MLV 기반 가성바이러스를 이용한 SARS-CoV-2 진입 억제제를 잠재적 항바이러스제로 식별하는 절차

요약

이 글에서는 루시퍼레이스 리포터 시스템을 이용한 SARS-CoV-2 의사형 입자를 생성하는 방법론과 이를 이용해 진입 억제제를 식별하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 재조합 인간 ACE2-Fc 융합 단백질과 소분자 화합물 아르비돌이라는 두 가지 다른 진입 억제제를 사용하여 입증되었습니다.

초록

SARS-CoV-2 바이러스는 2019년 등장 이후 전 세계적으로 막대한 질병과 사망률을 초래한 신종 인수공통전 병원체입니다. 바이러스 유입과 잠재적 항바이러스 화합물을 평가할 수 있는 안전하고 접근 가능한 플랫폼은 신종 변이에 대한 지속적인 신약 개발에 필수적입니다. 본 글은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하고 루시퍼레이스 리포터 유전자를 가진 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 기반 의사형 입자를 생성하는 고도로 최적화된 프로토콜을 설명하여, 생물안전성 레벨 2 조건 하에서 바이러스 진입 연구를 가능하게 합니다. 기술된 방법들은 최적화된 세포주 사용, 비용 효율적인 시약을 이용한 높은 형질전환 효율, 고효율 의사바이러스 생산, 감염성 적정을 통해 스크리닝 검사를 위한 최소 바이러스 투입량을 결정하는 방법을 상세히 설명합니다. 대표적인 결과는 감염된 세포에서 비감염 대조군에 비해 강력한 루시퍼라제 활성을 보여주며, 대조군 스파이크가 없는 세포와 VSV-G-가짜바이러스는 분석의 특이성을 확인시켜 줍니다. 더 나아가, 이 시스템은 바이러스 침입에 대한 억제 효과를 정량화하고 MTT 생존 가능성 검사법을 사용하여 세포독성을 평가하여 복합 스크리닝을 지원합니다. 전반적으로 이 재현 가능하고 확장 가능한 프로토콜은 중고처리량 신규 바이러스 진입 억제제의 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공하며, 항바이러스 후보 규명과 SARS-CoV-2 진입 메커니즘 연구의 진전에 기여합니다.

서론

2019년 말 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2형(SARS-CoV-2)의 출현은 전 세계적으로 수백만 명의 사망자를 초래한 전 세계적 팬데믹을 초래했으며, 전염율과 면역 도출 가능성을 높이는 새로운 변이체를 통해 여전히 위협이 되고 있습니다^. 코로나바이러스과(Coronaviridae)의 포위 RNA 바이러스인 SARS-CoV-2는 삼양체 스파이크(S) 당단백질을 이용해 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2) 수용체에 결합하여 숙주 세포 진입을 매개하고, TMPRSS2 및 기타 숙주 프로테아제에 의한 단백질 분해 활성화를 겪^습니다. COVID-19 증상을 관리하기 위한 여러 치료 옵션이 개발되었지만, 바이러스 변이의 지속적인 진화와 급속한 발전은 바이러스 진입을 연구하고 감염 초기 단계를 표적으로 하는 새로운 항바이러스 화합물을 평가할 안전하고 확장 가능한 시스템의 긴급성을 부각^{시킵니다.}

SARS-CoV-2 바이러스는 높은 전파 가능성으로 인해 일부^{지역에서 생물}안전 3단계 5등급으로 분류되어 있습니다. 따라서 어떤 복제 실험실 작업도 고격리 BSL-3 시설을 필요로 하며, 이는 대부분의 실험실이 이 바이러스를 대상으로 한 과학적 연구 능력을 저해합니다. 의사형 바이러스 기반 시스템(pseudoviruse, PVs)으로도 알려진 시스템은 생물안전성 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 바이러스 진입 연구를 가능하게 하는 실용적인 대안을 제공하여 전 세계 연구 접근성을 확대합니다⁶. SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 가진 의사형 입자는 복제하지 않아 바이러스 침투 평가와 소분자 억제제 스크리닝에 안전한 대리체로 사용된다⁷. 이 입자들은 루시퍼레이스 또는 형광 리포터 유전자를 운반하도록 설계될 수 있어, 감염된 세포에서 리포터 신호를 측정하여 감염을 빠르고 정량적으로 검출할 수 있습니다. 노이백혈병 바이러스(MLV) 또는 렌티바이러스 골격을 기반으로 한 시스템은 SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, 에볼라 바이러스 등 8,9,10,11 바이러스의 유입 연구에 널리 사용되어 왔습니다.

이 프로토콜에서는 Millet과 Whittaker⁸의 연구를 바탕으로 3-플라스미드 시스템을 이용한 MLV 기반 PV의 생성을 설명합니다. 사용된 플라스미드에는 MLV 핵심 유전자 gag-pol(pCMV-MLVgagpol)을 암호화하는 패키징 플라스미드, 리포터 유전자 루시페라제를 암호화하는 전송 벡터(pTG-Luc), 그리고 원래 우한-Hu-1 변이체에 해당하는 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질을 발현하는 플라스미드가 포함됩니다. 또한, 소포성 구내염 바이러스의 G-당단백질(VSV-G)을 이용해 초바이러스가 생성되어, 이후 잠재적 감염 검별에 활용됩니다. 유사바이러스는 HEK293 유래 세포에서 생성되며, hACE2와 TMPRSS2를 안정적으로 발현하는 매우 감수성 세포에 감염되는 데 사용됩니다. 형질전환 효율은 먼저 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 플라스미드를 사용하여 평가합니다. 그 후 최적화된 트랜스펙션 조건을 사용하여 이 세 플라스미드를 공동 트랜스펙션하여 PV를 생성하고, 그 결과 바이러스를 적정합니다. 적절한 양의 PV를 사용하여 96웰 플레이트에서 바이러스 유입을 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 분석이 수행됩니다. 이 프로토콜은 비용 효율적인 전환 시약으로 분기 폴리에틸레니민(PEI)을 사용하여 절차를 더 쉽게 구현할 수 있도록 합니다.

프로토콜

1. 분지된 폴리에틸레네이민(PEI)을 이용한 HEK293T유래 세포의 고효율 형질전환

참고: 생물안전 캐비닛 내 모든 단계를 표준 무균 기법과 BSL-2 절차를 사용하여 수행하십시오. HEK293T유래 세포를 사용하여 형질전환과 가짜형 바이러스 생성을 수행합니다. 이 방법에서는 세포를 세포 배양 처리한 6웰 플레이트에 형질전환합니다. PEI 스톡 해는 Yang 등(2017)이 이전에 설명한 대로 제조됩니다¹². 가짜 바이러스를 생성하기 위해 삼중 트랜스펙션을 진행하기 전에, 높은 트랜스펙션 효율(70-80% 이상)을 보장하기 위해 최적의 PEI-플라스미드 DNA 비율을 최적화하는 것이 권장됩니다. 이 최적화는 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 플라스미드를 형질전환한 후 형광 세포의 비율을 형광 현미경으로 확인하는 방식으로 이루어져야 합니다. 이 최적화를 위해 플라스미드 DNA는 웰당 2.5 μg로 일정하게 유지하고, 1-20 μL 범위 내에서 여러 양의 PEI를 검사합니다. 다음은 6웰 플레이트에서 웰당 5 μL PEI 스톡 용액(1 mg/mL)과 2.5 μg GFP 발현 플라스미드로 구성된 이 로트 세포와 PEI에 가장 적합한 조건입니다.

1. 6웰 조직 배양판에 웰당 7.5 x 10⁵ 개의 HEK293 유래 세포를 종자로, 전체 배지(DMEM-C: Dulbecco's Modified Eagle's Medium에 10% 열불활성화 태아 소 혈청(FBS), 20 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지네에인술폰산(HEPES), 100 IU/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 보충)에 6웰 조직 배양판에 씨앗을 투여합니다.
   참고: 세포를 시딩할 때는 조직 배양판을 원형 운동으로 움직이지 마세요. 이는 웰 중심에서 세포 응집을 일으켜 불규칙한 세포 분포와 그에 따른 형질전환 효율 저하를 초래할 수 있습니다. 6웰 플레이트 한 장이 한 실험에 충분하며, 여기에는 세포 대조(비형질염)용 웰 하나와 PEI-플라스미드 DNA 여러 비율을 검사하는 나머지 플레이트가 포함됩니다.
2. 세포를 37°C에서 5% CO₂와 함께 하룻밤 배양하세요. 다음 날, 세포 간 약 50-60% 정도가 융합되도록 하세요.
3. 형질전환 당일에는 멸균된 1.5mL 마이크로 원심분리관에서 PEI-플라스미드 DNA 복합체를 준비하세요.
   1. 각 웰마다 50 μL 환원 혈청 배지에 5 μL PEI 스톡(1 mg/mL)을 담은 PEI 용액 튜브와, 동일한 배지 50 μL에 2.5 μg GFP 발현 플라스미드를 담은 DNA 용액 튜브 1개를 준비합니다.
   2. 여러 우물을 트랜스펙션할 경우, 용액을 그에 맞게 확대할 수 있습니다. 각 튜브를 소용돌이로 잠깐 섞고 5초간 돌려 내려가세요. 튜브를 실온(RT)에서 10분간 배양하세요.
4. 이 배양 기간 동안, 세포 단층이 파괴되지 않도록 6웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하세요. 완전 형질전환 배지(DMEM-T, 항생제 없이 DMEM-C와 동일)로 1mL/웰로 조심스럽게 교체하세요.
5. 트랜스펙션 복합체를 준비하세요. 10분 배양 후에는 50μl DNA 용액 튜브를 PEI 용액 튜브에 추가합니다. 피펫팅을 6번 빠르게 섞고, RT에서 정확히 3분간 배양하세요. 즉시 각 해당 웰의 셀에 복합체를 드롭 단위로 추가합니다.
6. 플레이트 가장자리를 파라필름과 원심분리기로 1,000 x g 에서 30분 동안 브레이크 없이 RT에서 밀봉하며, 스윙 로터와 플레이트 버킷을 사용하세요.
7. 원심분리 후에는 파라필름을 부드럽게 제거하고 37°C, 5% CO₂에서 3시간 배양합니다.
8. 배양 후에는 각 웰에서 트랜스펙션 배지를 부드럽게 제거하고, 웰당 2mL의 미리 가열된 DMEM-C로 천천히 교체합니다.
9. 형질전환 세포를 37°C에서 5% CO₂와 함께 48시간 배양합니다.
10. 형광 현미경을 이용해 GFP 발현을 통한 트랜스펙션 효율을 평가합니다. 형광 세포의 빈도는 70-80% 이상이어야 합니다(그림 1). 이는 2절의 다음 방법의 효율성을 위해 매우 중요합니다.

2. SARS-CoV-2 스파이크 및 VSV-G 가짜형 가짜 바이러스 입자 생성

참고: 이 방법은 1절과 동일한 절차를 사용하지만, GFP 플라스미드를 사용하는 대신 세포를 가짜형 바이러스를 생성하는 데 필요한 세 가지 플라스미드와 공동 트랜스펙션하여 최적의 형질전환 조건을 통해 높은 형질전환 효율을 보장합니다. 프로토콜은 또한 HEK293T유래 세포를 6웰 플레이트에 사용하여 다음 세 가지 조건을 충족합니다: a) 비형질전환 세포(1개의 웰), b) MLV 패키징 플라스미드와 루시퍼레이스 리포터 전달 벡터만 형질전환한 세포(1개의 웰; 스파이크가 없는 가짜 바이러스), c) 이 두 플라스미드와 스파이크 발현 플라스미드를 통해 SARS-CoV-2 가짜형 바이러스를 생성하는 세포(4개의 웰). 여기서 사용되는 스파이크 발현 플라스미드는 SARS-CoV-2 우한 균주의 스파이크를 암호화하며, 단백질을 PV로 효율적으로 제시할 수 있도록 서열 변형을 포함하고 있습니다. 스파이크가 없는 가짜 바이러스는 감염 후 감염 시 허용 세포 내 스파이크 의존성 진입을 검증하기 위해 대조군으로 필요해질 것입니다. 마찬가지로, VSV-G-PV는 잠재적 억제성 화합물의 대선별용으로 사용될 동일한 실험 설계를 사용하여 생성됩니다. 더 많은 양의 의사바이러스가 필요할 경우, 프로토콜을 6웰 플레이트 두 개로 확장할 수 있으며, 이는 원심분리 단계에서 실용적일 수 있습니다.

1. 형질전환 전날, 1절에 설명한 대로 HEK293T 유래 세포를 두 개의 6웰 플레이트에 씨앗을 넣습니다. 한 판은 스파이크-PV를 생성하고, 다른 판은 VSV-G-PV를 생성하는 데 사용합니다.
2. 형질전환 당일에는 표 1에 표시된 대로 1.3단계를 따라 형질전환 혼합물을 준비합니다.
   참고: PEI 용액은 이전에 보고된¹²와 같이 준비됩니다. pCMV-MLVgagpol과 pTG-Luc 플라스미드는 Millet과 Whittaker⁸로부터 얻었습니다. 플라스미드 pVSV-G는 Gee 등, 2020,¹³에서 획득되었습니다. 모든 플라스미드는 내독소가 없는 고품질 준비 상태로 미리 준비되어야 합니다. 상업적으로 구할 수 있는 맥시렙 키트를 사용하는 것이 권장되며, 마지막 단계는 저결합 0.2 μm 주사기 필터를 통한 멸균 여과입니다.
3. 각 튜브를 1절에 설명한 대로 혼합하고 RT에서 10분간 배양합니다.
4. 이 배양 중에는 6웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하여 세포 단층이 파괴되지 않도록 합니다. 각 웰에 1mL의 미리 가열된 DMEM-T 배지를 천천히 교체하여, 배지가 웰 벽을 따라 흐르도록 하고 세포에 직접 닿지 않도록 합니다.
5. 1절에서 설명한 변환 복합체를 준비하고, 앞서 설명한 프로토콜을 사용하여 세포를 형질전환합니다.
6. 형질전환 후 48시간 배양 후 상원액을 수집하여 50 mL 멸균 원뿔 원심분리관으로 옮기고, 290 x g 원심분리기를 4 °C에서 7분간 원심분리합니다. 세포 없는 상정액을 수집한 후 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멸균 0.45 μm 상단 병 필터 유닛으로 여과합니다. 1mL의 알리코트를 준비하여 -80 °C에서 보관하세요.
   참고: 의사형 입자는 -80 °C에서 몇 달간 안정적입니다. 감염력을 유지하기 위해 반복적인 냉동-해동 과정을 피하세요.

	SARS-CoV-2 스파이크-PV(우물별 사용량)	VSV-G-PV(우물별 수)	스파이크 없는 PV(우물당 기준)
PEI 해결책:
PEI (1 mg/ml)1	5 μL	5 μL	5 μL
환원 혈청 배지	45 μL	45 μL	45 μL
플라스미드 DNA 용액:2
pCMV-MLVgagpol	0.79 μg	0.79 μg	0.79 μg
pTG-luc	0.92 μg	0.92 μg	0.92 μg
pUNO1-스파이크	0.79 μg	-	-
pVSV-G	-	0.79 μg	-
환원 혈청 배지	50 μL까지	50 μL까지	50 μL

표 1: PV 생성을 위한 트랜스펙션 믹스 준비.

3. SARS-CoV-2 및 VSV-G 가짜형 입자의 적정

참고: 이 단계는 생성된 의사형 입자가 감염성이 있음을 확인하고, 화합물 스크리닝과 같은 후속 적용에 필요한 최소 유효 부피를 결정하는 데 필수적입니다. 가짜 바이러스의 새로운 배치마다 조절이 이루어져야 합니다. 이를 위해 SARS-CoV-2 감염에 매우 취약한 세포(HSI 세포)는 가짜형 바이러스의 양을 감소시킵니다. 가시-인간 ACE2 상호작용이나 VSV-G가 다른 세포 수용체와 매개되는 가짜 바이러스의 유입은 72시간 후 발광 분석법에서 루시퍼라제 활성을 검출하여 모니터링합니다.

1. 전개 전날, 96웰 조직 배양판에서 웰당 2.5 x 10⁴ 개의 HSI 세포를 50 μL 완전 배지(DMEM-C)에 시드링합니다. 검사할 가짜 바이러스 양마다 세 개의 웰을 준비하고, 감염용 웰, 스파이크가 없는 가짜 바이러스, 그리고 비감염 세포를 위한 웰도 포함하세요. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂와 함께 하룻밤 배양하세요.
2. 전개 당일에는 각 가성바이러스 배치당 1알리코트를 해동해 얼음에서 테스트한 후 부드럽게 역전(inversion) 혼합합니다. 스파이크 없는 대조제 한 가지 항목도 포함하세요. 각 우물에 여러 양의 유사바이러스 준비제(100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8 μL)를 직접 첨가합니다. DMEM-C로 모든 웰의 부피를 150 μL로 조정하세요.
3. 플레이트를 파라필름과 원심분리기로 2,500 × g 에서 45분 동안 RT에서 45분 동안 밀봉하고, 브레이크 없이 작업하세요.
4. 파라필름 밀봉을 제거하고 37°C, 5% CO₂에서 72시간 배양합니다.
5. 배양 후에는 제조사의 지침에 따라 루시퍼레이스 분석에 대비하세요. 루시퍼레이제 기질(-80°C에 보관)과 5배 루시퍼라제 분석 용해 버퍼(-20°C에 보관)를 해동하고, RT(10-15분)에서 평형을 맞춥니다.
6. 루시퍼레이스 분석 용해 완충액을 멸균수에 1배로 희석하세요. 최소 3mL를 준비하세요.
7. 각 웰의 상액을 다채널 피펫을 사용해 천천히 조심스럽게 흡입하고 버립니다.
8. 각 웰에 1x 용해 버퍼 30 μL을 멀티채널 피펫을 사용해 추가합니다. 플레이트를 150rpm에서 10분간 RT 상태로 플레이트 셰이커에 넣습니다. 역현미경으로 완전한 용해를 확인하라(모든 세포는 용해되어 있으며 육안으로 구분할 수 없음).
   참고: 기판 추가 직후 즉시 발광 감지를 수행할 수 있도록 마이크로플레이트 리더를 미리 준비하여 일관성을 확보하고 신호 감쇠를 방지하세요.
9. 용해물을 불투명한 흰색 96웰 플레이트로 옮깁니다.
10. 각 웰에 50 μL 루시퍼라제 기질을 추가하고, 플레이트를 원을 그리며 잠시 혼합합니다. 플레이트를 광도계에 넣고 발광을 측정하세요.
11. 얻은 데이터를 분석하세요.
    1. 제어 장치가 예상 발광 값을 제공하는지 확인하세요. 감염되지 않은 세포가 배경 발광 값을 매우 낮게 내도록 하세요.
       참고: 스파이크가 없는 가짜 바이러스에 감염된 세포는 비감염 세포 수준에서 값을 보여야 하며, 스파이크 제시 가성바이러스 양이 감소하는 세포는 높은 용량 의존적 발광 값을 보여야 합니다(그림 2). VSV-G-PV가 생성하는 발광 값은 보통 스파이크-PV보다 훨씬 높으며, 약 1자릿수 또는 2자릿수 정도입니다.
    2. 이후 스크리닝에서는 감염되지 않은 세포보다 최소 100배에서 1,000배 이상의 신호를 생성하는 유사바이러스의 양을 선택하세요.

4. 스파이크-PV를 이용한 유사바이러스 침입 억제 물질 스크리닝

1. 3절에 설명한 바와 같이 50 μL 완전 배지(DMEM-C)에 웰당 2.5 x 10 4^{개의 HSI} 세포를 시딩합니다. 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 배양하세요.
   1. 화합물과 유사바이러스를 위한 1열부터 11열까지, 대조군을 위한 열(12번까지)을 포함하는 플레이트 설계를 고려해 보십시오. 12열에는 바이러스 통제(유사바이러스만)를 위해 4개의 웰과 감염되지 않은 비처리된 세포를 위한 4개의 웰을 할당합니다.
2. 다음 날, 50 μM(감염 시 최종 농도: 50, 16.6, 5.5, 1.8, 0.6, 0.2, 0.06 μM)에서 시험할 화합물을 1:3 단위로 연속 희석하여 0.5% DMSO를 함유한 DMEM-C에서 준비합니다.
   1. 편의를 위해 별도의 96웰 '희석판'에서 희석을 준비하는데, 여기서 먼저 연속 희석을 한 후 세포가 포함된 판에 50 μL을 전달합니다.
   2. 화합물 수가 수백 개 이상으로 매우 많다면, 이 첫 희석 연속을 희석점당 단일 웰을 사용해 약 4점으로 줄이고, 사전 스크리닝을 고려합니다. 그 후 50 μM 같은 농도로 3번 복제하여 7점 직렬 희석(1:3)을 사용해 잠재적 히트를 다시 테스트합니다.
3. 화합물 희석이 준비되면, 멀티채널 피펫을 사용해 세포 배지를 부드럽게 흡인하고, 해당 웰에 50 μL의 희석물을 첨가합니다. 37°C, 5% CO₂에서 1시간 배양합니다. 12열의 컨트롤은 DMEM-C만 추가하세요.
4. 화합물을 제거하지 않고, 각 우물에 50 μL 완전 배지 부피에 미리 정해진 양의 SARS-CoV-2 유사바이러스를 첨가하며, 동일한 농도의 화합물을 포함합니다. 판을 파라필름으로 밀봉하세요.
5. 플레이트를 2,500 × g 에서 브레이크 없이 RT로 45분간 원심분리한 후, 파라필름을 제거하고 37°C, 5%_CO2 에서 72시간 배양합니다.
6. 3절에 설명된 루시퍼레이스 기반 감염성 정량을 진행하세요.
7. 데이터 분석을 수행하세요.
   1. 발광 값을 스프레드시트로 내보내 데이터를 포맷하여 이후 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어에 가져올 수 있습니다.
   2. 각 농도 점의 평균과 평균선 기준오차를 포함한 막대 그래프를 준비하세요. 또한 양성(PV만)과 음성 대조군(비감염 세포)에서 얻은 값도 그래프로 표시합니다.
      참고: 검사 결과는 1) 감염되지 않은 세포에서 매우 낮은 값을 보였고, 2) PV 대조군에서 높은 수치를 보이며, 3) 억제 양성 대조군(예: arbidol 또는 hACE2-Fc)이 용량 의존적으로 감염 억제를 보일 경우 유효하다고 간주됩니다(그림 3A, B).
   3. 그 후 미지의 화합물이 생성하는 값을 관찰하여 억제 효과가 있는지, 용량 의존적 효과가 있는지 평가합니다. 그렇다면 이 화합물들을 추가적인 확인 분석에 적용합니다.
      참고: 잠재적 명중을 추가 확인하려면 다음 단계를 따라가시기 바랍니다. 먼저, 4.2단계에서 제안한 대로 잠재적 타격 복합물을 다시 테스트하세요. 선량 반응 효과가 확인되면 동일한 희석 시열을 사용하되 VSV-G-PVs를 감염시키는 역검별을 수행합니다. 이 검사는 침입 억제가 스파이크-ACE2 상호작용에 특이적인지, 감염된 세포에서 루시퍼라제가 생성되는 이후 단계에서의 간섭 때문인지 확인하는 데 중요합니다(그림 3A, B). 여기서 양성 화합물은 VSV-G-PV에 대해 억제 활성을 보이지 않아야 합니다. 이 경우, 동일한 농도 시리즈를 세포 생존성 검사(MTT 분석, 5절에 표시)를 사용하여 세포 독성을 검사해야 합니다. 요약하자면, 잠재적 히트 화합물은 SARS-CoV-2-스파이크-PVs를 억제하고, VSV-G-PVs는 전혀 또는 덜 억제하며, 세포의 생존 가능성에 대한 억제는 없거나 적어도 훨씬 약해야 합니다. 발광 데이터를 이용해 선량-반응 곡선을 조정하면 PV 억제에 대한 최대 억제 농도(IC₅₀)와 생존 가능성 분석법에서 최대 세포독성 농도(CC₅₀)를 추정할 수 있습니다. CC₅₀ / IC₅₀ 비율은 선택성 지수(SI)를 계산하는 데 사용되며, 이는 양성 화합물의 잠재적 유용성을 나타내는 중요한 지표입니다. 용량-반응 곡선 분석과 IC₅₀ 및 CC₅₀ 추정을 위해 매우 상세한 절차^{가 기술되었습니다}.

5. MTT 기반 세포 생존 가능성 분석

1. 96웰 플레이트에 50 μL DMEM-C 안에 웰당 4^{개의 HSI} 셀 2.5 x 10을 씨앗. 플레이트를 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 배큐하세요. 다음 날 세포 수치가 약 50% 정도 되도록 하세요. 평가할 화합물의 다양한 농도를 고려하여 충분한 웰을 준비하고, 처리되지 않은 세포와 배지만 포함된 빈 웰을 3장씩 준비합니다. PV 진입 억제 분석법에서 평가한 동일한 농도로 잠재적 히트 화합물을 검사합니다.
2. 배양 후에는 배지를 조심스럽게 제거하고, 0.5% DMSO의 다양한 농도의 화합물을 포함한 100 μL 완전 배지를 교체하여 평가합니다.
3. 브레이크 없이 2,500 × g 에서 45분간 원심분리하여 37°C, 5% CO₂에서 72시간 배양합니다. 이 단계는 셀을 이전 섹션에서 처리한 것과 정확히 일치하지만, PV를 추가하는 것을 제외하면 포함됩니다.
4. DMEM을 사용하여 0.5 mg/mL MTT 용액을 준비합니다. 0.2 μm으로 필터링하여 멸균하고 어둠 속에서 지내세요.
   참고: 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드(MTT)는 빛에 민감합니다. 어둠 속에 냉동 보관해야 합니다.
5. 각 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하고 100 μL MTT 용액으로 교체하세요. 37°C,_CO2 5%에서 2시간 배양합니다.
6. 이 배양 과정 동안, 40 mM HCl이 포함된 용해화 용액을 이소프로필 알코올에 준비합니다.
7. 각 웰 바닥의 포르마잔 결정체를 건드리지 않고 다채널 피펫을 사용해 MTT 용액을 조심스럽게 제거하세요.
8. 각 웰에 용해화 용액 100 μL를 추가합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸서 150rpm 속도로 플레이트 셰이커에 15분간 올려놓으세요.
9. 570nm와 630nm에서 흡광률을 기록했습니다.
10. 데이터 분석을 수행하세요.
    1. 광 밀도의 원시 값을 사용하여, 각 웰마다 570 nm에서 얻은 값에서 630 nm에서 얻은 값을 빼는 값입니다. 그 다음 처리되지 않은 셀 웰의 보정값을 평균화합니다. 이 처리되지 않은 세포들은 100% 생존 가능하다고 생각하세요.
    2. 그 다음 처리된 셀의 값을 처리되지 않은 셀의 웰과 정규화하는데, 다음과 같은 공식을 사용한다:
       생존 가능성 (%) =
11. 평±±균의 표준오차를 나타내는 막대 단위로 프로트 생존 가능 백분율을 복제합니다. 추가 통계 분석을 수행하여 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어에서 구현된 절차를 사용하여 그룹을 비교하며, 서로 다른 농도에서의 생존도를 처리하지 않은 세포 대조군과 비교합니다.
12. 각 농도의 평균을 DMSO 단일 처리된 세포와 비모수 Kruskal-Wallis with Dunn 사후 검사를 사용해 비교하라( 차이는 p값 < 0.05에서 유의한 것으로 간주됨). 용량-반응 곡선을 그리고 OD 값에서 CC₅₀ 을 추정할 때는 보고된 절차를 확인하라, 그렇지 않으면¹⁴였다.

결과

칼슘 인산염¹⁵, 지질 기반 방법¹⁶, 선형 및 분기 PEI 등 여러 형질전환 방법이 PV를 생성하는 것으로 보고되었습니다. 이 논문은 분지된 PEI를 가진 HEK293T유래 세포의 형질전환이 고효율 형질염화를 가능하게 함을 보여준다(그림 1). 이는 일반적으로 시판용 지질 기반 형질염색제를 이용한 형질염색법과 유사하다(데이터는 제시하지 않음). 우리 조건에서 발견된 최적 PEI 양에 해당하는 대표적인 결과가 제시되며, 이는 1절에서 설명한 조건에서 2.5 μg의 GFP 발현 플라스미드에 대해 PEI 스톡 용액 5 μL에 해당합니다. 그러나 새로운 플라스미드 및 PEI 배치마다 이 단계에서 여러 GFP 발현 플라스미드-PEI 비율을 테스트하고, 플라스미드 양을 일정하게 유지하며, 1 mg/mL 재고에서 1에서 20 μL 범위의 여러...

토론

MLV 시스템이 다른 바이러스에 대해 가짜형 생성에 있어 갖는 다재다능함은 에볼라^{바이러스 18}, MERS-CoV⁸, SARS-CoV¹⁹, 라 크로스 바이러스²⁰, 한타바이러스²⁰, 비스나 바이러스²¹, 아레나바이러스^22, 인플루엔자 바이러스²³ 등 다른 중요한 바이러스들에서도 보고되었습니다. 이 의사형들은 바이러스 트로피즘 연구(¹⁹), 유전자 치료에서의 잠재적 활용(²⁴), 중화항체의 검출 및 정량화(²⁵

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 & 마이크로; m 저단백질 결합 주사기 필터	써모 사이언티픽	720-1320	주사기 필터 (0.2 & mu; m, 13 mm, PES, 불임)
0.25% 트립신-EDTA 1X 용액	깁코	25200-056	트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드
0.45 & 마이크로; m PVDF 병뚜껑 필터 유닛	아반토르	514-1045	병뚜껑 진공 여과 시스템 (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0.45 및 마이크로; m)
1.5 mL 멸균 마이크로 원심분리관	에펜도르프	30123611	금고-잠금장치; 진공관
100 X 페니실린 스트렙토마이신 용액	코닝	30-002-CI	페니실린-스트렙토마이신 용액, 100배
5 X 루시페라제 분석 용해 버퍼 & nbsp;	프로메가	E2650	프로메가 브라이트-글로우 루시페라제 분석 시스템의 일부입니다
50 mL 멸균 원뿔관	코닝	352070	50 mL 고투명도 PP 원심분리관, 원뿔형 바닥, 멸균
6웰 조직 배양 플레이트	써모 사이언티픽	140675	세포 배양 처리된 멀티디시
96웰 조직 배양 플레이트	써모 사이언티픽	168055	Nunc™ 마이크로웰&트레이드; 96-웰, 눈클론 델타 처리, 평평한 바닥 마이크로플레이트
아비돌 하이드로클로라이드	시그마-올드리치	SML0860
분기 폴리에틸레니민, 25 kDa	시그마-올드리치	408727
공초점 레이저 현미경   (FV 3000)	올림푸스 컴퍼니	SKU: FV3000
디메틸 설폭사이드 (DMSO)	시그마-올드리치	D8418
DMEM (둘벡코 변형 이글 미디엄) 함유: 고포도당, L-글루타민, 페놀 레드, 피루베이트나트륨)	깁코	11995-065
태아 소 혈청 (FBS)	깁코	26140-079	열 비활성화 (56° C, 30분)
HEK293T유래 세포 (Lenti-X 293T 세포주)	타카라 소개	632180	HEK293 세포주의 고도로 형질전환 가능한 서브클론이며 높은 수준의 바이러스 단백질 발현을 지원합니다
HEPES 버퍼	깁코	15630-080
감염에 매우 취약한 세포(293T-ACE2). TMPRSS2 (mCherry) 세포 라인)	BEI 리소스	NR-55293	ACE2와 TMPRSS2를 안정적으로 발현하도록 변형된 HEK293T 세포주
염산과 nbsp;	시그마-올드리치	H1758-500ML
역위상 대비 현미경	올림푸스 컴퍼니	스쿠: 2404040005
이소프로판올	시그마-올드리치	I9516-500ML
루시페라제 기질	프로메가	E2650	밝은빛 루시페라제 분석 시스템의 일부입니다
발광 검출이 가능한 마이크로플레이트 리더	애질런트 바이오텍	BTH1MG
MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드]	시그마-올드리치	M2128
불투명 흰색 96웰 플레이트	코닝	3917	96웰 솔리드 화이트 플랫 바텀 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트
파라필름	베미스	PM999
pcDNA3-EGFP 플라스미드	애드진	13031	pcDNA3-EGFP는 더그 골렌복(Addgene 플라스미드 #13031; http://n2t.net/addgene:13031; RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol 플라스미드	-	-	게리 휘태커 박사님께서 친절히 기증하셨습니다.
Ca2+ 및 Mg2+ 없이 인산 완충 식염수 (PBS)	코닝	21-040-CV	인산 완충 식염수, 칼슘과 마그네슘 없이 1배
Promega PureYield 플라스미드 맥시프렙 시스템	프로메가	A2393
pTG-Luc 플라스미드	-	-	게리 휘태커 박사님께서 친절히 기증하셨습니다.
pUNO1-SARS-CoV-2 스파이크(우한) 플라스미드	인비보젠	P1-스파이크
pVSV-G 플라스미드	애드진	138479	pVSV-G는 아키츠 홋타(Addgene 플라스미드 # 138479; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
재조합 인간 ACE2-Fc 융합 단백질	인비보젠	fc-hace2
환원 혈청 배지 (옵티-MEM)	깁코	31985-070	옵티-MEM 환원 혈청 배지