우리는 인간 경추 오가노이드를 확립하고 유전적으로 조작하는 상세한 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
자궁경부암은 여성에서 네 번째로 흔한 암이며, 자궁 외경구암에 가장 자주 영향을 미칩니다. 자궁 외경막은 층층화된 편평상피로 둘러싸여 있으며, 기저세포와 분화하는 비기저세포와 기저상세포로 구성되어 있습니다. 자궁경부 원절 후 관찰된 재생은 강력한 줄기세포 활성의 존재를 시사합니다. 그러나 자궁경부 줄기세포의 정체와 조절 기전, 그리고 그 악성 변형 과정에 대한 이해는 인간 자궁경부 조직에 대한 접근이 제한되고 자궁 외세균에서 줄기세포 활동을 최적으로 평가할 수 있는 시스템의 부재로 인해 제한적이었습니다. 최근에 확립된 인간 경추 오가노이드는 이러한 한계를 극복하고 경추 생리학과 병리학을 연구할 새로운 기회를 제공할 수 있습니다. 그러나 인간 경추 오가노이드를 분리하고 확립하는 표준화된 방법은 존재하지 않습니다. 여기서는 인간의 외경 오가노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 구체적으로, 우리는 인간의 외경피상피에서 단일 세포를 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 최적화된 효소 용액에서 자궁경부 조직을 배양함으로써 자궁경부 상피를 벗겨내어 세포 수율을 극대화하고 섬유아세포 오염을 최소화합니다. 또한 최적화된 배지 제형을 사용하여 인간 자궁경부 오가노이드를 배양하는 조건을 개략적으로 설명합니다. 또한, 경추 오가노이드의 통과 및 유전적 조작 절차도 상세히 설명합니다. 이 프로토콜은 인간 자궁경부 오가노이드를 확립하고 이를 활용해 자궁경부 줄기세포와 질병을 연구하는 데 매우 효율적인 접근법을 제공합니다.
서론
자궁 외세균은 자궁경부암의 가장 흔한 부위입니다 1,2. 선진국에서 인유두종바이러스(HPV) 백신 접종 이후 자궁경부암이 감소하고 있지만, 전 세계적으로 여전히 여성 사이에서 네 번째로 흔한 암으로 남아 있습니다 3,4. 또한, 일부 국가에서는 자궁경부 전암성 병변의 발생률이 계속 증가하고 있습니다 5,6. 저등급 편평상피내 병변(LSIL)은 종종 저절로 퇴행하는 반면, 고등급 편평상피내 병변(HSIL)은 침습성 암으로 진행될 위험이 있으며 일반적으로 절제술이나 전피 수술과 같은 수술적 개입이 필요합니다. 이러한 시술은 외세피녹스를 단축시키고 유산이나 조산의 위험을 높일 수 있습니다 7,8. 자궁경부 생물학에 대한 더 깊은 이해와 재생 치료 개발이 이러한 도전 과제를 해결하는 데 도움이 될 수 있지만, 견고하고 생리학적으로 적합한 모델 시스템이 필요합니다.
동물 모델은 자궁경부 항상성, 질병 기전, 치료 전략에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다. 하지만 인간 생물학 및 병리학과의 본질적 차이로 인해 번역 가치가 제한됩니다. 대안으로, 오가노이드는 인간 생물학과 질병을 모델링하는 강력한 플랫폼으로 등장했습니다. 오르가노이드는 줄기세포에서 유래한 3차원 미세구조로, 기원 조직의 조직학과 분자 신호를 재현합니다 9,10,11. 이들은 기관, 식도, 자궁경부 등 여러 조직에서 다양한 인간 조직 줄기세포를 식별하는 데 사용되었습니다. 더불어, 오르가노이드는 유전적 조작을 가능하게 하여 암과 섬유증을 포함한 다양한 질병의 병인기를 모델링할 수 있게 합니다 15,16,17. 또한, 오가노이드는 약물이나 세포 치료의 효능과 독성을 스크리닝하는 효과적인 플랫폼 역할을 합니다18, 19, 20, 21.
최근 두 개의 독립적인 그룹이 인간 경추 오가노이드 시스템을 확립했다22,23. 이러한 진전을 바탕으로 자궁경부 오가노이드 배양의 효율성을 크게 향상시켰고, 인간 자궁경부 줄기세포를 확인했습니다13. 더 나아가, 경추 상피를 떼어내어 경추 상피 아래에 있는 섬유아세포의 포함을 최소화했습니다. 경추 오가노이드를 유전적 조작으로 활용하여 미생물 대사산물과 그 하류 경로가 경추 항상성 유지와 전암 진행 방지에 미치는 역할을 밝혀냈습니다. 따라서 자궁경부 오가노이드를 생성, 유지 및 유전적으로 변형하기 위한 표준화되고 최적화된 프로토콜은 자궁경부 생물학과 병리학을 연구하는 데 필수적인 도구가 될 것입니다.
이 글에서는 인간 경추 오가노이드를 생성하고 통과시키는 상세하고 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 또한 전기천공을 통한 유전적 조작 프로토콜도 설명합니다.
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프로토콜
인간 자궁경부 조직을 이용한 세포 분리 및 오가노이드 배양은 대구 DGIST 및 경상북도 칠곡경북국립대학병원 내부 심사위원회(DGIST-20210401-BR-112-01 및 KNUCH-2020-12-020-001)에 의해 모든 관련 윤리 규정에 따라 승인 및 수행되었습니다. 인체 외경경 조직은 칠곡경북 산부인과에서 제공하였다. 양성 자궁 질환으로 인해 전복강경 자궁적출술을 받은 환자들로부터 건강한 자궁경부 조직을 채취하였습니다. 모든 환자로부터 사전 동의를 받았습니다.
1. 외경피 조직으로부터의 단일 세포 분리
참고: 이 프로토콜은 약 5 mm × 5 mm × 5 mm 크기의 인간 ectocervix 생검 샘플로 시작합니다(그림 1).
- 생검 조직을 10cm 페트리 접시에 넣고, 칼슘과 마그네슘 없이 얼음처럼 차가운 DPBS로 한 번 세척하여 혈액과 이물질을 제거합니다.
참고: 인간 경추 조직은 수술 후 3시간 이내에 얼음처럼 차가운 Advanced DMEM/F12로 실험실로 옮겨졌으며, 도착 즉시 처리되었습니다. - 조직을 1.5mL 튜브에 1mL 디스파제 용액(2.4 U/mL)을 넣고, 37 °C에서 튜브 회전기(20 rpm)에서 부드럽게 교반하며 1시간 배양합니다.
참고: 디스파즈 용액(2.4 U/mL)은 사용 직전에 얼음처럼 차가운 DPBS에 디스파즈 분말을 작업 농도로 녹여 신선하게 준비했습니다. - 샘플을 새로운 10cm 페트리 접시로 옮기세요. 겸자를 사용해 흰색 상피층을 나머지 조직과 조심스럽게 분리하세요.
- 날카로운 겸자를 사용해 상피 표면을 부드럽게 벗겨내어 완전한 시트로 만드세요. 즉시 분리된 상피층을 얼음 위에 보관한 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
참고: 표면 상피가 쉽게 벗겨지지 않으면 둔한 핀자로 표면을 긁어내세요. - 벗겨진 샘플이나 긁은 샘플에 재조합 트립신 기반 해리 용액 1mL를 첨가한 후 전체 혼합물을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 이전 단계에서 남은 조직은 다른 50 mL 원뿔 튜브에 보관하세요.
- 경추 상피가 들어 있는 50mL 원뿔관을 37°C에서 5분간 관내 회전기를 부드럽게 저으며 5분간 배양합니다(20rpm).
- 세포 현탁액에 신선하게 준비한 얼음 냉각 차단제(PBS, 2% 소송아지 혈청(BCS))를 10mL 첨가하여 효소 반응을 멈춥니다.
- 튜브를 450 × g에서 4 °C에서 5 분간 원 심분리합니다. 상정액을 조심스럽게 제거하고 버리세요.
참고: 해리된 조직에서 혈액이 시각적으로 관찰되거나 조직이 끈적해 보인다면 다음 단계를 진행하세요. 그렇지 않으면 1.13단계로 넘어가세요. - 1X 적혈구 용해 버퍼 1mL와 DNase 20 μL(10 U/μL 스톡)을 펠릿에 첨가합니다. 상온에서 5분간 배양하여 적혈구를 용해하고 끈적한 DNA를 분해하세요.
- 효소 반응을 멈추기 위해 세포 현탁액에 얼음 냉각 차단제(PBS, 2% 소송아지 세럼(BCS))를 10mL 첨가하세요.
- 튜브를 450 × g에서 4 °C에서 5 분간 원 심분리합니다. 상정액을 조심스럽게 제거하고 버리세요.
- 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 블로킹 버퍼(PBS, 2% 소송아지 혈청(BCS))로 세척하세요.
- 튜브를 450 × g 에서 5분간 원심분리하세요. 상정액을 조심스럽게 제거하고 버리세요.
- 세포 펠릿을 200-500 μL 유기노이드 배양 배양액에 재현탁합니다.
- 트라이판 블루 용액을 사용한 혈세포계를 사용해 세포 수를 세세요. 예상 세포 수확량은 생검 샘플당 50,000에서 500,000 사이입니다.
2. 외부 정액 오가노이드 씨앗 및 배양
- 500-2,000개의 생존 가능한 세포를 50 μL 최종 부피의 오가노이드 배양지(재료 목록에 설명된 조성)에 1.5mL 마이크로 원심분리관 안에 재현탁합니다. 시드 전에 트리판 블루 배제법으로 세포 생존 가능성을 평가하였다.
- 세포 부탁액에 기저막 기질 50 μL(예: 마트리젤)을 첨가합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 얼음 위에 부드럽게 혼합한 후, 100 μL 혼합물을 24웰 플레이트에 삽입한 세포 배양 삽입물 내부에 분사합니다. 기저막 매트릭스 취급과 관련된 모든 절차는 별도의 명시가 없는 한 조기 겔화를 방지하기 위해 얼음 위나 4 °C에서 수행되었습니다.
- 기판을 37°C에서 20-30분간 배양하여 기저막 기질-세포 혼합물이 굳어질 때까지 보관합니다.
- 혼합물이 고체화되면, 삽입물 아래 웰에 400 μL의 오가노이드 배양지를 추가합니다.
- 오가노이드를 1-2주간 배양하여 평균 직경 150-250 μm(최대 직경은 약 500 μm)에 도달합니다.
참고: 오가노이드가 적절한 크기에 도달하고 양파 껍질 같은 미세구조의 동심원 층상 패턴을 보이면 필요하다면 통과(passaging)를 고려하십시오.
3. 오가노이드 해리 및 재씨앗
- 세포 배양 인서트 위에 1mL의 디스파제 용액(2.4 U/mL)을 추가하고, 피펫으로 기저막 기질을 부드럽게 해리합니다.
- 분산-기저막 매트릭스 혼합물을 15 mL 튜브로 옮기고 37 °C에서 1시간 배양합니다.
- 세포 현탁액에 신선하게 준비한 얼음 냉각 차단제(PBS, 2% 소송아지 혈청(BCS))를 10mL 첨가하여 효소 반응을 멈춥니다.
- 튜브를 450 × g에서 4 °C에서 5 분간 원 심분리합니다.
- 상원액을 제거하고 펠릿을 200 μL TrypLE Express에 재현탁합니다.
- 37°C에서 5분간 배양하세요.
- 얼음 냉각 차단제 1mL(PBS에 2% 소송아지 혈청(BCS))를 넣고 피펫을 부드럽게 사용해 효소를 중화시킵니다.
- 현탁액을 40 μm 셀 체러를 거쳐 단일 셀을 얻습니다.
- 튜브를 450 × g에서 4 °C에서 5 분간 원 심분리합니다. 상정액을 조심스럽게 제거하고 버리세요.
- 세포 펠릿을 200-500 μL 유기노이드 배양 배양액에 재현탁합니다.
- 트라이판 블루 용액을 사용한 혈세포계를 사용해 세포 수를 세세요. 24웰 세포 배양 인서트의 웰당 예상 세포 수확량은 50,000에서 500,000 사이입니다.
- 그 후 500-2,000개의 세포를 50μL 오가노이드 배양지(재료 목록에 설명된 조성)에 재현탁합니다. 세포 부탁액에 기저막 기질 50 μL을 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 기포 형성을 피한 후, 100 μL 혼합물을 24웰 플레이트에 삽입한 세포 배양 인서트 내부에 분사합니다.
- 기판을 37°C에서 20-30분간 배양하여 기저막 기질-세포 혼합물이 굳어질 때까지 보관합니다.
- 혼합물이 완전히 굳어지면(보통 37 °C에서 20-30분 후), 삽입물 아래 우물에 400 μL 유기노이드 배양지를 추가합니다.
- 오가노이드를 1-2주간 오가노이드 배양 배지(재료 목록에 설명된 조성)에서 3D 세포외 기질 내장법으로 배양합니다. 배양물을 37°C, 5% CO₂로 가습 인큐베이터에서 유지하세요. 배지를 2-3일마다 교체하고 오가노이드가 평균 직경 150-250 μm에 도달할 때까지 성장을 관찰합니다.
- 오가노이드가 적절한 크기에 도달하면 다음 라운드를 위해 통과시키고, 필요하다면 양파 껍질 같은 동심원 층상 미세구조를 보여줘.
4. 전기천공을 통한 인간 자궁경부 오가노이드의 유전적 조작
참고: 이 프로토콜은 Lonza Amaxa 4D-뉴클레펙터와 P4 1차 세포 4D-뉴클레오프터 X 키트(#V4XP-4032)를 사용하여 작성되었습니다.
- 인간 자궁경부 세포 현탁에서 분리된 후, 각 1.5 mL 튜브에 100,000-200,000개의 세포를 전달합니다.
- 튜브를 450 × g 에서 4 °C에서 3분간 원심분리합니다. 상정액을 조심스럽게 제거하고 버리세요.
- P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X 키트에서 나온 뉴클레오펙터 용액/보충제 혼합액 20 μL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 이 혼합물은 튜브당 16.4 μL 뉴클로펙터 용액과 3.6 μL 보충제를 혼합하여 만듭니다.
- 재현탁된 세포가 포함된 각 튜브에 대조군 또는 표적 siRNA 올리고 300 nM을 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞으세요.
참고: siRNA 올리고의 부피는 튜브당 2 μL를 초과해서는 안 됩니다. - 뉴클레오펙션 혼합물(뉴클레펙터 용액/보충제 혼합물에 재현탁된 20 μL 세포 + 최대 2 μL siRNA; 총 20-22 μL)을 P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X 키트의 전기천공 쿠벳 혈관으로 조심스럽게 옮깁니다.
- Nucleocuvette 혈관을 부드럽게 두드려 샘플이 쿠벳 바닥을 덮도록 하세요.
- Nucleocuvette 혈관의 뚜껑을 닫고 전원이 작동하는 4D 핵 수강기 장치의 고정기에 넣으세요.
참고: 리테이너 내 핵유사혈관의 올바른 방향을 반드시 확인하세요. - 핵 노출 과정을 시작하세요. P4 1차 세포 공정으로 각 쿠벳에 대해 EA-125 펄스 코드를 설정하세요.
- 완료 후에는 조심스럽게 뉴클로수베트 혈관을 유지장치에서 제거합니다.
- 세포가 안정될 때까지 실온에서 10분간 배양하세요.
- 뉴클레오비벳 혈관의 뚜껑을 열고 각 큐벳에 37 °C 미리 가열된 오가노이드 배양지 180 μL을 추가한 후, 세포 현탁액을 새로운 1.5 mL 튜브로 부드럽게 옮겨 재현탁합니다.
- 500-2,000개의 세포가 포함된 세포 현탁액을 취해 오가노이드 배양 배지에 최종 50 μL로 재현탁합니다.
참고: 4.12단계에서 남은 셀은 버리지 마세요. 이 카드들은 4.14단계에서 사용할 예정입니다. - 방법 2: Ectocervix 오르가노이드 씨앗 및 배양 프로토콜에 따라 오르가노이드를 배양합니다. 결과적으로 생성된 오가노이드의 수, 크기, 구조 등 다양한 요인을 평가하여 siRNA의 효과를 비교하세요.
- 4.12단계에서 남은 세포를 96웰 초저감 부착판에 분사하고 37°C에서 48시간 배양합니다.
- 48시간 후에는 세포를 1.5mL 튜브로 옮기고 450 × g 에서 3분간 원심분리기를 사용하세요. 상원액은 버리세요.
- 세포 펠릿을 이용해 표적 유전자의 녹다운을 확인하고 유전자 발현 변화를 평가하기 위해 실시간 PCR 실험을 수행합니다.
참고: 모든 인간 자궁경부 조직과 세포 부유물은 잠재적 감염 물질로 취급해야 합니다. BSL-2 규정과 기관의 윤리 및 생물안전 규정에 따라 인증된 생물안전 캐비닛에서 1차 인간 표본을 포함한 모든 절차를 수행하십시오. 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 안경 보호구)를 착용하고, 기관에서 승인한 소독제로 작업 표면과 장비를 소독하십시오. 효소 시약(예: TrypLE Express와 같은 분산 및 해리 효소)은 피부와 눈 자극을 일으킬 수 있으며, 피펫팅 중에 에어로졸을 생성할 수 있습니다; 에어로졸 생성을 피하고, 가능한 한 튜브를 덮어두며, 기관 노출 절차와 제조사의 SDS 지침을 준수하는 동안 접촉 시 즉시 물로 세척하세요. 모든 생물학적 폐기물(매트릭스 함유 물질 및 오염된 플라스틱 포함)은 기관 지침에 따라 처리해야 합니다. siRNA 전기천공을 위해서는 제조사의 전기 안전 지침을 따르세요: 펄스를 시작하기 전에 큐벳이 제대로 장착되고 뚜껑이 완전히 닫혔는지 확인하며, 젖은 장갑이나 유출 근처에서 장치를 조작하지 말고, 장치 및 액세서리에 손상 여부를 점검하며, 펄스 직후 큐벳 전극과 직접 접촉하지 않도록 해야 합니다.
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결과
3D 인간 경추 오가노이드 배양
갓 분리된 인간 외경구 조직은 위에서 언급한 순서로 단일 세포로 분리되었고, 이후 24웰 세포 배양 삽입물 위에 플레이트되어 이 프로토콜에 설명된 대로 자궁경부 오가노이드를 형성하도록 배양되었습니다(그림 1). 인간 경추 오가노이드는 단일 세포에서 2주 동안 직경 최대 500 μm까지 성장합니다(그림 2A). 오가노이드 생성 성공률은 90% 이상(11개의 서로 다른 생검 조직에서 10회 달성)이며, 전체 오가노이드 형성 효율은 약 40%입니다. 배양일수 7일부터 10일까지는 양파 껍질 같은 미세구조의 동심원 층상 무늬를 보여주기 시작했습니다. 이러한 미세구조는 오가노이드 내에서 층화된 편평상피가 생성되었음을 나타낸다. 이 기관은 분화된 기저 세포와 외곽...
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토론
이 원고에서는 인간 경추 오가노이드를 설정하고 통과시키는 프로토콜을 설명합니다. 또한 경추 생물학 및 병리학 연구를 크게 발전시키는 유전적 조작 프로토콜도 제공합니다. 우리는 인간 자궁경부 오가노이드에 대해 프로토콜을 최적화했지만, 약간의 수정만 있으면 다른 오르가노이드 시스템에도 적용할 수 있습니다.
오가노이드 배양을 확립하고 최적화하는 데 필수적인 정보에는 최소한의 성분으로 최대 효율을 위한 상세한 배지 조성과 최적의 효소 및 기계적 단편화를 사용하는 단일 세포 해리 프로토콜이 포함됩니다. 단세포 해리를 위해 인간 자궁경부 샘플을 디스파이즈 용액에 1시간 배양했습니다. 그 후 식도 및 기관 조직과 마찬가지로 경추 상피를 온전한 시트로 떼어냈습니다(그림 1)12,27
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감사의 글
이 작업은 보건복지부의 보조금(정 Y. 지원금 RS-2024-00439434)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| P4 일차 세포 4D-뉴클레오펙터 X 키트 | 론자 | V4XP-4032 | |
| 96웰 초저 부착판 | SPL | 39796 | |
| 셀 스트레너 40 및 마이크로; m | SPL | 93040 | |
| 50mL 원뿔형 튜브 500/박스 | 언어치료사(SLP) | SPL50050 | |
| 15ml 원뿔관 | 사르스테트 | 62.554.502 | |
| 크라이오퓨어 튜브 1.8 mL - 흰색 | 사르스테트 | 72.379P | |
| 37 & deg; C, 5% CO2 및 nbsp; 인큐베이터 | 에펜도르프 | 9734IQ905476 | |
| 세포 배양 삽입물 | SPL | 37024 | |
| 아마사 4D 핵 핵 검사 | 론자 | AAF-1003X | |
| 블로킹 버퍼(DPBS에서 BCS 2%) | 깁코 / 웰진 | BCS: 26010074; DPBS: LB001-02 | |
| 디스페이즈 II 분말 | 깁코 | 17105041 | |
| DNAse I | 효소학 | M059L | |
| 마트리젤 | 코닝 | 356231 | |
| 적혈구 용해 완충제 | 바이오세상 | R2015 | |
| 트립LE 익스프레스 | 깁코 | 12605 | |
| 워시 버퍼 (HBSS) | JBI | BL003-1 | |
| 고급 DMEM/F12 | 깁코 | 12634028 | |
| 글루타맥스 보충제 | 깁코 | 35050-061 | |
| 페니실린&대시; 스트렙토마이신 | 바이오웨스트 | L0022-100 | |
| 젠장 | 깁코 | 15630-080 | |
| B27 보충제 | 깁코 | 17504044 | |
| 노긴 | 페프로텍 | 118214 | |
| N-아세틸-l-시스테인 | 시그마 | A9165 | |
| Y-27632 | 스템셀 테크놀로지 | 72307 | |
| FGF2 | 페프로텍 | 100-18B-50UG | |
| FGF7 | 페프로텍 | AF-100-19-250UG | |
| A83-01 | 셀렉켐 | S7692 | |
| 포스콜린 | 시그마 | F6886 | |
| 신경굴린 1 | 페프로텍 | 100-03-50UG | |
| NGF | 페프로텍 | AF-450-01-100UG | |
| R-스폰딘 | 중국생물학 | 11083-HNAS | |
| HGF | 페프로텍 | 100-39H-250ug | |
| FGF10 | 페프로텍 | 100-26 | |
| 페트리디시 35 mm | SPL | 10035 | |
| 오가노이드 배지 레시피 | |||
| <스트롱>이름 | Company | <스트롱>카탈로그 번호 | <강>집중 |
| 고급 DMEM/F12 | 깁코 | 12634028 | |
| 글루타맥스 보충제 | 깁코 | 35050-061 | 1회 |
| 페니실린&대시; 스트렙토마이신 | 바이오웨스트 | L0022-100 | 1회 |
| 젠장 | 깁코 | 15630-080 | 10 mM |
| B27 보충제 | 깁코 | 17504044 | 비타민 A 없는 <브루/> 1회 |
| 노긴 | 페프로텍 | 118214 | 100 ng/ml |
| N-아세틸-l-시스테인 | 시그마 | A9165 | 1 mM |
| Y-27632 | 스템셀 테크놀로지 | 72307 | 10 uM |
| FGF2 | 페프로텍 | 100-18B-50UG | 50 ng/ml |
| FGF7 | 페프로텍 | AF-100-19-250UG | 25 ng/ml |
| FGF10 | 페프로텍 | 100-26 | 100 ng/ml |
| A83-01 | 셀렉켐 | S7692 | 500 nM |
| 포스콜린 | 시그마 | F6886 | 10 & 뮤; M |
| 신경굴린 1 | 페프로텍 | 100-03-50UG | 50 ng/ml |
| NGF | 페프로텍 | AF-450-01-100UG | 20 ng/ml |
| R-스폰딘 | 중국생물학 | 11083-HNAS | 100 ng/ml |
| HGF | 페프로텍 | 100-39H-250ug | 25 ng/ml |
참고문헌
- Singh, D., et al. Global estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2020:a baseline analysis of the WHO Global Cervical Cancer Elimination Initiative. Lancet Glob Health. 11 (2), e197-e206 (2023).
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- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
- Kwak, K., Hwang, S. S. Predicted cervical cancer prevention: impact of National HPV Vaccination Program on young women in South Korea. Cancer Res Treat. 56 (3), 898-908 (2024).
- Kim, J., Lee, D., Son, K. B., Bae, S. The burden of cervical cancer in Korea:a population-based study. Int J Environ Res Public Health. 17 (17), 6308(2020).
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