사용자 편향을 줄이고 처리량을 높이며 종 간 재현 가능한 표현형 분석을 용이하게 합니다. 이로 인해 이 접근법은 생태학, 작물 개선, 기후 변화 연구에 폭넓게 적용될 수 있으며, 모델 재교육이나 전이 학습을 통한 지속적인 도구 확장의 기반을 제공합니다.

프로토콜

참고: T. officinale 및 F. excelsior 잎 채집에 대해 별도의 허가나 승인이 필요하지 않았으며, 이 비보호 종들은 공개 접근 가능한 정원 지역에서 채취되었습니다. 모든 샘플 수집은 기관 및 지역 지침을 준수했습니다.

1. 식물 재료 수집

1. 비교 분석을 위해 건강한 잎을 선택하세요. 현재 실험에서는 기공 분포가 상반되는 두 쌍자엽 종의 건강하고 햇빛에 노출되는 성숙한 잎을 선정했습니다: 하부 잎 표면에만 기공을 가진 하기공 나무 F. excelsior와 양조직성 다년생 초본 T. officinale입니다.
2. 샘플 종류나 위치마다 3-5장의 복제 잎을 채취하세요.
3. 깨끗한 가위나 면도날로 잎을 떼어내세요. 잘린 잎은 즉시 물에 넣어 탈수를 예방하세요.
4. 채집 후에는 잎자루를 완전히 물에 담가 4°C에서 보관하세요.
5. 프로토콜 섹션 2 또는 3을 48시간 이내에 진행하세요.

2. 기공 인상 필링 준비 및 관찰

참고: 정화 과정에서 발생한 모든 화학 폐기물은 기관 및 지역 안전 규정에 따라 처리되었습니다. 글루타알데히드 함유 용액은 별도로 수집되어 유해 화학 폐기물로 폐기되었습니다. 수산화나트륨(NaOH) 용액은 폐기 전에 허용되는 경우 pH 6-8로 중화되었습니다. 희석된 표백제와 에탄올 용액은 기관 및 시 규정이 허용하는 곳에 찬물과 함께 배수구에 버렸습니다. TBO 용액은 지역 지침에 따라 화학 폐기물로 수집 및 폐기되었습니다. 사용자는 승인된 폐기 절차에 대해 기관 안전 사무소에 문의해야 합니다.

1. 필요하다면 선택한 잎 표면을 물로 부드럽게 헹구어 먼지나 이물질을 제거합니다. 즉시 여과지나 부드러운 종이 타월로 잎 표면을 닦아 과도한 수분을 제거하세요. 자연 건조는 조직이 수축하여 기공과 표피 세포의 크기 측정이 부정확해질 수 있으므로 피하세요.
2. 현미경 슬라이드에 샘플 세부사항(예: 종, 잎 면, 준비 날짜)을 영구 마커로 표시하여 각 샘플의 추적 가능성을 보장하고, 향후 사용을 위해 샘플을 적절히 보관할 수 있도록 합니다.
3. 비분비선(털이 많은) 트리코움을 가진 종의 경우, 껍질 준비 전에 면도날로 트리코움을 잎 표면에서 제거해야 합니다. 트리코움은 세포 경계를 가리고 이미지 품질을 저하시킬 수 있습니다(그림 1).
4. 작은 브러시를 사용해 투명하고 팽창성 없는 매니큐어를 얇고 고르게 발라('늘기'나 '벗겨내는' 포뮬러는 피하세요). 잎 끝과 밑부분은 피하고 항상 잎 중앙 부분을 선택해 껍질 준비를 하세요.
5. 매니큐어가 완전히 마를 때까지 기다려 주세요(보통 실온에서 2-5분). 장기간 노출되면 조직 변색(예: 부드러운 잎에 붉은 빛이 도는 현상)이 발생할 수 있으며, 이는 최종 껍질에서 확인할 수 있으며, 균일한 색채가 필요한 후속 분석에 방해가 됩니다.
6. 마르면 코팅된 부분에 투명 테이프 스트립을 붙입니다. 매니큐어의 한쪽 가장자리부터 시작해 점차 테이프를 표면 위에 펴고, 부드럽게 눌러 접착력을 높이고 공기 방울이나 주름을 방지하세요. 지문을 피하려면 니트릴 장갑을 착용하세요.
7. 네일 폴리시 필름과 함께 테이프를 조심스럽게 떼어내세요(표피 인상).
8. 테이프를 접힘이나 겹치지 않도록 깨끗한 현미경 슬라이드에 붙이세요.
9. 준비된 슬라이드는 먼지와 직사광선으로부터 보호한 실온에 보관하세요.
10. 복합 광학 현미경으로 400배 배율로 슬라이드를 관찰하세요. 소프트웨어 가이드에 따라 이미지와 관련 축척을 저장하세요.

3. 승인된 섹션 준비 및 검토

1. 잎 조각을 약^{1cm 2}. 모든 작업을 니트릴 장갑을 끼고 연기 후드 아래에서 작업하세요.
2. 샘플을 라벨이 붙은 바이알로 옮기고, 고정액(4% 글루타르 알데히드, 0.1 M 인산 완충제, pH = 6.9)으로 덮어 4°C에서 24시간 보관합니다(고정액 준비 시 표 1).
3. 고정액을 피펫으로 제거하고 샘플을 증류수로 덮으세요. 30분 정도 떠나세요. 세 번 반복합니다(그림 2A-C).
4. 물을 제거하고 샘플을 1M NaOH 용액으로 덮으세요(20g NaOH를 0.5L 증류수에 녹이세요).
5. 잎을 제거하는 동안 NaOH 용액은 녹색으로 변합니다. NaOH 용액은 하루에 한 번 신선한 용액으로 교체하세요. 3일에서 4일 동안 계속하거나, 샘플이 연한 노란색으로 변하고 NaOH 용액이 투명해질 때까지 이어집니다(그림 2D-F).
6. NaOH 용액을 제거하고 샘플을 표백제(5% NaClO)로 덮으세요. 이 농도의 상업용 가정용 표백제가 적합합니다.
7. 샘플을 표백제에 1-2분간 배양하세요. 샘플은 흰색으로 변하고 반투명해집니다(그림 2G-I).
8. 이전 용액을 제거하고 샘플을 증류수로 2분간 덮어주세요. 샘플을 다음과 같이 등급 증류수-에탄올 시리즈로 탈수합니다: 75:25, 50:50, 25:75, 그리고 100% 에탄올.
9. 에탄올을 제거하고 샘플을 3% 알코올 용액인 톨루이딘 블루 O(TBO, 100% 에탄올 100mL에 3g TBO를 녹여 사용)로 덮습니다. 하룻밤 떠나세요.
10. 염색액을 제거하고 샘플을 100% 에탄올로 2분간 덮으세요. 이 단계를 등급이 정해진 증류수-에탄올 시리즈를 사용하여 다음과 같이 반복합니다: 25:75, 50:50, 75:25, 마지막으로 증류수(그림 2J-L). 정리 과정과 관련된 흔한 실수와 문제 해결 단계에 대해서는 그림 3을 참고하세요.
11. 샘플을 4°C의 증류수에 보관해 관찰하세요.
12. 샘플을 유리 슬라이드에 옮기고, 증류수를 한 방울 넣은 뒤 유리 커버슬립으로 덮어 현미경 관찰과 영상 촬영을 합니다.
13. 복합 광학 현미경으로 400배 배율로 슬라이드를 관찰하세요. 소프트웨어 가이드에 따라 이미지와 관련 축척을 저장하세요. 자세한 내용은 자료 표를 참조하세요.

4. 영상 분석 및 측정

1. 이미지 처리 및 분석에는 Fiji²³(ImageJ 배포판, 버전 1.54p)을 사용하세요.
2. Line 도구를 사용해 스케일 바 위에 선을 그린 후 Analyze > Set Scale을 선택하고, 알려진 거리를 스케일 바 길이로 수정한 후 길이 단위를 μm으로 변경합니다.
3. 측정 값을 분석> 가세요. 면적과 페렛의 직경 옵션을 반드시 확인하세요.
4. 폴리곤 선택 도구를 사용해 관심 있는 객체를 윤곽선으로 표시하세요. M 키를 눌러 측정값을 기록하세요.
5. 피지에서 다음 기공 및 표피 형질을 측정하고, 제거된 샘플과 기공 필링을 모두 계산합니다(그림 3).
6. 기공의 개수(Ns)를 계산하세요.
   1. 평균 기공 면적(As)을 산출합니다.
   2. 평균 기공 폭(Ws)을 페렛의 최소 직경을 사용하여 산출합니다.
   3. 기공 밀도(SD)는 다음 공식에 따라 계산합니다:
      
      ; 단위 Ia(측정을 위해 선택된 잎 면적, mm²)당
   4. 평균 표피 세포 면적(Ae)을 산출합니다.
   5. 다음 공식을 사용하여 표피 세포 밀도(ECD)를 산출합니다:
      

5. 통계

1. 표본 그룹 간 차이를 검사할 때는 ANOVA와 Tukey의 HSD 사후 검정을 사용하세요.
2. R²¹에서 모든 통계 분석을 수행하세요.
3. 종별로 총 3개의 복제 잎을 분석하고, 각 잎에서 3개의 껍질을 확인하세요.

6. AI 보조 분석

1. 세분화를 위해 머신러닝 도구를 선택하세요.
   1. 목표 구조(기공 또는 표피 세포), 이미지 품질, 분석 목표에 따라 적절한 머신러닝 기반 분할 도구를 선택하세요.
   2. 기공 특성의 자동 탐지 및 측정을 위해 기공 특화 딥러닝 모델을 사용하고, 표피 세포 분할에는 일반 딥러닝 또는 픽셀 기반 분할 도구를 사용하세요.
   3. 특정 소프트웨어 구현에 대해서는 머신러닝 도구 및 소프트웨어 섹션(보조 파일)을 참조하십시오.
   4. 대규모 분석 전에 일부 이미지에 대해 파일럿 테스트를 수행하여 세분화 성능을 평가하고 오탐의 잠재적 원인을 식별합니다.
2. 컴퓨팅 환경을 준비하세요.
   1. 8-12코어 프로세서, 최소 32GB RAM, 그리고 최소 24GB VRAM의 NVIDIA CUDA 지원 GPU가 장착된 워크스테이션을 사용하세요.
   2. 주석 작성과 시각적 검사를 용이하게 하기 위해 고해상도 디스플레이(가급적 4K)를 사용하세요.
   3. 개발자의 지침에 따라 선택한 모든 소프트웨어 도구를 설치하고, 재현성을 보장하기 위해 소프트웨어 버전을 기록하세요.
3. 머신러닝 분석을 위한 이미지를 준비하세요.
   1. 현미경 이미지를 TIFF 또는 PNG 형식으로 가져오고, 가능하면 8비트 또는 16비트 그레이스케일 이미지를 사용하세요.
   2. 각 이미지에 눈에 띄는 스케일 바가 포함되어 있거나 분석 전에 공간적으로 보정되었는지 확인하세요.
   3. 잔해, 주름, 공기 방울이 적고, 조명이 심지어 심지어 조명이 있으며, 세포 경계가 명확히 정의된 관심 영역을 선택하세요.
   4. 흐릿한 가장자리, 강한 그림자, 낮은 대비가 있는 이미지는 분절 정확도를 떨어뜨리므로 제외하세요.
4. 기공 분절을 수행하세요.
   1. 스토마타 전용 딥러닝 모델(보조 파일 섹션 1)에 이미지를 로드합니다.
   2. 종과 이미지 해상도에 따라 객체 크기 제한과 신뢰 임계값 등 검출 매개변수를 설정하세요.
   3. 자동화 검출을 실행하여 기공 복합체를 분할하고 기공 수, 면적, 페렛 직경과 같은 출력 지표를 추출합니다.
   4. 하위 분석을 위한 세분화 마스크와 측정 테이블을 내보내는 기능. 세분화 오버레이를 시각적으로 점검하고, 필요하다면 잘못 감지된 객체를 수동으로 제외하세요.
5. 표피 세포 분절을 수행하세요.
   1. 이미지를 일반 딥러닝 분할 도구나 픽셀 기반 분류기(보조 파일 섹션 2-4)에 불러와야 합니다.
   2. 표피 세포, 세포 경계, 배경의 수동 주석 예시를 포함한 대표 이미지를 사용해 모델을 훈련하거나 미세 조정하세요.
   3. 분할을 실행하여 객체 마스크를 생성하고, ImageJ/Fiji 또는 동등한 이미지 분석 소프트웨어에서 후처리를 위해 마스크를 내보내세요.
   4. 크기 기반 또는 분위수 기반 필터링을 적용하여 작은 거짓 양성 객체를 제거하고, 눈으로 검사를 통해 분할 정확도를 검증한 후 세포 면적과 세포 밀도와 같은 표피 세포 지표를 추출합니다.
6. 매개변수를 문서화하고 품질 관리를 수행하세요.
   1. 분석 중 사용된 모든 소프트웨어 버전, 매개변수 설정, 필터링 임계값, 하드웨어 사양을 기록하세요.
   2. 대표성 세분화 오버레이를 유지하여 세분화 품질을 문서화하세요.
   3. 통계 분석이나 데이터 보고 전에 자동 세분화 출력을 시각적으로 검증합니다.
7. 모든 ML 처리를 위한 이미지 준비
   1. 샘플 이미징
      참고: ML 기반 세분화는 생물학적 맥락이 아닌 강도 구배, 가장자리 연속성, 일관된 객체 기하학에 의존하기 때문에, 이미지 전처리와 영역 선택이 모델 성능과 오류 구조를 결정하는 데 결정적입니다.
      1. 투명하거나 벗겨진 잎 표면의 고해상도 이미지를 스케일 바로 촬영하세요. 좋은 머신러닝 워크플로우를 위해서는 측정 가능한 객체가 이미지 전반에 걸쳐 선명하고 연속적이며 고대비를 유지하도록 하세요.
   2. 지역 선택 및 이미지 품질
      참고: 6.7.1절의 이미지 획득 이후, 이미지는 육안으로 검사되며, 이미지 크기가 허용되는 경우 아티팩트가 없는 관심 영역을 수동으로 선택하여 후속 분할을 진행합니다. 잔해, 주름, 기포, 불균형한 조명 등 인공물이 적은 관심 지역을 선택하세요. 기공 모델(예: StoManager1)의 경우, 명확한 기공 가시성과 명확한 가드 셀 실루엣을 우선시합니다. 표피 모델(예: Cellpose, Ilastik)의 경우, 세포 윤곽선을 따라 안정적인 강도 구배를 보장해야 합니다; 불연속적이거나 대비가 낮은 가장자리는 분할 성능을 크게 저하시킵니다. 경계가 명확하지 않은 이미지는 분할 전에 제외하거나 재처리해야 합니다.
   3. 파일 형식
      TIFF 또는 PNG 형식으로 저장 파일을 보관하세요(세그먼트를 위해 8비트 또는 16비트 그레이스케일 권장).
   4. 선택적 이미지 향상
      1. 경계가 약하면 ImageJ/Fiji에서 대비를 높이거나 배경을 빼세요.
      2. 엣지 기하학에 집중하세요. 이 부분은 셀 경계로 해석되는 거짓 그라데이션을 만들 수 있습니다.
      3. 이러한 조정은 데이터셋 내 모든 이미지에 일관되게 적용하세요.
         참고: 그림자, 후광, 불균형한 배경 그라데이션은 머신러닝 모델이 셀 경계로 오인할 수 있는 인위적인 강도 전환을 만들 수 있으므로 가장자리 기하학에 특히 주의를 기울여야 합니다.
8. StoManager1 (v1.0.0 GUI 버전)
   참고: StoManager1은 합성곱신경망(YOLOv8-seg-x)을 사용하여 식물 잎 기공의 자동화된 고처리량 탐지, 측정 및 분석을 가능하게 합니다. 이 도구는 다양한 이미지 유형에서 주요 기공 지표(면적, 밀도, 기공/보호 세포 비율, 집계 지수 등)를 정량화하여 수작업과 편향을 줄이고 대규모 생태학 및 생리학 연구를 지원합니다. 사용자 친화적인 윈도우 앱이 제공되며, 선택적 후처리(보조 파일 섹션 1)²³ 외에는 코딩 기술이 필요 없습니다.
   1. StoManager1 실행 중: 설치 및 설정
      1. GitHub(https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) 또는 독립 실행형 Windows 애플리케이션((보조 파일 섹션 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³을 통해 접근 가능합니다.
      2. 호환 가능한 라이브러리 버전(파이썬 의존성) 확인; 다른 ML/이미지 소프트웨어가 설치되어 있으면 충돌이 발생할 수 있습니다.
   2. StoManager1을 GUI 또는 명령줄 인터페이스를 통해 시작하세요.
   3. 잎 이미지가 포함된 입력 디렉터리를 선택하세요.
   4. 모델 선정; 세분화 기반의 더 상세한 지표는 YOLOv8-seg-x 모델을 확인해 보세요. 경계 상자 모델(YOLOv3)에서는 체크하지 않은 상태로 두세요. 미터 수를 줄이세요.
   5. 파라미터 튜닝; 이미징 방식이나 종에 따라 검출 임계값, 이미지 해상도, 마스크 지연, 물체 크기 제한을 필요에 따라 조정하세요. 일부 기공 대상이 탐지되지 않은 상태로 남아 있을 때는 기본 매개변수를 사용해 주로 (1) 진짜 기공을 더 많이 회복하기 위해 탐지 신뢰 임계값을 낮추고 거짓 양성 검사를 하는 것; 그리고 (2) 이미지 해상도를 높이는데, 더 큰 값은 작은 기공 검출을 개선하지만 계산 수요가 증가하는 대가를 치릅니다.
   6. 런 세분화:
      1. " 과정 시작"을 클릭하여 기공과 전체 기공을 감지, 분할, 측정하세요.
      2. " 통계 분석"을 클릭하여 그룹 단위 통계를 처리하세요.
   7. 결과를 수집하세요. 출력은 YOUR_OUTPUT_PATH/예측-출력/Output_csv/ (세분화 모드) 또는 바로 YOUR_OUTPUT_PATH(경계 박스 모드)에 저장됩니다. CSV 파일은 객체별 및 요약 지표를 포함하며; 마스크와 결과 이미지도 생성됩니다.
   8. 배치 처리 시작.
   9. 완료 후 출력물: 세그멘테이션 마스크와 이미지별 CSV 결과 파일을 수집합니다. 이미지별 결과에는 기공 수와 기공 면적, 페렛 직경(최대/최소), 가드 세포 지표, 집계/균등/발산 지수, 모공/가드 세포 비율이 포함됩니다.
   10. 엑셀, R, 파이썬을 사용해 추가 통계와 시각화를 위해 결과물을 검토하세요.
   11. 품질 관리; 마스크와 오버레이를 시각적으로 점검하세요. 필요하다면 크기, 모양, 또는 수동 관리별로 이상치 객체를 제거하세요(아래 참조).
       참고: Cellpose와 ilastik의 상세 프로토콜 및 후처리 단계는 보충 파일에 제공되어 있습니다. 대규모 데이터셋과 복잡한 이미지를 최적의 성능을 위해 8-12코어 프로세서, 최소 32GB RAM, 그리고 최소 24GB VRAM의 NVIDIA CUDA 지원 GPU를 사용하는 시스템을 권장합니다. 효율적인 주석 작성과 시각화를 위해 크고 고해상도 디스플레이(가급적으로 4K)도 강력히 권장됩니다.

결과

필링과 클리어링 결과 비교

T. officinale와 F. excelsior 모두 샘플이 제거되었는지, 벗겨졌는지에 따라 기공과 표피 특성에 변동이 있음을 보였다(그림 4). 투명화된 샘플은 일반적으로 더 선명한 세포 경계와 가드 세포 형태 및 구멍의 명확한 시각화를 제공했으나, 겹치는 조직층이 때때로 작은 기공을 가리고 크기 추정치가 위쪽으로 편향되기도 했습니다. F. excelsior에서는 제거된 샘플에서 평균 기공 면적과 기공 너비가 필링보다 유의하게 높았으나, T. officinale에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. F. excelsior 껍질을 벗긴 샘플에서 기공 밀도가 유의하게 높았으나, T. officinale에서는 방법 효과가 관찰되지 않았습니다. 표피 세포 면적은 두 종 모두 차이가 없었으나, F. excelsior 껍질을 벗긴 표피 세포 밀도는 약간 더 높았습니다.

전반적으로 방법 의존적 차이는 형질과 종에 특이적이었으며, 특히 기공 크기가 변하는 경우(예: 발달 중인 잎에서) 껍질이 기공 측정에 신뢰할 수 있는 선택임을 시사하며, 표피 형질은 거의 영향을 받지 않았다(그림 5).

AI 결과와 그것이 필링 및 클리어링 방법과 어떻게 연관되는지도

기공 특화 모델인 StoManager1은 벗겨진 영상에서 기공을 더 신뢰성 있게 검출한 반면(그림 6), 투명 샘플에서는 성능이 현저히 저하되었습니다(그림 7). StoManager1의 다양한 제제 방법 성능을 추가로 평가하기 위해, T. officinale 와 F. excelsior 에서 필링과 투명 이미지를 모두 사용하여 기공 형질 검출을 비교하였습니다(그림 8). T. officinale에서는 제제 방법 전반에 걸쳐 기공의 존재와 밀도를 신뢰성 있게 감지했습니다. 그러나 결과 값은 수동 측정과 상당히 달랐습니다(표 2 및 그림 5 , 8). 대부분의 기공 특성은 필링된 샘플과 투명한 샘플 간에 유의미하게 차이가 있었다(p < 0.05)로, 이는 AI 탐지 파이프라인이 준비 방법에 매우 민감하며 대규모 적용 전에 신중한 검증이 필요함을 나타낸다. 반면 F. excelsior에서는 암측 기공이 없어 검출이 복측면에 제한되었고, 투명화된 샘플에서는 검출이 일관되지 않고 빈번한 위양성이 있었습니다(그림 8). 이 결과는 종별 해부학적 특징과 이미지 품질이 AI 기반 분석의 효과에 강한 영향을 미친다는 점을 강조합니다. Cellpose(그림 9A)와 Ilastik(그림 9B)과 같은 일반 ML 도구는 투명한 이미지보다 벗겨진 표피 세포를 더 효과적으로 분절시켰습니다. 하지만 두 도구 모두 필링과 클리어링 두 준비 기법 모두에서 특히 저대비 조건이나 세포 윤곽이 흐릿할 때 수많은 오양성을 발생시켰습니다. 이런 경우, 불분명한 기공이나 표피 윤곽선이 여러 개의 작은 물체로 과분할되어 개별 표피 세포로 잘못 분류되는 경우가 많았습니다( 그림 10 참조). 따라서 후처리가 필수적이며, 단순히 이상치 제거뿐만 아니라 상위 분위수에 의한 필터링도 포함하여 신뢰성 있게 식별된 세포를 유지합니다.

그림 1: 면도날을 이용한 삼모 제거 전후의 F. carica 잎 기공 껍질. 큰 트라이코움은 껍질에 자국을 남기며, 공기 주머니를 형성해 표면이 고르지 않게 만들고 일관된 초점을 방해할 수 있습니다(큰 회색 점으로 보입니다). F. carica 는 털이 많은 잎에도 프로토콜을 확장하기 위해 예외로 포함되었습니다. (A) 200배 배율에서 트리코움 제거 전 이미지가 트라이코움 자국에 의해 부분적으로 가려집니다. (B) 트리코움 제거 후 이미지 품질이 향상됩니다. (C) 트리코움 제거 전 400배 확대 이미지에서 트리코움 자국이 대부분 막혀 있습니다. (D) 면도날로 트리코움 제거 후 영상에서 폐색이 최소화됩니다. 스케일 바는 100 μm(A, B)와 50 μm(C, D)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 청산 프로토콜의 연속 단계. T. officinale, F. excelsior, F. carica의 대표 이미지는 정화 프로토콜의 연속적 단계를 보여줍니다. (A-C) 신선한 잎사귀. (D-F) 나오와 정리 후 떠난다. (G-I)는 NaClO로 표백한 후 떠난다. (J-L)은 톨루이딘 블루 O로 염색한 후 떠납니다. 이 시각적 도구는 다음 단계로 넘어가기 전에 예상되는 샘플 상태를 보여주며, 종 간 프로토콜 변동성을 강조합니다. F. carica는 더 넓은 범위의 잎과 정맥 형태에 대한 프로토콜 적용 가능성을 보여주기 위해 예외 종으로 포함되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 기공 및 표피 형질의 측정 예시. 측정된 형질은 이미지에 다음과 같이 나타난다: As = 기공 면적; Ls = 기공 길이; Ws = 기공 폭; Ae = 표피 세포 면적. 기공 밀도와 표피 세포 밀도는 프로토콜에 설명된 표시 영역 내에서 계산되었습니다. 400배 배율로 촬영하세요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 클리어링 프로토콜과 필링 프로토콜로 얻은 이미지 비교. T. officinale 와 F. excelsior 의 대표 이미지로, 기공과 기공 필링 이미지를 비교하여 기공과 표피 세포의 크기와 밀도의 가시성과 변동성을 보여줍니다. 스케일 바 50 μm, 그리고 400배 배율로 촬영됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 투명화 프로토콜과 필링 프로토콜 간 수동 형질 측정 결과 차이. T. officinale 와 F. excelsior에서 클리어링과 표피 필링 방법 간 기공 및 표피 특성 차이를 보여주는 박스 플롯. (A) 평균 기공 면적, (B) 평균 기공 폭, (C) 기공 밀도, (D) 평균 표피 세포 면적, (E) 표피 세포 밀도. 별표는 통계적 유의성 수준을 나타냅니다(P < 0.05; *P < 0.01; **P < 0.001). 통계적 유의성은 일원 ANOVA를 사용한 후 Tukey의 HSD 사후 검사를 통해 평가하였습니다. 그룹별 표본 크기: n = 3-5. 약어: As = 기공 면적; Ws = 기공 폭; SD = 기공 밀도; Ae = 표피 세포 면적; ECD = 표피 세포 밀도. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 껍질 샘플에 대한 기공 검출 모델을 사용한 분절 결과 예시. 성숙한 그늘에 노출된 잎의 아래쪽 T . officinale 껍질을 벗긴 샘플에 대한 StoManager1 분할 결과가 우수하여 우수한 탐지 정확도를 보였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: 배출된 샘플에서 기공 검출 모델을 사용한 분할 결과 예시. StoManager1의 분절 결과는 성숙한 그늘에 노출된 잎의 하부인 T. officinale 샘플에 대해 제거되었으며, 껍질을 벗긴 샘플에 비해 검출 정확도가 저하됨을 보였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 8: 클리어링과 필링 프로토콜 간 AI 보조 형질 측정 결과 차이. T. officinale 및 F. excelsior에서 StoManager1이 처리한 이미지에서 AI가 분석한 기공 해부학적 특성 측정을 보여주는 박스플롯. 형질에는 기공 면적(As), 기공 너비(Ws), 기공 길이(Ls), 기공 밀도(Ds)가 포함됩니다. 단위는 그림 5와 같습니다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA를 사용한 후 Tukey의 HSD 사후 검사를 통해 평가하였습니다. 별표는 통계적 유의성 수준을 나타냅니다(P < 0.05; *P < 0.01; **P < 0.001). 그룹별 표본 크기: n = 3-5. 약어: As = 기공 면적; Ws = 기공 폭; Ls = 기공 길이; Ds = 기공 밀도. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 9: 범용 딥러닝 도구와 픽셀 기반 분류기를 사용한 분할 스크린샷. (A) 일반 딥러닝 도구(Cellpose(cyto2))와 (B) 픽셀 기반 분류기(ilastik)를 이용한 F. excelsior 샘플(아브사이드 잎 표면) 분할. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 10: 잎의 복측 면(F . excelsior ) 껍질을 벗긴 샘플의 Ilastik 분할 마스크, 다수의 위양성 결과. 작은 점들은 별개의 표피 세포로 잘못 분류됩니다. 후처리 중에는 크기 기반 임계값을 설정하기 위해 수작업(시각적) 검사가 필요합니다. 이를 통해 오탐을 효과적으로 걸러냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

해결책	준비	최종 권
버퍼 1의 베이스	7.12g (Na2HPO4 *2H2O) 200 mL 디스트에 투여. H2O	200 mL
버퍼 2의 베이스	200 mL 디스트에 7.12 g Na2HPO4 *2H2O를 투여합니다. H2O	200 mL
인산염 완충제	염기 1 36 mL, 염기 2 14 mL + 디스트(dist) 50 mL를 혼합합니다. H2O	100 mL
고정액	5% 글루타알데히드 9.25 mL에 인산염 완충제 12.5 mL, 디스트트 28.25 mL를 혼합합니다. H2O	50 mL

표 1: 고정 용액 레시피²⁴. 이 연구에서 사용된 해의 구성.

종	사이드	방법	남자 (아스)	AI (As)	맨 (Ws)	AI (Ws)	맨 (L)	AI (Ls)
프락시누스	복축	필	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
타락사쿰	복축	허가 완료	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
타락사쿰	복축	필	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
타락사쿰	아액시얼	허가 완료	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
타락사쿰	아액시얼	필	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

표 2: 수동 측정과 AI에 대한 지시적 비교. ML(StoManager1) 스케일링 결과. 인간과 AI는 수동적이고 AI(StoManager1) 결과를 표시합니다. 단위는 그림 5와 같습니다. 수동 측정과 AI 측정은 크게 다릅니다. 기공이 누락된 경우(예: adaxial F. excelsior) 또는 검출 실패(예: 세포 윤곽이 흐릿해 기공이 더 어려웠음) 등 다양한 이유로 일부 비교가 불가능합니다.

보충 그림 1: 잎 제거 중 결과에 영향을 미치는 흔한 실수 예시들. 문제 해결을 위한 이미지 제시: (A) 3.10 섹션 중 샘플의 불완전한 재수화로 인한 불균일한 염색; (B) 화학적으로 처리된 매우 취약한 샘플의 부적절한 취급으로 인한 기계적 손상; (C) 3.5 구간 중 엽록소가 완전히 제거되지 않아 샘플 중앙에 녹색 빛이 나타난다. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: StoManager1 사용자 인터페이스 예시. StoManager1 사용자 인터페이스 스크린샷으로, 입력 설정 및 결과 표(왼쪽), 원본 이미지(오른쪽 상단)와 기공 검출 오버레이(오른쪽 아래, T. officinale 껍질 샘플의 액사이드 표면)가 포함된 현미경 뷰. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 3: Cellpose 사용자 인터페이스 예시. GUI를 통해 진행 중인 셀포즈 분할의 스크린샷으로, 변수 변경 가능한 매개변수(예: 모델 선택 - 권장 사전 학습된 cyto2 모델 또는 맞춤형 학습 모델, 임계값, 셀 직경 보정)를 사용했습니다. 표피 세포에 대한 감독 하에 수동 주석을 사용해 각 세포를 고유한 색상으로 강조하여 모델 보정을 안내합니다. 오버레이는 F. excelsior 복쪽 표피 필의 분절 모습을 보여줍니다. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 4: 일라스틱 세분화 과정. 오버레이는 F. excelsior 복부 표피 필링 이미지에서 픽셀 기반 분류를 보여줍니다. (A) 진행 중인 일라스틱 분할 스크린샷으로, 수동 분류된 클래스(표피 세포(노란색), 세포 윤곽선(파란색), 그리고 삼모(빨간색)과 같은 비표피 배경을 포함한 훈련 과정을 보여주는 시각화. (B) 표피 분류기(노란색)만 보여주는 스크린샷으로, 분류기가 개별 표피 세포를 분리하는 방식을 보여줍니다. 특히 대비가 낮거나 조명이 고르지 않은 영역에서 여러 개의 거짓 양성 '아주 작은' 검출이 존재하는 것을 주목하세요. (C) 윤곽 클래스(파란색)만 보여주는 스크린샷으로, 분류기가 주변 표피 조직으로부터 세포 경계를 분리하는 방식을 보여줍니다. 일부 윤곽선은 연속적이지 않으며, 특히 낮은 대비나 불균일한 조명 영역에서 여러 번의 거짓 양성 '아주 작은' 검출이 발생한다는 점에 유의하세요. (D) 배경 클래스를 보여주는 스크린샷. 마스크는 기공 복합체, 분비선 삼목체, 기타 이물질(빨간색)을 강조하고 표피 세포체는 제외합니다. 표피 영역 내에서 수많은 작은 거짓 양성 '미세' 발견이 관찰되며, 이는 회색조 인공물과 텍스처 기반 오분류에서 발생합니다. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 5: 셀포즈 훈련 설정. 투명화된 T. officinale 샘플(양쪽 잎 표면)에 대한 Cellpose 훈련 설정(GUI) 예시로, 조정 전 기본 모델 매개변수를 보여줍니다. 사전 학습된 cyto2 모델이 선택되며, 학습률은 0.1과 100 학습 에포흐(기본값)로, 각각 모델 가중치 업데이트 속도와 훈련 패스 수를 결정합니다. 이러한 기본값은 일반적으로 수정되어 학습 시간을 줄이고 모델을 식물 표피 형태에 맞게 조정합니다(예: 학습률 = 0.15; 에포흐 = 12). 하지만 에포크 번호가 낮으면 탐지 성능이 떨어지고 오탐이 증가할 수 있습니다. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 6: 세포 '라벨' 마스크. Cellpose "라벨" 마스크를 벗긴 F. excelsior 샘플(복측 잎 표면)에 적용하며, 각 분할된 객체에 고유 식별자를 부여한 감독 훈련 결과를 보여줍니다. 표피 세포(e로 표시됨)가 우세하며, 기공 보호 세포 쌍(g으로 표시됨)도 발견됩니다. 트라이코움이 표피 세포(왼쪽 위)나 기공(중앙 하단)으로 잘못 분류된 경우에는 위양성이 나타나며, 이미지 일부 부분에서 표피 세포가 표시되지 않은 경우 거짓 음성도 나타납니다. 이 마스크 유형은 감독 모델의 하위 정량화 및 정제에 사용됩니다. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 7: ImageJ/Fiji에서 분절된 표피세포의 정량화. 껍질을 벗긴 F. excelsior 샘플(복측 잎 표면)에 대한 일라스틱 픽셀 분류 후 분절된 표피 세포 정량화를 보여주는 스크린샷. (A) 내보내진 마스크에서 각 검출된 픽셀 클러스터는 개별 입자에 해당하여, 객체 수준 지표(예: 면적, 주변 값, 페렛 직경)를 자동으로 추출할 수 있습니다. 결과 창(하단)에는 수천 개의 객체에 대한 원시 측정값이 표시됩니다; "작은" 점 잡음과 단편적인 윤곽에서 발생하는 작은 입자의 수가 매우 많다는 점에 주목하라, 이는 수많은 거짓 양성의 존재를 나타낸다. 이러한 인공물은 후속 생물학적 정보 필터링을 통해 진정한 표피 세포를 분리해야 하류 통계 분석이 진행됩니다. (B) ImageJ/Fiji에서 일라스틱 분할된 표피 객체의 영역 기반 필터링. 작은 조각과 노이즈는 최소 면적 임계값을 150-350 μm²로 적용하여 패널 A의 필터링되지 않은 마스크에 비해 검출된 입자 수를 약 10배(10배) 줄입니다. 이 필터링 단계로 미세한 위양성을 상당히 제거하지만, 불완전한 분류는 여전히 존재합니다: 단편화된 윤곽선과 잔여 비표피 요소가 남아 있어 원형 임계값이나 생물학적 정보 검사 후 검사와 같은 추가 정교화가 필요합니다. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 8: ImageJ/Fiji에서 Cellpose "라벨링" 마스크의 후처리 과정. Labels to ROI 플러그인을 사용해 F . excelsior 샘플(잎 표면)을 벗기면, 마스크 내 각 분절된 물체를 관심 영역(ROI)으로 변환하여 표피 세포와 기공 보호 세포 복합체를 개별 검사 및 측정할 수 있게 합니다. ROI는 원본 현미경사진(왼쪽)에 겹쳐져 있고, 결과 창(오른쪽 아래)에는 셀 단위 지표(예: 면적, 페렛 직경, 둘레)가 표시됩니다. 이 단계는 생물학적 정보를 바탕으로 한 큐레이션을 가능하게 하여, 각 ROI가 진짜 표피 세포에 해당하는지 검증하고, 임계값 필터링 후에도 남아 있는 트리코움이나 잘못 분절된 기공과 같은 인공물을 버려 후속 분석 단계에 정보를 제공합니다. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

일관된 기공 측정을 위해서는 표준 결과를 위해 중심 층에서 벗겨내는 것이 좋으며, 주요 정맥은 피해야 합니다. 기공 밀도는 잎 밑부, 끝, 가장자리로 갈수록 크게 변하기 때문입니다^25,26. 신선한 잎이 가장 신뢰할 수 있는 껍질을 제공합니다. 단, 수축하지 않는 투명 매니큐어와 고품질 투명 테이프를 사용해 변형이나 인위물을 방지해야 합니다. ~12시간 이상 지연되면 탈수로 인해 윤곽선이 낮아집니다. 필링은 임시로 고정되어 공기가 갇힐 수 있으므로 조기 영상 검사가 권장되지만, 한 달 후에도 품질은 여전히 허용됩니다.

특정 조직 유형, 영상 목표, 안전성 고려사항에 따라 다양한 정화 방법이 존재합니다^{13, 14, 15}. 화학적 제거는 접근성, 낮은 독성, 잎 종류 전반에 걸쳐 적용할 수 있는 수용성 NaOH 기반 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. 조직 반응이 종마다 다르기 때문에 테스트와 최적화가 필요합니다. 경엽은 ≥2주가 걸릴 수 있으며, 잔여 녹색 조직은 염색과 해부학적 특징 가림을 방해할 수 있습니다(보충 그림 1C). 더 빠른 제거를 위해 NaOH 농도를 2.5 M 또는 5 M로 높일 수 있습니다. 부드러운 잎은 표백 후 약해집니다(3.7절; 보조 그림 1B), 그리고 차아염소산나트륨(NaClO)에 과다 노출되면 조직이 분해되거나 표피층 분리가 발생할 수 있습니다. 대부분의 부드러운 잎에는 30초에서 2분의 표백이 충분하지만, 더 단단한 종은 최대 1시간²⁷분이 필요할 수 있습니다. 벌채는 껍질 준비보다 느리며, ~5일과 전문 훈련이 필요하지 않지만 다양한 종에 맞게 조정할 수 있습니다. 투명하고 염색된 샘플은 4°C의 증류수에 보관할 수 있으며, 장기 보존을 위해 영구 장착이 권장됩니다^15,27.

기공 특화 StoManager1은 대부분의 이미지 유형에서 기공 복합체를 신뢰성 있게 검출했으며(보충 그림 2), 필 기반 방법에서는 수동 주석 작성과 대체로 일치하는 검출 결과가 나타났습니다. 그러나 기공 면적 측정은 수동 측정과 체계적으로 달랐기 때문에(표 2), 대규모 분석 전에 소수의 수작업 측정 하위 집합(예: 종당 10-20개의 기공)을 기반으로 보정이 필요했습니다. StoManager1은 처리량을 크게 증가시키며, 비표준 경우에는 수동 검증이 필요합니다.

기공-표피 동시 분절은 최적의 선명도가 다르고, 형태와 막의 명료성이 이질적으로 분절 오류를 유발하기 때문에 어렵습니다. 큰 이미지 세트(예: 아드렉시얼/아브칼 표면, 벗겨짐/클리어드)에서 훈련할 때도 특이성을 잃는 것과 같습니다. 식물 표피에 대한 사전 학습된 세포 자세 모델은 존재하지 않습니다; 주로 동물 세포를 대상으로 훈련된 표준 "CYTO" 및 "CYTO2" 모델은 표피 이미지에서 성능이 떨어집니다. 따라서 신뢰성을 위해서는 맞춤형 교육이 필요합니다(보충 섹션 2). 훈련 후에도 과도한 분할과 위양성은 여전히 흔하며, 특히 저대비 또는 선명화되지 않은 이미지에서 그렇습니다(보조 그림 3).

일라스틱(보충 섹션 3, 보조 그림 4)에서는 대상 셀 클래스(예: 표피의 클래스 1)에 대해 객체 마스크를 생성하고, 감사 및 수동 수정을 위해 클래스 마스크를 유지해야 합니다. 배치 처리와 이후 ImageJ/Fiji 워크플로우는 시간을 절약하고 수동 오류를 줄일 수 있습니다. 면적, 표준편차, 또는 분위수에 따른 일관된 필터링은 노이즈와 허위 탐지를 억제하는 데 필수적입니다. 필터링 후 중간 셀 면적과 셀 수는 수동 수치에 근접합니다. 수동 측정 및 대체 머신러닝 도구(Weka, RootPainter)와의 벤치마킹은 매개변수 조정과 세분화 품질 평가에 필수적입니다. ML 배치 처리는 자원을 많이 소모합니다. 안정적인 학습과 대규모 배치 분할은 NVIDIA CUDA 지원 GPU와 ≥32GB RAM이 필요합니다. 중급 시스템(예: 통합 그래픽 탑재 16GB RAM)에서는 감독 학습이 <10 이미지에 대해 보통 ~5-10분이 소요되며, 여러 주석 클래스나 이기종 이미지 유형을 사용할 경우 자주 크래시가 발생했습니다. CUDA는 CPU 또는 통합 GPU 실행 대비 처리 속도를 약 10-20배 향상시켰습니다.

Cellpose, ilastik, StoManager1 간의 성능 차이는 각각의 특징 표현에서 비롯됩니다. 셀포지는 물체 중심으로 향하는 벡터 흐름장을 예측하며, 광학 헤일로와 급격한 굴절 경계에 민감하여 흐름을 방해하고 제거된 F. excelsior에서 거짓 양성 군집을 생성합니다. Ilastik은 인간이 안내하는 픽셀 분류기로서, 배경으로 명시적으로 표시되지 않는 한 고부대 포장 셀 벽이나 후광을 과도하게 분할합니다. StoManager1은 물체 수준의 형태 패턴(중심 기공이 있는 쌍을 이룬 가드 세포)을 사용하여 기공 복합체를 감지하며, F. excelsior²⁸을 포함한 필 제제에서 우수한 성능을 보입니다; 그러나 헤일로 인한 흐림은 청소 시 기공 가시성에 영향을 미쳐 잘못된 분류가 아닌 거짓 음성을 유발합니다(보조 파일1절과 3절). 따라서 Cellpose와 StoManager1은 자동화된 세그멘터로 동작하는 반면, ilastik은 인간 주도 분류기로 작동합니다(보충 파일섹션 1-3)^28,.

종별 세포 구조는 AI 성능을 조절합니다. T. officinale에서는 매끄럽고 타원형의 가드 셀 경계가 StoManager1 훈련 분포와 일치하여 벗겨진 샘플에서 검출할 수 있게 했습니다(보충 그림 2). 반면, 일반주의 도구는 가드 세포와 포장 세포를 자주 혼동합니다. F. excelsior에서는 후퇴한 기공과 고돌출 포장 세포가 투명한 영상에서 위음성을 유발합니다. 이러한 차이는 종 및 준비 물질에 따라 형성된 영상 기하학을 반영합니다. 수동과 AI 기반 측정 간의 체계적 차이는 두 가지 원인에서 비롯됩니다: AI에 의한 이미지의 스케일 인코딩 부족과 준비 과정에서 유발된 광학 인공물입니다. 완화 전략으로는 조직 준비로 인한 흐림과 후광의 시각적 분류, 위에서 설명한 조건에서 필링을 우선적으로 사용하기, 기공의 일부 부분에 대한 선형 보정을 포함한 수동 보정(수동 = a + b × AI)이 포함됩니다. 추가 전략으로는 분류군별 증강 및 보조 분류 설계가 훈련을 위한 것(다만, 자체 학습된 모델은 크고 다양한 데이터셋에서 사전 학습된 모델보다 낮을 가능성이 높다), 세분화 후 상위 분위수 필터링이 있다.

AI 세분화 오류는 체계적이고 비무작위적이기 때문에 후처리가 필수적입니다. 이미지 품질 진단은 간단한 결정 트리를 따를 수 있습니다. 먼저 표피 대비와 선명도를 점검하세요: 선명하면 위양성으로 넘어가고; 흐릿하게 보일 경우 작은 고주파 아티팩트가 발생할 수 있으니 필터를 조정하세요. 오탐(예: 점, 이물질)이 적으면 ±2-3 SD 이상치 필터링으로 대체로 충분합니다. 작은 인공물이 우세할 경우, 분위수 기반 필터링을 사용하세요. 그 다음 형질 분포(예: 중앙값 Ae)를 생물학적 기대값이나 수동 데이터와 비교합니다. 필요에 따라 임계값을 정제하며, 산출물이 풍부한 데이터셋에서 상위 10-50% 분위수만 유지하면 의미 있는 출력이 보장됩니다(보충그림 7 과 8). 표피 ML 도구로 인한 높은 위양성률로 인해 신뢰할 수 있는 기공 밀도 추정치를 자동으로 도출할 수 없었으나, StoManager1은^{경계가 명} 확할 때 정확한 기공 측정을 제공했습니다( 그림 6 및 7 참조). 표피 중앙값에서는 Ae가 견고하여 평균보다 작은 위양성에 덜 민감했습니다.

방법 선택이 형질 탐지에 영향을 미쳤습니다. 필링은 기공을 완전히 노출시켜 기공 밀도를 개선하는 것보다 더 효과적이었으며(그림 3), 반면 제거는 때때로 기^{공 형태를} 더 잘 보존했음에도 불구하고 층이 쌓이거나 색소가 있는 조직 내에서 작은 기공을 가리는 경우가 많았다. AI 도구 중에서도 StoManager1은 특히 필링 준비에서 최소한의 선정으로 견고한 기공 측정을 지속적으로 제공^{했으며, 필}링은 올바르게 식별된 세포와 이미지 커버리지를 증가시켜 표피 측정도 개선했습니다^. 미래의 성과는 생태생리학과 작물 개선을 위한 자동 영상 파이프라인에 통합할 수 있는 크고 분류학적으로 다양한 사전 학습 모델에서 가장 많이 나올 가능성이 큽니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소독제 액체 세정제 NaClO & 5%	도메스토스, 영국	H000023244	그리고 nbsp; 피부 화상과 nbsp;
인산염 이산화나트륨 (Na2HPO4. 2H2O)	펜타, CZ	10028-24-7	NA
에탄올, 항균 100% a.r.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	그리고 nbsp; 매우 인화성이며;
유리 바이알 2 mL	VWR 라이프 사이언스, 미국	548-0045
글루타알데히드 50% 용액	VWR 라이프 사이언스, 미국	23H2856331	흡입 시 치명적이야. 삼키면 독성이 있습니다.  보호 장갑을 착용하고, nbsp; 의복, 그리고 nbsp; 안경.
현미경 슬라이드	노르맥스, PT	5470308A	NA
네일 케어 탑코트 빠르게 건조	BK (이네자), 중위	LT-02244	NA
니콘 이클립스 E600과 니콘 DS0Fi1 5 MP	니콘 코퍼레이션, 일본	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
피펫과 피펫 팁	서모 사이언티픽, FI	KJ16047	NA
단일면 강철 블레이드	옥스퍼드 악기	51-1625-0182	NA
이수소나트륨 인산염 이하이드레이트 (NaH2PO4 . 2H2O) 순수함	펜타, CZ	13472-35-0	NA
수산화나트륨 펠릿(NaOH) 순수	메르크 KGaA, DE	1310-73-2	심한 화상. 그리고 nbsp;
문구용 클리어 테이프	포로피스, LV	91231	NA
톨루이딘 블루, 범용 등급	서모피셔 사이언티픽, 영국	2045836	NA