종단 임피던스 기반 종양 세포 생존 가능성 측정을 이용한 연쇄 살인 분석 - T 세포 성능 평가에 유용한 방법

요약

이 프로토콜은 임피던스 기반 실시간 분석법을 제시하여 만성 항원 자극 하에서 CAR T 세포의 연쇄 살해 능력과 지속성을 정량화하며, 비용 효율적인 재사용을 위한 플레이트 세척 방법을 포함합니다.

초록

키메라 항원 수용체(CAR) 세포 치료는 특정 혈액학적 악성 종양 치료에 혁신을 가져왔습니다. 하지만 상당수의 환자들은 항원 손실, 항원 하향 조절, 또는 T 세포 소진으로 인해 재발을 경험합니다. 이러한 도전 과제는 만성 항원 자극 하에서 CAR T 세포의 살상 능력과 지속력을 평가할 수 있는 기능적 분석법의 필요성을 강조합니다. 연쇄 살인 검사는 CAR T 세포가 종양 표적을 반복적으로 제거하는 능력을 측정하여 CAR T 세포 반응의 내구성과 효능에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다.

여기서는 실시간 세포 분석(RTCA) 시스템을 이용한 임피던스 기반 분석법을 제시하여 시험관 내 CAR T 세포 매개 연쇄 살인을 정량화합니다. 종양 세포는 반복적으로 시딩되고 분석별 E-플레이트에 부착된 후 정의된 이펙터-표적(E:T) 비율로 CAR T 세포를 첨가합니다. 이 플랫폼은 표지 없이 종양 세포의 생존력을 지속적으로 모니터링하며, 높은 시간 해상도로 동적 세포독성을 포착합니다. 핵심 수치에는 세포 지수(CI) 반응학, 종양-세포 사망률, 표적까지의 시간 클리어런스가 포함됩니다. 반복적인 종양-표적 접촉 시 관찰되는 점진적인 살상 능력 감소는 획득성 CAR T 세포 기능 장애, 흔히 T 세포 고갈(T cell exhaustion)의 지표로 작용합니다. 이 지표들은 다양한 E:T 비율에서 CAR T 세포 기능을 정밀하게 평가할 수 있게 하며, 시간에 따른 다양한 CAR T 세포 구성 또는 공동 처리법 간 직접 비교를 가능하게 합니다.

비용 효율성을 높이기 위해 우리는 분석 성능이나 데이터 무결성을 저해하지 않으면서 분석 E-플레이트를 재사용할 수 있는 플레이트 세척 절차를 개발했습니다. 최적화된 워크플로우는 분석 비용을 줄이면서 분석의 견고성을 유지합니다. 이 접근법은 CAR T 세포 기능의 저렴하고 확장 가능한 전임상 평가를 가능하게 하여 세포 치료 설계의 개선을 촉진합니다.

서론

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료는 만성 림프구 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 대B세포 림프종, 다발성 골수종 ^1,2,3,4,5 등 다중 혈액 악성 종양에서 놀라운 임상적 성공을 거두며 암 면역치료에 혁신을 가져왔습니다. 최초 규제 승인 이후, CAR T 세포 제품과 치료 환자 수는 꾸준히 증가해 왔습니다^. 특정 제품과 임상 적응증에 따라 일반적인 주입 용량^{은 환자당} 약 2× 10^{6에서 5}× 10⁸CAR⁺ T 세포 사이입니다. 고용량 주입은 효과적인 종양 제거와 장기 질환 통제를 위해 필요하지만, 임상적·실질적 도전 과제가 있습니다. 세포 수가 많으면 사이토카인 방출 증후군(CRS)과 면역 효과 세포 관련 신경독성 증후군(ICANS)과 같은 심각한 부작용 위험이 증가할 수 있으며, 이 두 증후군 모두 용량 의존적일 수 있습니다⁸. 또한, 전처리가 많이 되거나 림프구가 고갈된 환자에서 충분한 수의 기능성 CAR T 세포를 제조하는 것은 어렵고, 이 과정은 치료 센터에 있어 물류적으로 까다롭고 비용이 많이 들 수^{있습니다.}

이러한 도전에도 불구하고, CD19 표적 CAR T 세포 치료법은 재발 또는 불응성 B세포 악성 환자에서 70%-90%의 완전 관해율을 달성하며, 이는 혁신적인 임상적 효과를 입증했습니다 10,11,12. 그러나 CAR T 세포 치료는 장기적인 효능을 제한하는 관련 과제에 직면해 있습니다. 주요 장애물로는 항원 손실 또는 하향 조절, CAR T 세포 지속력 부족, 기능 소진^9. 증식 능력 저하, 항종양 활성 저하, 지속 능력 저하가 특징인 CAR T 세포 소진은 비반응과 재발의 중요한 원인입니다¹³. 소진된 CAR T 세포는 효과기 기능 저하, 억제성 수용체의 지속적인 발현, 만성 항원 노출과 면역억제성 종양 미세환경으로 인한 사이토카인 생성 결함을 보입니다¹⁴. 임상 연구들은 기능적 CAR T 세포 지속성 상실이 재발 위험 증가와 연관됨을 입증했습니다 11,15,16,17. 장기간 생체 내 활성이 치료 성공의 주요 예측 변수로 보이기 때문에, CAR T 세포 제품의 내구성과 지속적인 살상 능력을 이해하는 것은 전임상 및 중개 연구 모두에서 중요한 목표입니다. 특히 CAR T 세포가 장기간에 걸쳐 종양 세포를 반복적으로 인식하고 용해하는 능력, 즉 '연쇄 살인'이라는 점이 주목되며, 이 특성은 지속성과 소진에 대한 저항성을 기능적으로 측정할 수 있게 합니다¹⁸.

이 글은 xCELLigence 실시간 셀 분석(RTCA) 임피던스 플랫폼을 사용하여 연쇄 킬링 분석법을 수행하는 상세한 프로토콜을 제공하며, 선택적 세척 절차를 포함하여 분석판(E-플레이트라고도 함)을 재사용할 수 있게 하여 비용 효율성을 높이면서도 분석 성능을 저해하지 않습니다. 이러한 프로토콜 개발의 근거는 기존 세포독성 검사의 한계에서 비롯되며, 기존 세포독성 검사는 일반적으로 정적인 엔드포인트 측정만 제공합니다. 크롬-51 방출, 락테이트 탈수소효소(LDH) 분석법, 또는 유세포분석 기반 생존 가능성 검사와 같은 일반적인 접근법은 라벨이 필요하고, 노동 집약적인 워크플로우를 수반하며, 정의된 시점에 한정됩니다^18,19. 더 중요한 점은, 장시간 자극이나 여러 차례의 항원 노출에 따른 동적 살상 동역학을 쉽게 포착할 수 없다는 점인데, 이는 CAR T 세포의 지속 및 기능 소진과 직접적으로 연관된 상황이다¹⁸.

xCELLigence RTCA 플랫폼은 전기 임피던스²⁰을 통해 표적 세포 생존성에 대한 라벨 없는 실시간 동적 모니터링을 제공하여 이러한 공백을 해결합니다. 부착성 종양 표적 세포는 금 마이크로전극 코팅된 E-플레이트에 시딩되며, 이들의 부착과 증식으로 측정된 임피던스가 증가하여 세포 지수(CI)²¹로 보고됩니다. CAR T 매개 사살 시 표적 세포가 죽어 분리되어 임피던스²⁰이 급격히 감소합니다. 이 실시간 판독은 추가 라벨이나 시약 없이도 몇 시간 또는 며칠에 걸쳐 세포독성을 지속적으로 평가할 수 있게 합니다²². CAR T 셀은 비부착 상태이므로 임피던스 신호에 기여하지 않아 효과기와 표적 판독을 깔끔하게 분리할 수 있습니다²³. 데이터가 지속적으로 기록되기 때문에, 연구자들은 CAR T 세포를 반복적으로 전달하고 신선한 종양 표적 세포에 노출시키는 다중 자극 프로토콜을 수행하여, 살상 능력이 시간에 따라 어떻게 변화하는지 직접 측정할 수 있습니다²⁴. 이는 CAR T 세포가 생체 내에서 반복적으로 겪는 항원 접촉을 모방하며, 세포독성 능력을 기능적으로 측정합니다.

이 임피던스 기반 연쇄 살인 분석법은 전임상 환경에서 CAR T 세포 기능을 평가하는 연구자, 즉 구성 요소 최적화, 기능 비교, 효능 검사 등에 이상적입니다. 이 프로토콜은 xCELLigence RTCA 시스템과 E-Plate 96의 사용이 필요합니다. 부착 종양 모델에 널리 적용 가능하지만, 고정 또는 고정 전략이 없는 현탁 배양에는 직접적으로 적합하지 않습니다. 임피던스 측정만으로는 표적세포 부착과 생존 가능성만을 반영하므로, CAR T 세포의 활성화, 증식 및 소진 역학을 완전히 특성화하기 위해 유세포분석이나 사이토카인 분석과 같은 보완 분석이 권장됩니다. 프로토콜에는 추가 측정을 위해 세포와 상액을 채취할 수 있는 지정된 단계가 포함되어 있어 CAR T 세포 기능을 보다 포괄적으로 평가할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 E-Plate 96에 최적화되었으며 xCELLigence RTCA 시스템이 필요합니다. 부착성 종양 세포는 CAR T 세포 추가 시점에 로그 성장기에 도달하도록 밤새 시딩됩니다. 종양 세포주와 씨앗 밀도에 따라 이 간격은 6-9시간으로 단축되어 당일 효과자 추가가 가능할 수 있습니다. 후자의 워크플로우가 수행되면 프로토콜에 명시된 일별 일정이 변경되므로, 사용자는 이에 맞게 일정을 조정해야 합니다. 공동 배양은 CAR T 세포가 새로 도판된 종양 세포로 옮기기 전 48시간 동안 유지되며, xCELLigence 기기에서 두 개의 판 위치를 수행하고 종양 세포 플레이트와 이펙터 추가를 격일로 번갈아 가며 진행합니다. CAR T 세포는 기관의 표준 절차(SOP)나 확립된 프로토콜에 따라 생성되어야 합니다. 간단히 말해, 말초혈액 T 세포는 승인된 윤리 기준에 따라 분리되고, 적절한 생체 안전성 조건에서 전도되며, 유세포 측정법 또는 동등한 QC 분석으로 전도 효율과 생존 가능성을 평가합니다. CAR 전이 효율이 20% 미만일 때는 xCELLigence 검사를 수행해서는 안 되며, 효율이 낮으면 미형질 세포에 의한 배경 및 비특이적 죽음이 증가하여 종양 성장 곡선이 왜곡될 수 있습니다. 모든 셀 취급은 층류 후드의 무균 환경에서 수행되어야 합니다. 매체는 실험실 기준에 맞거나 공급업체가 권장하는 대로 사용할 수 있습니다. 별도의 명시가 없는 한, 세포는 5% CO₂를 함유한 습기 환경에서 37°C에서 배양합니다. CAR T 세포에 최적화되어 있지만, 이 방법은 다른 현탁 기반 효과기 세포와 부착 표적에도 적용할 수 있습니다.

1. 준비 및 블랭킹 (1일차)

1. 플레이트 준비
   1. E-플레이트 96의 각 웰 바닥에 50 μL의 종양 배지를 추가합니다.
      참고: 우물 바닥을 긁지 않도록 주의하세요. 긁으면 플레이트가 손상될 수 있습니다.
   2. E-플레이트를 인큐베이터에 넣고, 측정에 사용할 수 있는 동일한 기계 슬롯에 위치시킵니다.
   3. E-플레이트를 37°C에서 30분간 배양하여 적절한 분석 온도와 pH로 끌어들입니다.
2. 계측기 설치
   1. 그동안 RTCA 소프트웨어 프로 (버전 2.6.1)를 실행하고 실험을 저장할 파일 경로를 선택하세요.
   2. "RTCA 운영자" 필드에 실험 이름을 입력하고 저장하세요.
   3. 측정할 우물을 선택하세요.
   4. 셀 탭 아래에 셀 이름을 할당하고, 트리처트 탭 아래에 처리 유형을 할당하세요.
3. 측정 일정
   1. 다음 단계로 일정을 설정하세요:
      스텝 이름 = 빈칸 ; 스윕 = 1 ; 구간 = 1 ; 지속 시간 = 0:00
      단계 이름 = 종양 세포 ; 스윕 = 250-300 ; 인터벌 = 15분; 지속 시간 = 최소 24시간
      단계 이름 = 치료; 스윕 = 최대 2500 ; 인터벌 = 5분; 소요 시간 = 최소 72시간
   2. 'Apply'를 누르고 어떤 단계에도 Auto가 선택되지 않았는지 확인하세요.
4. 블랭킹 스텝
   1. E-플레이트를 37°C에서 30분간 인큐베이션한 후, PLAY/RUN 을 눌러 빈 상태를 시작합니다.
   2. 소프트웨어가 단계를 완료(DONE )로 표시할 때까지 기다리세요(약 1-2분).
   3. 세포 시딩을 진행할 준비가 되었을 때만 크래들을 열고 E-플레이트를 제거하세요.

2. 1라운드: 종양 세포 시딩 (1일차)

1. 종양 세포 씨앗
   1. 각 웰당 50 μL 적정 배지에 종양 세포를 현탁액으로 준비합니다.
   2. 인큐베이터에서 E-플레이트를 제거하고 세포를 3회로 씨앗 뿌리세요.
2. 시작 측정
   1. 즉시 E-플레이트를 기계에 다시 넣고 크래들을 잠가세요.
   2. 첫 측정 5-10분 후 E-플레이트 온도와 pH를 평형으로 맞추고, PLAY/RUN 버튼을 눌러 측정을 시작하세요(일정 2단계 = 종양 세포).
   3. 세포 부착을 위해 E-플레이트를 하룻밤 동안 배양하세요. 비정규화된 세포 지수(CI)를 모니터링하세요. CI가 로그 단계 성장 단계에 들어가면 다음 단계로 진행합니다. 이 단계는 사용되는 세포주에 따라 다르며, 씨앗 세포 수에 의해 영향을 받을 수 있습니다. BxPC3 셀(ATCC CRL-1687)은 웰당 20,000 셀로 시딩되었으며, 로그 단계 성장은 보통 6-18시간 후에 도달했습니다.

3. 1라운드 : CAR T 세포 치료 (2일차)

1. T 세포의 준비 및 시딩
   1. 확장 사이토카인(예: IL-2, IL-7, IL-15 등)이 없는 인간 T 세포 배지에서 100 μL/웰에 필요한 수의 CAR T 세포를 준비합니다.
      참고: CAR 전도율은 실험 시작 시 한 번 측정됩니다. 원하는 효과체-표적(E:T) 비율은 초기 판팅된 종양 세포 수에 따른 CAR⁺ T 세포 수에 따라 설정됩니다. 예를 들어, 50% CAR⁺ T 세포와 20,000개의 BxPC3 종양 세포를 가진 1:1 E:T 비율을 위해 총 40,000개의 T 세포를 플레이트링해야 합니다. 따라서 E:T 비율은 연쇄 살인 검사 시작 시 초기 상태를 의미합니다; 추가 측정이 이루어지지 않는 한, 이후 라운드에서의 E:T 변화는 알려지지 않았습니다. 시간에 따른 T 세포 증식 또는 생존율, 즉 E:T 비율의 변화는 연쇄 살인 판독값의 일부로 간주됩니다. T 셀이 라운드마다 나뉘면 E:T가 비례적으로 재계산됩니다(예: 3라운드 후 1:1 분할은 초기 2:1 E:T가 4라운드에서 1:1로 줄어들었습니다). 라운드 간 E:T 역학에 관심이 있다면, 선택적으로 추가 우물을 도금하여 CAR % 또는 이펙터 기능의 중간 측정을 할 수 있습니다. 자기 분리를 통해 항-CD3/CD28 T 세포 자극 구슬을 제거하면 비특이적 살해를 줄이는 데 도움이 됩니다. 또한 T 세포는 자극 후 로그 성장기(보통 5일에서 20일 사이)에 사용하고, 세포를 검사 전날이 아닌 최소 이틀 전부터 사이토카인으로 증식하는 것이 권장됩니다.
   2. 전도 효율 분석을 바탕으로 실험군 간 CAR 전도 효율을 조정하여 전도하지 않은 T 세포와 혼합하여 최저 공통 퍼센트로 조정합니다.
      참고: 모든 그룹이 동일한 전속 효율을 가지면 조정이 필요하지 않습니다. CAR⁺ 비율이 다를 경우, 각 그룹이 동일한 유효 수의 CAR⁺ 세포와 CAR^세포 로 시작하도록 플레이트할 T 세포 수를 계산합니다. 이는 원하는 CAR⁺ 세포 수(E:T 비율과 종양 시딩 기반)에 100을 곱한 후 각 그룹별로 측정된 CAR⁺ 백분율로 나누어 나누는 후, 필요 시 전체 T 세포 수와 일치시키기 위해 미형질의 T 세포를 추가하는 방식으로 수행됩니다. 예를 들어, 한 그룹이 50% CAR⁺ T 세포를 가지고 있다면, 40,000개의 T 세포가 도금되어 있습니다(20,000 CAR⁺ + 20,000 CAR^-). 반면 60% CAR⁺ 세포를 가진 그룹은 33,333개의 T 세포를 도판하여 20,000개의 CAR⁺ 세포를 제공하며, 첫 번째 그룹의 총 T 세포 수(총 40,000개)와 일치하도록 6,667개의 비형질 T 세포를 추가합니다.
   3. 선택적으로, 사이토카인 또는 화합물을 조사할 경우, 인간 T 세포 배지와 원하는 사이토카인 또는 화합물을 혼합한 용액 20 μL를 최종 농도의 11배로 첨가할 수 있습니다. 이 부피는 각 웰에 이미 존재하는 표준 200 μL 위에 추가됩니다(블랭킹용 50 μL, 종양 세포 시딩 시 50 μL, T 세포 첨가용 최대 100 μL). 제조사에 따르면, E-Plate 96은 우물당 최대 243 μL ± 5 μL의 용량을 지원하므로, 이러한 선택적 처리에 적합한 총 용량은 220 μL입니다.
2. T 세포 시딩 및 측정
   1. T 셀을 추가할 준비가 되었을 때만 크래들을 해제하여 E-플레이트를 제거하세요.
   2. 종자 처리된 T 세포가 종양 세포에 직접 부착되었습니다.
   3. 크래들을 측정 장치 안에 잠그고 RTCA 소프트웨어에서 2단계를 중단하세요.
      참고: 2단계를 중단하지 않으면 시스템은 이전 단계를 계속 측정하며 해당 단계가 완료될 때까지 중단하지 않아 데이터 포인트가 손실됩니다.
   4. 2단계가 완료로 표시될 때까지 기다리세요.
   5. PLAY/RUN 버튼을 클릭하여 3단계(치료)를 시작하고, 확인 버튼을 눌러 프롬프트를 확인하세요.
      참고: 취급 후 15-30분의 평형 기간(예: 씨앗 또는 세포 이식 후)을 두어 다음 측정 단계(단계 3.2.5 이전)를 시작하면 성장 곡선의 온도나 pH 변동으로 인한 초기 편향을 최소화할 수 있습니다.

4. 2라운드 : 종양 세포 시드 (3일차)

1. 1.1 및 1.4 단계에서 설명한 새로운 96웰 xCELLigence E-플레이트를 준비합니다.
2. 2단계에서 설명한 대로 신선한 종양 세포를 씨앗으로 뿌리세요.
3. 세포 부착을 위해 E-플레이트를 하룻밤 동안 배양하세요.

5. 2라운드 : CAR T 세포를 두 번째 E-플레이트로 이식 (4일차)

1. 각 웰의 내용을 다중 채널 피펫을 사용해 U-bottom 96웰 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. E-플레이트 하단의 전극을 만지지 않도록 주의하세요.
2. 실온에서 원심분리기, 400 × 5분간 보관하세요.
3. 상정액을 조심스럽게 흡인하여 필요 시 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 위해 보관하십시오.
4. 세포 펠릿을 팽창 사이토카인 없이 100 μL 신선 배지에 재현탁합니다.
   참고(선택 사항): T 세포는 이제 분할(예: 50 μL = 1:2 분할)하여 유세포분석과 같은 추가 분석에 사용할 수 있습니다. 분리는 xCELLigence 살해 분석 중 증식에 맞춰 조절됩니다. 이 방법은 탈진이 명확해질 때까지 필요한 사이클 수를 줄이는 데 도움이 됩니다. 2와 4 사이의 분할 비율을 테스트하는 것이 권장됩니다.
5. 두 번째 종양 E-플레이트에 100 μL/웰 T 세포(1:2 분할 시 50 μL)를 추가하여 배지와 해당 시 사이토카인/화합물이 완전히 보충되도록 합니다.

   

6. 연쇄살인 분석 연속 (5일째부터 10일차 이후)

1. 4단계와 5단계를 반복하여 필요에 따라 추가 라운드를 48시간 간격으로 반복하세요.
2. xCELLigence 판독값과 ELISA 또는 유세포 분석법과 같은 보조 분석법을 사용하여 각 단계에서 살상 활동과 T 세포 지속 상태를 모니터링합니다.

7. 데이터 수집 및 E-플레이트 취급

1. 원하는 측정 시간이 끝난 후에는 소프트웨어에서 STOP 을 누르세요.
2. 이펙터-셀 추가 시점에 정규화된 데이터를 내보내고 평균화하지 않아 분석 소프트웨어(R, GraphPad Prism 등)에서 ±SEM 플롯을 정확히 할 수 있도록 합니다. 원한다면 평균화된 데이터셋을 내보내세요.
3. E-플레이트를 잠금 해제하고 제거하세요. 실험 결과를 소프트웨어에 공개하세요.
4. 추가 분석(예: ELISA용 상원액 또는 유세포 검사용 세포 채취)을 위해 E-플레이트를 세척하거나 인큐베이터에 보관하세요.

8. 선택 사항: 재사용 가능한 전자 플레이트 세척

참고: 이 선택적 단계는 실험 비용을 줄이기 위해 xCELLigence E-플레이트를 재사용할 수 있게 해줍니다. 재사용은 실험 전반에 걸쳐 E-플레이트의 전기적 특성이 안정적으로 유지되고 개별 우물이 허용 가능한 기준선 범위 내에 들어갈 때만 권장됩니다. 특히 수산화나트륨(NaOH)을 다룰 때는 모든 안전 절차를 준수하세요. 세척 후 전극의 전위 결함을 감지하기 위해 E-플레이트를 육안으로 점검하세요.

1. E-플레이트 하단에 닿지 않고 모든 내용물을 버리세요.
2. 각 우물은 200 μL 탈이온수로 세 번 세척합니다.
3. 각 웰에 0.1 M NaOH 200 μL 첨가합니다.
   주의: NaOH는 부식성이 있습니다. 지역 안전 지침을 준수하는지 확인하세요. 장갑, 코트, 안전 고글을 착용하세요. 안전 캐비닛에 1M NaOH를 넣으세요. NaOH 폐기물은 물을 틀어 싱크대에 버려서 적절히 희석되도록 하세요. 농축된 산과 염기를 절대 섞지 마세요. 산성에 물을 넣지 마세요; 산과 물만 섞었어요.
4. E-플레이트를 실온에서 5분간 배양하세요.
5. 각 우물은 최소 세 번 이상 탈이온수로 세척하여 잔류 NaOH를 모두 제거하세요.
6. E-플레이트를 휴지에 살짝 두드려 말린 후 자연 건조하세요.
7. E-플레이트는 바이오세이프티 캐비닛 안에서 최소 1시간 이상 UV 조명 아래에서 소독하거나 UV 방사선 장치 안에서 소독하세요.
   참고: E-플레이트를 웰이 정면으로 위를 향하도록 위치시키세요. 자외선은 플라스틱 웰 바닥을 통과하지 못합니다.

결과

프로토콜의 성공 시 종양 세포 생존력과 CAR T 세포 세포독성을 시간에 따라 반영하는 재현 가능한 임피던스 기반 측정값을 얻을 수 있습니다. 상용 RTCA 시스템을 사용하여 세포 성장과 세포독성을 평가하였습니다. 데이터는 정규화 셀 지수(NCI)로 표현되었으며, 각 시점의 CI를 선택한 정규화 시점의 CI로 나누어 계산했습니다. 정규화 시간은 이펙터 셀 추가되기 직전에 설정됩니다. 클리어런스 시간은 이펙터 추가 후 NCI가 0이 될 때까지의 간격으로 정의됩니다. NCI는 RTCA 소프트웨어로 계산되며, GraphPad Prism과 같은 통계 소프트웨어를 사용해 살균률과 제거 시간 등 추가 분석을 위해 내보낼 수 있습니다. 세포독성 반응 반응을 시각화하기 위해 대표적인 NCI 곡선을 생성하였습니다. 계산 원리에 대한 자세한 내용은 다른^곳에서 확인할 수 있습니다.

대표적인 실험에서, 2세대 CAR과 추가 키메라 사이토카인 수용체(CCR)를...

토론

이 프로토콜은 xCELLigence RTCA 플랫폼을 사용하여 여러 차례 항원 노출 과정에서 CAR T 세포 매개 세포독성을 평가하는 방법을 설명합니다. 임피던스를 통한 종양 세포 생존 가능성의 종단적 측정을 가능하게 함으로써, 이 접근법은 반복적인 세포독성 반응(연쇄 살인)을 라벨 없이 연속적인 형식으로 포착합니다. 이 프로토콜은 연속적인 종양 세포 재도전에 따라 T 세포 효과기 기능이 시간에 따라 어떻게 변화하는지를 모니터링하도록 설계되었으며, 기능 지속성, 조기 소진, 전반적인 살상 역학과 같은 매개변수에 대한 통찰을 제공합니다(그림 1).

재현성과 데이터 품질을 보장하는 데 중요한 절차적 측면이 있습니다. 첫째, 웰 내 피펫팅은 웰 바닥의 미세전극 표면을 손상시키지 않도록 신중하게 수행해야 합니다. 둘째, 블랭킹 단계는 전기적 기준선을 설정하고 셀 첨가 전에 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BxPC3	ATCC	CRL-1687
E-플레이트 96	애질런트	300600910
RTCA 소프트웨어 Pro (Basic)	애질런트	해당 없음	버전 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (다중 플레이트)	애질런트	해당 없음