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방법 논문

세포외 플럭스 분석법을 이용한 1차 미세아교세포의 당화 연구

258 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69638

⸱

2026년 4월 10일

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 1차 마우스 미세아교세포에서 대사 재프로그래밍을 정량화하기 위해 해당분해 스트레스 검사를 비용 효율적으로 수행하는 방법을 설명합니다. 분리 및 염증 자극 후, 신선하게 준비된 pH 조정 시약을 사용해 세포외산성화 속도(ECAR)를 측정한 후, 단백질 정규화를 통해 당해질 변화를 정확하고 재현 가능하게 평가합니다.

초록

미세글리아는 중추신경계의 상주 대식세포로, 생리적·병리학적 신호에 반응하여 대사 프로그램을 역동적으로 변화시킵니다. 이러한 대사 변화를 이해하는 것은 염증에서 그 역할을 밝히는 데 매우 중요합니다. 여기서는 신생아 마우스 뇌 피질에서 분리된 1차 미세아세포의 당해작용 프로필을 세포외 플럭스 분석기에서 당해 스트레스 검사를 통해 평가하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석법은 락테이트와 같은 낮은 pH와 관련된 당분해 활성의 지표인 ECAR의 실시간 측정을 가능하게 합니다. 저희 접근법은 다양한 조건에서 배양된 미세아교세포를 처리하여 대사 경로가 염증 유발 자극을 포함한 다양한 자극에 어떻게 변화하는지 조사하는 것입니다. 저희 연구실은 독특하게도 포도당, 올리고마이신, 2-디옥시글루코스(2DG) 등 다양한 시약의 신선한 재고 용액을 준비하여 경로의 다양한 측면을 표적으로 삼으며, 각 시약별로 pH를 세심하게 조절하여 실험적 정확성과 재현성을 보장합니다. 이 방법은 원발 미세아교세포의 당화 연구를 위한 견고한 기반을 제공하며, 염증성 또는 질병 관련 조건에서 이들의 기능 상태에 대한 통찰을 제공합니다.

서론

중추신경계의 세포는 정상 및 질병 상태에 반응하여 에너지 생성 방식을 변화시킵니다 1,2. 주요 대사 경로 중 해당과정과 산화 인산화(OXPHOS)는 면역 세포 기능을 조절하는 주요 경로로, 각각 촉진염증 및 항염증 상태에 대해 강력하고 즉각적인 반응을 수행한다 3,4. 따라서 면역 세포는 염증 신호와 기능 상태에 반응하여 대사 경로를 전환할 수있습니다. 미세아교세포는 골수계 유사체와 마찬가지로 대사적으로 기능과 연관되어 있으며, 대체 대사 연료로서 다양한 경로에 빠르게 적응하여 대사 유연성을 보입니다 6,7. 미세아교세포는 염증 중에 빠르게 대사 재프로그래밍을 겪으며, 강화된 당해작용이 염증 유발 상태의 주요 대사 신호로 작용합니다8. 따라서 대사 표현형에 대한 세포 의존성을 식별하는 검사는 다양한 조건에서 이들의 기능 상태를 조사할 수 있게 합니다. 현재 프로토콜에서는 1차 미세아교세포가 염증성 질환 시 당해가 증가하는 것에 의존하는지 규명하는 것을 목표로 합니다. 이를 위해 우리는 정기적으로 당분해 스트레스 테스트 검사를 수행합니다. Seahorse XFe24 분석기(세포외 플럭스 분석기)는 불멸화된 세포주와 형질전환 세포에서 ECAR 측정에 널리 사용되어 왔지만, 원발 미세아리아는 제한된 세포 수율, 변동성 부착 특성, 배양 조건에 대한 높은 민감성 등 독특한 기술적 도전을 제기하고 있어 대사 측정에 혼란을 줄 수 있습니다. 더불어, ECAR의 실시간 측정을 제공하여 종말 락테이트 분석만으로는 포착할 수 없는 여러 시점에서 락테이트 기반 당분해를 정밀하게 평가할 수 있게 합니다. 세포외 플럭스 기반 대사 프로파일링은 세포 생체에너지를 특성화하는 대사 연구에 널리 채택되어 이 프로토콜은 활성화, 질병 모델링, 약물 시험 중 세포의 대사 변화를 조사하는 연구에 적합합니다. 독자는 1차 세포 내에서 동적이고 고해상도의 당분해질 측정이 필요하다는 필요성에 따라 적합성을 판단할 수 있습니다.

포도당은 당화과정을 통해 피루브산으로 대사되고, 이후 세포질 내에서 젖산으로, 또는 미토콘드리아에서 CO₂와 물로 전환됩니다. 포도당이 젖산으로 전환되면 양성자가 세포외 공간으로 방출되어 중간 산성화가 일어납니다. 세포외 플럭스 분석기는 이 산성화를 ECAR9로 정량화합니다. 당분해 스트레스 검사에서는 세포를 먼저 포도당 및 피루빈산이 없는 배지에서 배양하고, 기초 ECAR가 기록됩니다. 첫 번째 주사는 포화 상태의 포도당을 전달하며, 세포는 당화 과정을 통해 피루브산으로 대사되어 ATP, NADH, 물, 양성자를 생성합니다. 증가된 양성자 방출은 ECAR를 높여 '당화'를 반영합니다. 다음으로 올리고마이신이 첨가되어 미토콘드리아 ATP 합성을 억제하여 세포가 오로지 당화에만 의존하도록 강요합니다. 이 양성자 기울기의 변화는 ECAR를 더욱 증가시키며, 세포의 최대 당분해 용량으로 측정됩니다. 마지막으로 포도당 유사체인 2DG가 도입됩니다. 헥소키나아제를 경쟁적으로 억제하여 당화작용을 차단하고 ECAR를 감소시킵니다. 이 감소는 이전 ECAR가 당화 의존적이었음을 확인시켜 줍니다. 최대 당분해 용량과 당화 수준 간의 차이가 당당 저장고를 정의합니다. 포도당 첨가 전 초기 ECAR는 다른 세포 과정에서 비글리콜리틱 산성화를 나타냅니다(그림 1).

우리는 세포외 플럭스 분석기를 이용해 당해과정 스트레스 검사를 수행했습니다. 원시 ECAR 값은 분석을 위해 엑셀로 내보내졌습니다. 각 상태에 대해 기저 ECAR(포도당 첨가 전), 당분해(포도당 주사 후), 당분해 능력(올리고마이신 치료 후)에 해당하는 시점을 확인했습니다. 각 단계 내 관련 시점과 네 번의 기술적 복제 전반에 걸친 ECAR 값을 평균화하였고, 당해작용은 포도당 첨가 후 ECAR 증가량으로 계산되었습니다. 당분해 용량은 올리고마이신 첨가 후 ECAR 증가량으로 계산되었습니다. 당분해 예비량은 2DG 주사 후 ECAR 감소로 계산되었습니다. 이 평균 값은 그룹 간 대사 반응을 비교하는 데 사용되었습니다.

반면, 산소 소비율(OCR)과 미토콘드리아 기능을 평가하기 위해 미토콘드리아 스트레스 검사(Agilent)가 표준 접근법으로, 기저호흡, ATP 연관 호흡, 양성자 누출, 최대 호흡, 여분의 호흡량, 비미토콘드리아 호흡과 같은 매개변수를 측정합니다. 이 측정값은 특정 미토콘드리아 억제제인 올리고마이신(ATP 합성효소 억제제), FCCP(카보닐 시안화물-4(트리플루오로메톡시) 페닐하이드라존, 최대 호흡을 유도하는 분리체, 로테논/안티마이신 A(복합체 I/III 억제제)를 순차적으로 주입하여 얻어져 미토콘드리아 건강 및 생체에너지학을 정량적으로 평가할 수 있습니다 10,11,12,13. 따라서 ECAR 분석과 OCR 분석은 서로 다른 조건에서 수행됩니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 캐나다 동물 관리 위원회의 지침에 따라 진행되었으며, 뉴펀들랜드 메모리얼 대학교 동물 관리 위원회의 승인을 받은 프로토콜 번호 22-01-DK를 받았습니다.

1. 실험 시작 전 준비

  1. Ca2+ 및 Mg2+ 없이 1x HBSS에 10 mM HEPES를 첨가하여 해부 용액을 준비합니다.
  2. 2–3개의 뇌당 1mL 2.5% 트립신(10배 스톡, 희석되지 않음), 2mL 해부액, 200 μL DNase I(1 mg/mL)를 혼합하여 소화액을 준비합니다.
  3. 혼합 교세포 배지를 DMEM에 10% FBS, 1x 글루타맥스, 1x 항생제/항균제를 보충하여 준비하세요.
  4. 미세아리아 배지를 DMEM에 10% FBS, 1x 글루타맥스, 1% MEM NEAA, 1x 피루베이트 나트륨, 1x 페니실린/스트렙토마이신을 보충하여 준비합니다.

2. 혼합 교세포 배양의 플레이트 (그림 2A)

  1. 첫째 날:
    1. C57BL/6C 마우스에서 출생일(P0)-P2 새끼를 채취하여 입체 현미경으로 피질을 추출한 후 수막을 제거합니다. 그 후 피질을 해부 용액에서 아주 작은 조각으로 분리하여 15mL 원뿔 튜브로 옮깁니다. 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 두세요.
    2. 해부 용액을 디캔트하고 2–3개의 뇌에 3mL의 소화액을 넣습니다. 2mL 혈청 피펫을 사용해 조직을 부드럽게 분사하여 해리합니다.
    3. 튜브를 인큐베이터 내 로터에 37 °C에서 놓고, 2mL 혈청 피펫으로 8분마다 분쇄하여 약 24분간 혼합합니다.
    4. 조직 소화 후에는 300 x g 에서 실온(RT)에서 5분간 원심분리합니다. 그 후 상원액을 버리고 5mL의 혼합 교세포 배지에 다시 부유합니다.
    5. 18G 바늘을 5mL 주사기에 넣어 세포를 분쇄한 후 70 μm 나일론 세포 체에 통과시킵니다. 다시 300 x g 에서 5분간 RT 환경에서 원심분리합니다.
    6. 처음에는 펠릿을 혼합 교세포 배지 1mL에 재현탁하고 여러 차례 분쇄하여 세포 응집을 제거한 후, 다시 더 큰 용량으로 재현탁하여 각 T75 플라스크에 최대 12 mL를 만듭니다(플라스크당 2–3개의 뇌 피질이 권장됨)
      참고: 플라스크에 폴리-D-라이신이나 다른 시약을 코팅할 필요는 없습니다.
  2. 둘째 날에는 전체 배지를 교체하고 신선한 혼합 교세포 배지를 추가하세요.
  3. 3일째에는 약 3분의 2의 2를 신선한 혼합 교세포 매체로 교체하세요. 세포를 추가로 7일 더 성장시키면 총 10일이 됩니다.
    참고: 이 시점에서 성상교세포 층이 관찰됩니다.
  4. 6일째에는 배지의 3분의 2를 신선한 혼합 교세포 배지로 교체하세요. 합류한 성상세포층의 존재를 확인해.

3. 순수 1차 미세아교세포 획득 (그림 2A)

참고: 10일째 무렵, 성상교세포층 위에 떠 있는 작고 둥근 세포가 보입니다; 이들은 주로 미크로글리아입니다(그림 2B).

  1. 플라스크를 250rpm에서 37°C에서 2시간 동안 흔듭니다. 떠다니는 세포가 포함된 전체 배지를 15mL 원뿔관에 모아 300 x g 에서 10분간 원심분리합니다.
  2. 펠릿을 미세아리아 배지에 재현탁하고, 세포외 플럭스 분석기의 세포 배양 마이크로플레이트에서 웰당 약 25만 개의 세포를 플레이트합니다.
    참고: 3개의 T75 플라스크에서 약 300만 –400만 개의 세포가 mL당 얻어집니다; 세포 배양 플레이트에 폴리-D-라이신이나 기타 시약을 코팅하는 것은 필수 사항이 아닙니다.
  3. 마이크로플레이트를 5%CO2 에서 30–45분간 배양합니다. 그 후 배지를 다시 바꿔 순수 미세아교세포 배양을 얻고, 아직 떠 있을 수 있는 올리고덴드로사이트도 제거하세요. 세포는 다음 날 바로 치료를 받을 준비가 되어 있습니다(그림 2C).
  4. '배경' 대조군으로 지정된 네 개의 웰은 세포 시딩에서 제외하는데, 각 행에 하나씩 있습니다 (그림 3C). 이 우물들은 분석 매개체를 받습니다.
    참고: 사용하지 않는 우물은 멸균수나 PBS로 채워 배지 증발을 방지하고, 세포를 고정된 행이나 열이 아닌 무작위 패턴으로 배팅하여 판 기반 변동성을 최소화하세요.

4. 염증 촉진 자극을 이용한 원발성 미세아교세포 치료

  1. 11일째에는 세포에 100 ng/mL 지지다당류(LPS)를 24시간 동안 투여합니다. 위치 효과를 배제하기 위해 대조와 LPS 처리된 우물을 무작위로 배치합니다.
    참고: 처리 기간은 실험 조건에 따라 달라질 수 있으며 사전 최적화가 필요합니다.

5. 실험 하루 전 세포외 플럭스 분석 준비

  1. 11일째에는 모든 웰의 교정판(24웰 형식; 세포외 플럭스 분석 키트)에 1mL 캘리브런트 버퍼를 추가합니다. 플레이트를 CO2 없이 37°C에서 하룻밤 보관하세요.
    참고: 교정판은 4개의 주입 웰로 구성되어 있습니다. 당분해 스트레스 검사에서는 포도당을 포트 A에, 올리고마이신을 포트 B에 첨가하고, 2DG를 포트 C에 주입합니다( 그림 4A 참조).
  2. 포도당 및 2DG 스톡 용액을 준비하세요
    1. 포도당 – 2mL의 세포외 플럭스 분석액에 90mg의 포도당을 용해합니다 (재료표). 처음에는 약 1.9mL에 용해하여 다음 날 1N NaOH로 pH를 조절할 때 최종 부피가 2 mL를 넘지 않도록 하여 몰 농도를 유지하는 데 매우 중요합니다.
    2. 2DG – 328 mg을 2mL의 세포외 플럭스 분석 배지에 용해합니다.
      참고: 포도당과 2DG는 모두 4°C에서 하룻밤 보관하세요
  3. 50mL 원뿔형 튜브에 30-40 mL의 분석 배지를 분리하여 다음 날 검사를 위해 4 °C에서 보관합니다.

6. 세포외 플럭스 분석(12일차)

  1. 12일째에는 미리 조성된 포도당, 2DG, 그리고 분리된 분석 배지를 37°C에서 예열합니다. 포도당과 2DG, 그리고 분리된 분석액의 pH를 1N NaOH를 단위로 추가하여 7.4로 조절합니다(예: 5 μL, 그 다음 10 μL).
  2. pH가 7 이상이 될 때까지 잠시 소용돌이가 섞여 균일하게 섞입니다.
    참고: 일관된 pH 모니터링을 위해 pH 지시 스트립을 권장합니다.
  3. pH 조정 검사 배지 2mL에 10mM 올리고마이신 정액 2 μL을 첨가합니다.
    1. 10mM 올리고마이신 스톡 용액 제제: 10mg 올리고마이신 바이알을 1mL 멸균 DMSO에 재구성하여 10 mg/mL 농도로 만들고, -80 °C에서 보관하여 추가 사용 시까지 보관합니다.
  4. 인큐베이터에서 세포를 꺼내(4단계에서) 1.5mL 마이크로 원심분리관에 넣어 300 x g 에서 5분간 원심분리합니다.
  5. 상정액을 수집하고(세포나 이물질을 제거하기 위해 펠릿을 버리세요) 8단계에서 언급한 락테이트 측정을 위해 -80°C에 보관하세요.
  6. 세포가 떠나지 않도록 pH 조정 검사 배지 1mL로 매우 부드럽게 세척하세요.
  7. 분석 배지를 버리고 pH 조정 검사 매체 500 μL을 추가하여 37 °C(CO2 제외)에서 45분에서 1시간까지 배양합니다.
  8. 그동안 필요한 모든 억제제를 세포외 플럭스 분석기의 교정판에 각 포트에 추가하세요 - 모든 웰의 왼쪽 위 포트 A 포트 A에 55 μL 포도당을, 오른쪽 위 웰 포트 B 포트 60 μL 올리고마이신, 왼쪽 하단 웰(배경 웰 포함)의 포트 C 65 μL 2DG 참조( 그림 4A 참조).
    참고: 각 단계에서의 부피 증가는 몰 농도를 유지하기 위해 필요하며, 포도당과 올리고마이신이 추가되면 부피가 증가합니다.
  9. 억제제를 추가한 후, Agilent Seahorse Wave 소프트웨어를 사용해 당분해 스트레스 테스트를 설정하세요(그림 3 참조). 그 후 안내가 나오면 보정판을 실행하세요.
    참고: 교정판을 기계에 넣기 전에 플레이트의 상단 커버와 플레이트 사이의 분홍색 커버를 제거하세요. 이 단계에서 pH와O2 센서를 테스트하고 품질 관리(QC)를 점검합니다.
  10. 보정이 끝나면 기계는 보정판을 내리고 배양판을 적재하라는 메시지를 보냅니다.
    1. 1단계: 분석 템플릿 선택 (그림 3A)
      1. Wave 소프트웨어를 열고 템플릿 섹션에서 실험에 맞는 분석 템플릿을 선택하세요.
      2. 이 경우 세포외 플럭스 분석기에서 "XF 당해 스트레스 테스트" 를 선택하세요.
    2. 2단계: 그룹 및 주입 전략 정의 (그림 3B)
      1. 그룹 정의 탭으로 가서 실험 그룹(예: 배경, 대조군, LPS)을 만드세요.
      2. 각 포트에 주입할 화합물을 선택하여 주 입 전략 을 정의하세요(예: 당분해 스트레스 검사용 포도당, 올리고마이신, 2DG; 이 설정들은 소프트웨어가 기본값으로 미리 설정한 것이므로 적절히 확인하세요).
    3. 3단계: 플레이트 맵에 그룹 할당 (그림 3C)
      1. 플레이트 맵 뷰를 열고 그룹 이름(예: 배경 = 검은색, 제어 = 녹색, LPS = 빨간색)을 플레이트 레이아웃에 드래그하여 각 그룹에 웰을 할당합니다.
      2. 정확한 정규화를 위해 빈 우물/배경 우물이 지정되었는지 확인하세요.
    4. 4단계: 프로토콜 설정 (그림 3D)
      1. 프로토콜 탭에서 측정 사이클과 주입을 프로그래밍 하세요 . 당분해 스트레스 검사의 일반적인 순서는 비당당산화, 당→ 측정하는 포도당 주입(포트 A), 당분해 용량 측정→ 올리고마이신(포트 B) 주입 , 당 저장 측정 2-DG(포트 C) 주입 , 당→ 저장고 측정
      2. 각 주입 후 측정 사이클 수를 정의하고 타이밍을 조정하세요(예: 3분 혼합 3사이클, 2분 대기, 3분 측정).
        참고: 저희 실험에서는 소프트웨어의 기본 설정을 사용합니다.
      3. 분석 전에 총 분석 시간을 검토하세요.
    5. 단계 V: 정규화 (그림 3E)
      1. 내장된 정규화 옵션(예: 단백질 함량, 세포 수, 기타 사용 가능한 방법)을 사용해 Wave 소프트웨어 내에서 비신코닉산(BCA) 분석법에서 얻은 단백질 농도 값과 데이터를 정규화합니다. 단백질 농도 측정값은 표 1에 나와 있습니다.
        참고: ECAR 측정 후 BCA 분석용 단백질 분리 프로토콜은 다음 7단계에서 설명되어 있습니다.

7. 데이터 정량화 및 정규화를 위한 셀 수집

  1. 세포외 플럭스 분석이 완료되면 배양 플레이트를 제거하고 즉시 단백질 추출을 진행하거나 단백질 추출 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
    참고: 단백질 분석법은 서로 다른 처리 조건에서 값을 정규화할 수 있게 해줍니다(이는 데이터를 정규화하는 방법 중 하나이지 유일한 방법은 아닙니다).
  2. 즉각적인 단백질 분리를 위해 검사 배지를 웰에서 제거하고 500 μL RT PBS(1회)로 한 번 세척합니다(세포 단층 파괴를 최소화하기 위해 부드러운 한 번 세척이 권장됩니다).
  3. 이 과정에서 분리될 수 있는 세포를 채취하려면, 플레이트를 300 × g에서 5분간 원심분리한 후 PBS를 버리고 얻은 펠릿을 RIPA 버퍼에 재현탁하여 정확한 총 단백질 측정을 보장합니다.
  4. 각 웰에 약 75–100 μL RIPA 버퍼를 추가하고, 플레이트를 셰이커(저회전-중간 회전)에 올려 30분(RT) 보관합니다. 그 후 내용물을 신선한 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
    참고: RIPA 버퍼를 1.5ml 마이크로 원심분리관으로 옮기기 전에 웰 내에서 분쇄하고 잘 혼합하세요.
  5. 마이크로 원심분리기를 회전기에서 약 30분간 RT에서 배양하여 세포가 제대로 용해되도록 하세요. 이 기간 동안 원심분리기를 4°C로 미리 냉각합니다.
  6. 세포를 16,000 x g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리합니다. 세포 잔해가 들어 있으니 이 펠릿은 버려야 합니다.
  7. BCA 분석법(또는 다른 선호 방법)을 사용하여 상원액을 채취하여 단백질 정량을 수행합니다. 즉시 진행하거나 모든 분석 배지를 제거한 후 -20°C(단기 저장용) 또는 -80°C(장기 보관용)에서 용해액을 보관하십시오.
  8. 샘플을 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관한 후 재시작할 때는 얼음 위에서 약 20–30분간 해동한 후 잠시 소용돌이/회전 후 표준 BCA 프로토콜을 계속 진행하세요.
  9. 또는 혈구계나 유동세포계를 이용해 웰당 세포 수를 세고 정규화 전략에 통합할 수 있습니다. 이 경우 분석이 완료되고 배지를 제거한 직후 약 100–200 μL의 트립신(37 °C로 미리 예열한 상태)을 추가하여 37 °C에서 5분간 배양합니다. 트립신의 효과를 중화하기 위해 100–200 μL 10% FBS를 첨가하여 세포를 채취합니다.
    1. 세포를 300 x g 에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 제거한 후 약 10% FBS 1mL에 펠릿을 재현탁한 후 혈구계로 계수합니다. 또는 4% PFA로 15분간 고정한 후 유세포 측정 기반 세포 계수를 진행할 수 있습니다.
      참고: 즉시 세포 수를 측정할 경우 PFA 기반 고정은 필요하지 않습니다.
  10. Wave 소프트웨어를 사용하여 각 웰에서 EOR 값을 7.8단계의 단백질 농도 또는 7.9.1단계의 세포 수로 정규화하는데, 이는 6.10.5.1단계에서와 동일합니다. 결과값은 당화 스트레스 테스트 분석의 정규화된 값입니다.
  11. 각 데이터 포인트 값에 대해 "내보내기" 옵션 다음에 "그래프 패드 프리즘" 옵션과 "엑셀 시트"를 사용하여 결과 및 그래프를 생성하세요.
    참고: 세포 배양 플레이트에서는 네 개의 지정된 빈 웰 선택이 유연하며 실험자가 직접 설정할 수 있습니다. 기본 빈칸 배열은 그림 3C에 나와 있습니다.

8. 배양 상청액에서 유산산 측정값

  1. 12일째에 수집해 6.5단계부터 −80°C에 보관한 상청액 알리코트를 얼음 위에 점차 녹입니다.
  2. 제조사 프로토콜에 따라 L-락테이트 분석 키트를 형광 측정 방식으로 사용하여 L-락테이트 농도를 측정하세요.
    참고: 형광측정 모드는 색도 측정보다 훨씬 민감합니다.
  3. 제공된 락테이트 표준 액을 연속 희석하여 0에서 0.1 nmol/well까지의 보정 곡선을 생성하여 표준 제도를 준비합니다.
  4. 샘플과 표준 샘플을 투명한 96웰 마이크로플레이트에 두 겹씩 추가한 후, 각 웰에 젖산 효소 혼합물과 형광 프로브가 포함된 반응 혼합물을 추가합니다.
  5. 빛을 차단한 상태에서 30분간 RT에서 부양하세요. 여기/방출 파장이 535/587 nm로 설정된 형광 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 형광 강도를 측정합니다.
  6. 표준 곡선에서 샘플 내 젖산 농도를 계산하여 pM로 표현합니다. 미치료(대조군) 및 LPS 처리된 원발성 미세아세포의 상청액에서 유산 수치 는 표 2에 제시되어 있습니다.

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결과

세포외 플럭스 기반 당분해 스트레스 검사는 1차 미세아교세포의 당당 분해 프로필을 성공적으로 측정합니다. 이 분석법은 기저 당해, 즉 포도당 주입 후 당해, 올리고마이신 주입 후 당해력, 2DG 주입 시 당당 작용 억제를 측정합니다. 이번 실험에서는 대조군(미치료)과 LPS 처리된 1차 미세아교세포를 비교했습니다. 24시간 후 대조군과 LPS 처리된 미세교세포 사이에 약간의 형태학적 변화가 관찰되었습니다(그림 2D-E). LPS 처리된 미소교세포는 ECAR 수치가 높음을 나타내며, 치료받지 않은 대조군에 비해 당분해(그림 4D, H)와 당분해 능력(그림 4E, I)을 유의미하게 증가시킨다는 것을 발견했습니다(

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토론

신경염증 동안 미세아교세포 반응은 심층 대사 재배선을 동반하여 이 세포들이 기능적 상태의 에너지 및 생합성 요구를 충족할 수 있게 합니다. 세포외 플럭스 기반 당해 스트레스 검사는 당화 플럭스를 민감하고 실시간으로 측정하는 방법을 제공하여, 염증성 조건에서 1차 미세아교세포가 어떻게 대사에 적응하는지 분석할 수 있게 합니다. 본 연구에서는 1차 쥐 미세아교세포를 활용하여 고전적 염증 자극인 LPS 노출 후 그들의 당분해 활성을 평가하여, 미세아교세포 대사와 관련된 대사 변화에 대한 통찰을 제공하였습니다.

우리의 연구 결과는 ECAR가 1차 미세아교세포에서 당분해 기능의 강력한 대리 지표로서 유용함을 강조합니다. LPS 치료는 ECAR 수치가 증가하여 대사가 당해로 전환되었음을 나타냅니다. 이는 염증 촉진 미세아교세포의 대사 재프로그래밍이 염증 중 당분해 증진을 촉진하는 기존 보고와 일치한다

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 주장할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 작업은 CIHR의 DKK 프로젝트 보조금을 통해 자금을 지원받고 있습니다. 해마 분석기 XFe24 분석기에 대한 크레이그 무어 박사의 RTI에 깊이 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1M HEPES 해법시그마 올드리치H0887
1X HBSS깁코와 nbsp;그리고 nbsp; 14175-079
2.5% 트립신깁코와 nbsp;그리고 nbsp; 15090-046
2DG밀리포어 시그마 D6134
항생제/항진열제 깁코15240-062
D & ndash; (+)포도당, 무수수산;열과학 및 nbsp; 그리고 nbsp;A16828.36
DMEM깁코그리고 nbsp; 11965-092
DNase I밀리포어 시그마 11284932001- 로슈
FBS피셔브랜드FB12999102
글루타맥스깁코와 nbsp;그리고 nbsp; 35050-061
L-락테이트 키트앱캠AB65330
LPS 시그마 올드리치그리고 nbsp; L4391
MEM NEAA 깁코와 nbsp;그리고 nbsp; 11140-050
올리고마이신 A밀리포어 시그마 495455
페니실린/스트렙토마이신깁코와 nbsp;그리고 nbsp; 15240-062
pH 지시기 스트립피셔브랜드13-640-516
시호스 XFe24애질런트 테크놀로지스해당 없음일반 명칭: 세포외 플럭스 분석기
Seahorse 24 V7 PS 세포 배양 마이크로플레이트애질런트 해마100777-004일반명: 세포외 플럭스 세포 배양 마이크로플레이트
해마 분석 XF 캘리브랜트 버퍼 (pH 7.4)애질런트 해마  그리고 nbsp; 100840-000일반명: 세포외 플럭스 캘리브런트 버퍼
해마 분석법 XF DMEM 매체 (pH 7.4)애질런트 해마   그리고 nbsp;그리고 nbsp; 103575-100일반명: 세포외 플럭스 분석 매체
Seahorse 세포외 플럭스 분석 키트애질런트 해마  102342-100일반명: 세포외 플럭스 보정판  
나트륨 피루브산 깁코와 nbsp;그리고 nbsp; 11360-070

참고문헌

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