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연구 논문

칼세올라리오사이드 A에 의한 PI3K/Akt/Nrf2 경로 조절을 통한 교모세포종 내 페로토토시스 유도

469 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69643

⸱

2025년 12월 30일

 ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Pediatric Surgery, Weifang Peoples Hospital, 3Department of Burn, Weifang Peoples Hospital

이 논문에서

정오 공지

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요약

본 연구는 교모세포종에서 칼세올라리오사이드 A의 치료 잠재력을 탐구하며, PI3K/Akt 신호를 억제하고 Nrf2 분해를 촉진하여 강박증을 유도하고 시험 관 내외에서 종양 진행을 억제하는 능력을 입증합니다.

초록

이 프로토콜은 칼세올라리오사이드 A(CaA)가 교세포종 모델에서 인산절리노시톨 3-키나아제(PI3K)/단백질 키나제 B(Akt)/핵 인자 적혈구 2-관련 인자 2(Nrf2) 경로의 페로토시스 유도 및 조절에 미치는 효과를 조사하는 데 사용된 실험적 워크플로우를 보여줍니다. 이 절차는 CaA 처리 후 세포 생존성, 증식, 화학감수성을 평가하기 위해 U251 및 U87 인간 교세포종 계통에서 세포 기반 검사를 일련의 검사로 포함합니다. 페로토시스 관련 변화는 활성 산소종(ROS), 글루타티온(GSH), 말론디알데히드(MDA), 불안정성 철분 수치와 함께 글루타티온 퍼옥시다제4(GPX4), 시스테인/글루타메이트 항포터 소단위(xCT), 웨스턴 블롯을 통한 페리틴 등 페로토시스 관련 단백질의 발현을 측정하여 평가합니다. 경로 관여를 평가하기 위해 프로토콜은 nrf2 발현 및 유비퀴틴화를 위한 qRT-PCR, 웨스턴 블롯, 면역침전 기반 검사를 상세히 설명합니다. Nrf2 과발현 실험은 철학 조절에서의 역할을 확인하기 위해 포함된다. 프로토콜은 또한 U87 세포를 피하에 이식한 후 복막 내 CaA 투여를 통해 생체 내 종양 성장과 독성을 평가하는 마우스 이종이식 모델 사용도 시연합니다. 주요 장기의 조직학적 분석이 수행되어 전신 안전성을 평가합니다. 또한, 분자 결합은 CaA와 PI3K p110α 소단위체(PIK3CA) 간의 직접 결합을 예측하는 데 사용됩니다. 이 시술들은 세포종 연구에서 철학 세포증 기전과 천연 화합물의 치료 효능을 재현 가능한 틀로 제공합니다.

서론

교모세포종, 특히 고등급 교모세포종은 빠른 증식, 치료 저항성, 그리고 좋지 않은 예후를 특징으로 하는 가장 치명적인 뇌종양 형태 중 하나입니다. 최근 몇 년간, 테모졸로마이드 같은 전통적인 화학요법과 커큐민2, 레스베라트롤3, 에피갈로카테킨 갈레이트4 같은 천연 화합물 등 다양한 항교세포종 약물이 연구되었습니다. 이 물질들은 세포자멸사 유도, 혈관신생 억제, 산화 스트레스 경로 조절 등 다양한 메커니즘을 통해 효과를 발휘합니다. 하지만 이들 화합물은 낮은 생체이용률이나 불완전한 기전 특성 분석과 같은 한계에 직면해 있습니다. 이는 항종양 활성을 확인할 뿐만 아니라 기저 약리학적 기전을 체계적으로 해부할 포괄적인 방법론의 중요성을 강조합니다. 이러한 기전적 워크플로우를 확립하는 것은 새로운 항교질종 화합물의 발견부터 전임상 검증까지 개발을 가속화하는 데 특히 중요합니다.

이 목표를 지원하기 위해 점점 더 많은 연구들이 첨단 계산 및 실험 도구를 통합하여 기전적 해상도 5,6을 향상시키고 있습니다. AlphaFold3와 분자 도킹과 같은 구조 기반 신약 설계 및 인공지능(AI) 모델은 전례 없는 속도와 정확성으로 유망한 약물-표적 상호작용 식별을 촉진하고 있습니다 7,8. 이 도구들은 결합 친화도를 예측하고 실험실 검증 전에 잠재적 분자 표적을 식별함으로써 실험 방법을 보완합니다. 동시에 경로 기반 기능적 분석법, 생세포 영상, 고해상도 프로테오믹 기법의 등장으로 연구자들은 산화 스트레스 반응, 신호 전달 연쇄, 페로토토시스9, 10, 11과 같은 세포사멸 양식 등 여러 조절 축에서 신화합물의 세포 영향을 평가할 수 있게 되었습니다.

교모세포종 생물학에 관여하는 신호 경로 중에서, 인산딜리노시톨 3-키나아제(PI3K)/단백질 키나아제 B(Akt)와 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2(Nrf2) 경로는 종양 성장, 산화환원 항상성, 치료 저항성에 중요한 역할을 하기 때문에 특히 주목받고 있습니다12,13. PI3K/Akt는 교세포의 생존, 증식 및 대사 적응을 촉진하며, Nrf2는 항산화 반응의 주된 조절자로 기능하여 철세포 사멸을 억제합니다14. 이 경로들의 지속적인 활성화는 치료 회피에 기여하여 약물 개입의 매력적인 표적이 됩니다15. 경로 조사를 위한 기존의 방법으로는 총 및 인산화 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅과 유전자 발현 분석을 위한 qRT-PCR이 있습니다. 그러나 Nrf2 신호전달의 심층 분석을 위해서는 단백질 안정성, 핵 전위, 유비퀴틴화 같은 번역 후 변형 수치를 평가하는 추가 분석법이 필요합니다. 이러한 다면적인 검출 전략은 특정 화합물이 산화환원 조절과 철환 조절을 어떻게 방해하거나 강화하는지 이해하는 데 필수적입니다.

칼세올라리오사이드 A(CaA)는 하이드록시시나산 유도체로, PI3K/Akt 신호를 동시에 억제하고 Nrf2의 프로테아좀 분해를 촉진하여 페롭토틱 감수성을 높입니다. 이 이중 표적 전략은 항산화 방어 하류에서 작용하는 에라스틴(erastin)이나 RSL3 같은 기존 약물보다 재현성과 기전적 깊이를 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 CaA의 약리학적 메커니즘을 조사하기 위한 통합적 실험적 접근법을 제시하며, 여기에는 PI3K 결합 부위를 규명하기 위한 분자 도킹, Nrf2 발현 및 유비퀴틴화 검출을 위한 면역 블롯팅 및 면역침전, 그리고 활성산소종(ROS), 글루타치온(GSH), 말론디알데히드(MDA)와 같은 철학 지표를 포함합니다. 더 나아가, 외종이식 마우스 모델을 사용하여 CaA의 치료 효능과 전신 안전성을 평가합니다. 이 포괄적인 워크플로우는 항암제의 작용 기전을 연구할 수 있는 재현 가능하고 유익한 플랫폼을 제공하며, 신호 경로 조절과 세포 사멸 조절의 통합에 중점을 둡니다.

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프로토콜

세포 배양 및 처리
마우스 HT22 신경세포와 인간 교모종 U87 및 U251 세포주가 Dulbecco의 변형 이글 배지에 10% 태아 소 혈청과 4 mM L-글루타민을 보충한 상태에서, 37°C의 가습 조건에서 5% CO₂를 배양하였습니다. 실험의 일관성을 간소화하기 위해 모든 세포 처리법이 표준화되어 여기에 설명되었습니다. 이 절에서는 각 처리군에서 사용되는 구체적인 조건과 해당 하류 분석법을 개괄합니다.

CaA 치료:
HT22 세포는 CaA 농도(0, 0.1, 0.5, 1, 10, 50, 100, 250, 500 μM)를 72시간 동안 점차 조절하였다. U87과 U251 교모종 세포는 대부분의 실험에서 5, 20, 50 μM 농도로 CaA로 24시간 처리되었고, 시간 연구에서는 0, 6, 12, 18시간에 50 μM으로 처리되었습니다. 이 처리들은 다음과 같은 분석에 사용되었습니다: 시스테인/글루타메이트 항포터 소단위(xCT), 글루타티온 과산화효소 4(GPX4), 페리틴(FTH1), 글루타미나아제, 그리고 라파마이신(mTOR)/진핵 개시 인자 4B(EIF4B)의 PI3K/Akt/포유류 표적(총 및 인산화 수준); Nrf2와 켈치 유사 ECH 관련 단백질 1(Keap1)에 대한 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR); 2′,7′-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 이용한 ROS 측정; GSH 및 MDA 정량화; 페로오렌지 기반 Fe2+ 검출; 5-에티닐-2′-디옥시우리딘(EdU) 증식 분석; 군집 형성 분석; 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 세포 생존 분석 결과.

리프록스타틴-1 (Lip1) 공동 치료:
세포는 50 nmM Lip1로 2시간 동안 전처리한 후 50 μM CaA를 첨가했습니다. 이 조건들은 MTT 분석(0, 24, 48, 72h)에서 사용되었으며; 식민지 형성 분석; EdU 분석; Annexin V/PI 세포자멸사 분석(20 nM 시스플라틴 유무 포함).

MG132 공동 치료:
세포는 10 μM MG132 단독 또는 50 μM CaA와 병용 24시간 처리되었습니다. 이 연구는 Nrf2 단백질 안정화(총 및 핵)를 위한 서부 블롯팅에 적용되었으며; 유비퀴틴화된 Nrf2와 Keap1에 대한 면역침전(IP) 분석.

시스플라틴 공동 치료:
세포는 20 nM 시스플라틴 단독 또는 20 μM CaA와 병용하여 24시간 처리되었습니다. 이 치료법들은 Annexin V/propidium iodide(PI) 세포자국사 분석에 사용되었습니다.

Nrf2 과표현:
세포는 2.5 μg Nrf2 과발현 플라스미드 또는 빈 벡터로 18시간 동안 형질전환제를 사용하고, 이후 50 μM CaA로 24시간 처리하였습니다. 이 조건은 xCT, GPX4, FTH1, 글루타미나아제에 대한 서부 블로팅에 사용되었으며; ROS, MDA, GSH 분석; 세포 내 철분을 위한 페로오렌지 염색.

워크플로우 다이어그램(보충 그림 S1)은 위의 실험 조건과 해당 분석을 요약합니다. 이 그림은 각 처리 프로토콜을 구체적인 하위 분석 분석과 시각적으로 연결하여 명확성과 재현성을 향상시킵니다.

세포 생존 가능성 평가
세포 생존력은 앞서 설명한 전통적인 MTT 색도 측정법을 사용하여 평가하였다16. HT22, U251, U87 세포는 96웰 배양 플레이트에 판팅되어 밤새 배양하여 부착을 허용했습니다. 처리 기간이 끝난 후, 각 웰에 15 μL MTT 용액을 주입하고 플레이트를 37 °C에서 4시간 배양했습니다. 배지를 버리고 150 μL 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 형성된 포마잔 결정체를 용해시켰습니다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 사용해 490 nm에서 흡광도를 기록했습니다. 흡수도가 높을수록 세포 생존력이 더 높다는 의미이고, 흡수도가 감소하면 세포독성 효과를 시사합니다.

EdU 통합 분석
DNA 합성과 세포 증식을 평가하기 위해,앞서 설명한 EdU 영상 키트를 사용하여 EdU 통합 분석이 수행되었습니다. 간단히 U251과 U87 교세포세포는 24웰 플레이트에 시딩되었습니다. 처리 후 세포는 EdU(최종 농도 10 μM)로 배양하여 추가로 24시간 배양했습니다. 배양 단계 후, 세포는 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 0.5% Triton X-100으로 투과시키고, 키트 설명서에 따라 염색했습니다. EdU 양성 세포(증식 세포)의 비율은 형광 현미경으로 정량화되어 총 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 염색 핵으로 정규화되었다.

군체 형성 분석
군락 형성 분석에서는 U251과 U87 교모종 세포를 3.5cm 접시에 저밀도(접시당 500 세포)로 도판하였습니다. 처리 후 배양지는 신선하고 약물이 없는 배지로 교체되었고, 세포는 콜로니 형성을 위해 14일간 유지되었으며, 배양지는 3일마다 교체되었습니다. 결과된 군집들은 4% 파라포름알데히드를 사용해 고정하고, 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 현미경으로 수동으로 세기했습니다. 직경 75 μm를 초과하는 클러스터는 군집으로 점수를 부여했습니다. 각 실험은 3회로 수행되어 세 번 반복되었다. 이 검사는 장기 증식 능력을 평가하는 데 일반적으로 인정된 프로토콜을 따랐다18. 군체는 조밀하고 원형의 군집으로 보여야 하며; 적고 작은 집단은 증식 능력이 감소했음을 시사합니다.

세포 세포자멸사 평가
세포자멸 세포사멸은 앞서 설명한 대로 FITC-Annexin V 세포자멸사 검출 키트를 사용하여 평가하였다. U87과 U251 교모종 세포는 염색 전 24시간 동안 20 nM 시스플라틴으로 처리되었으며, 20 μM CaA가 존재하든 없든 처리하였습니다. 철학 억제 실험의 경우, 세포는 2시간 동안 50 nM Lip1로 전처리한 후, 20 μM CaA와 20 nM 시스플라틴으로 추가로 24시간 동안 공동 처리했습니다. 치료 후 세포는 제조사 지침에 따라 300 × g, 5분으로 채취되어 Annexin V-FITC 및 PI로 염색되었습니다. 표지 부착 후 샘플은 유세포계로 검사되었습니다. 데이터 수집은 FL1(FITC)과 FL2(PI) 채널을 사용하여 수행되었으며, 스펙트럼 중복을 최소화하기 위해 보상 설정이 적용되었습니다. 이후 아폽토시스 정도를 결정하기 위해 Annexin V 양성 세포의 비율이 계산되었습니다.

서부 블롯 분석
서부 블로팅은 정해진 절차에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해, 지정된 처리 후 세포는 프로테아제와 인산효소 억제제가 포함된 RIPA 버퍼에 용해되었고, 브래드포드 분석법을 사용해 단백질 수치를 측정했습니다. Nrf2 세포 내 분포를 평가하는 실험을 위해, 제조사의 지침에 따라 상업용 핵 추출 키트를 사용해 핵 및 세포질 단백질을 추출했습니다.

각 샘플에서 총 40 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에 분해한 후 PVDF 막에 옮겼습니다. 막은 5% 무지방 우유로 PBST에서 조제한 (PBS 및 0.1% Tween-20)로 1시간 실온에서 차단한 후, 4°C에서 1차 항체와 함께 하룻밤 배양하였습니다. 세척 후, HRP 결합 2차 항체(1:5,000)를 37 °C에서 1시간 동안 적용하고, 증강 화학발광(ECL) 시스템을 사용해 신호를 검출하였습니다.

xCT, 글루타미나제, GPX4, FTH1의 발현 수준을 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 로딩 컨트롤로 사용하여 측정하였습니다. 인산화 단백질(p-PI3K, p-Akt, p-mTOR, p-EIF4B)은 각각의 총 단백질 수치에 대해 정량화되었고, 전체 단백질은 GAPDH에 대해 정규화되었습니다. 핵 Nrf2는 라민 B로 정규화되었습니다. 예상 결과로는 Nrf2와 p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B의 용량 및 시간 의존적 감소, 그리고 CaA 처리 세포에서 철학 관련 마커의 하향 조절이 포함됩니다.

유비퀴틴화 분석에서는 세포를 24시간 동안 CaA(50 μM)와 함께 또는 사용하지 않은 MG132(10 μM)로 처리하였습니다. 용해 후에는 항-Nrf2 또는 항-Keap1 항체를 이용해 단백질 복합체를 면역침전시켰다; 정상 토끼 IgG는 음성 대조군으로 사용되었습니다. 면역침전물은 유비퀴틴 항체로 탐침하여 유비퀴틴화된 형태를 검출했으며, 총 분해액은 Nrf2와 Kelch-유사 ECH 관련 단백질 1(Keap1) 수치도 탐침하여 입력을 확인하였습니다.

RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)
RNA 추출과 qRT-PCR은 표준 프로토콜21에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해, U87과 U251 교모종 세포는 50 μM CaA와 함께 또는 사용하지 않아도 서로 다른 기간(6시간 및 18시간)을 처리했습니다. 총 RNA는 역전사를 통해 분리되어 cDNA로 전환되었습니다. 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)은 SYBR Green qPCR 마스터 믹스를 실시간 PCR 플랫폼에서 사용하여 수행되었습니다. 상대 유전자 발현은 2-ΔΔCt 계산을 통해 결정되었습니다. Nrf2, Keap1, 그리고 하우스키핑 유전자 GAPDH에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같습니다:

Nrf2 포워드, 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 역방향, 5′-GGAATGTGTGCCCAAAAGCTG-3′

앞쪽 5′-CAACTTCGCTGAGGATTGGC-3′ 앞쪽 keap1;
Keap1 후진, 5′-TGATGAGGGTCACCAGTTGGCA-3′

GAPDH 전방, 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′;
GAPDH 역방향, 5′-AGCCTTCTACATGGTGTGAAGAC-3′

Nrf2 전도함수
U251과 U87 교모종 세포는 지질 기반 형질염화 시약을 사용하여 Nrf2 과발현 플라스미드 또는 해당 빈 대조 벡터로 일시적으로 트랜스펙션되었으며; 이 절차는 기존의 일시적 형질전환법(transfection methods)을 기반으로 했습니다. 간단히 말해, 세포는 6웰 플레이트에 3× 10⁵ 셀 밀도로 시딩되어 하룻밤 동안 배양하여 트랜스펙션 시 약 70-80% 합류율을 달성했습니다. 각 웰마다 2.5 μg 플라스미드 DNA를 125 μL 환원 혈청 배지에 희석한 후 5 μL 형질전환 시약과 혼합했습니다. 별도로, 3.75 μL의 형질전환 시약을 환원 혈청 배지 125 μL에 희석하였습니다. 희석된 DNA 및 형질전환 시약 혼합물을 결합하여 부드럽게 혼합한 후 상온에서 10-15분간 배양하여 복합체 형성을 허용했습니다. 결과된 트랜스펙션 복합체(총 부피 250 μL)는 신선한 완전 배지에서 세포가 포함된 각 웰에 점차 첨가되었다.

CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 18시간 배양한 후, 형질전환 배양지를 신선한 배양 배지로 교체하였습니다. 이후 세포는 웨스턴 블로팅, ROS 분석, MDA/GSH 정량, 철분 축적 연구를 포함한 후속 분석이 진행되었습니다. 이 프로토콜은 널리 인정받는 일시적 유전자 발현 절차를 따르며, 형질전환 후 24-48시간 이내에 견고한 Nrf2 발현을 허용합니다.

세포 내 철분 측정
세포 내 Fe2+ 수치는 형광 지표인 FerroOrange를 사용하여 측정하였습니다. Brief, U251과 U87 교모종 세포는 24웰 플레이트에 시딩되어 CaA 농도(5, 20, 50 μM)로 처리되었습니다. Nrf2 과발현이 철세포투시증에 미치는 영향을 평가하기 위해, U87과 U251 세포에 Nrf2 발현 플라스미드 또는 빈 벡터를 형질전환하였습니다. 18시간 후에는 배지를 교체하고 세포를 50 μM CaA로 24시간 처리했습니다. 이후 세포는 혈청 없는 배지에서 1 μM 페로오렌지에 노출되어 37°C에서 30분간 배양한 후 분석하였습니다. 배양 후에는 TRITC 필터 세트(여기 ~543 nm, 방출 560-600 nm)를 사용해 형광 현미경으로 세포를 세척하여 관찰했으며, 주황색 형광 강도가 증가하면 세포질 내에 주로 국소적으로 위치한 불안정성Fe2+ 수치가 증가함을 나타냅니다. 이 방법은 확립된 형광 탐침 기반 철 분석법23.

GSH 및 MDA의 측정
산화 스트레스를 평가하기 위해 세포내 GSH 및 MDA 수치는 표준화된 평가 프로토콜에 따라 결정되었다24. Brief, U251과 U87 교모종 세포는 24웰 플레이트에 시딩되어 CaA 농도(5, 20, 50 μM)로 처리되었습니다. Nrf2 과발현이 철세포투시증에 미치는 영향을 평가하기 위해, U87과 U251 세포에 Nrf2 발현 플라스미드 또는 빈 벡터를 형질전환하였습니다. 18시간 후에는 배지를 교체하고 세포를 50 μM CaA로 24시간 처리했습니다. 이후 세포를 RIPA 버퍼에 용해하고 BCA 단백질 정량 키트를 사용해 총 단백질 농도를 측정하였습니다. 이후 제조사 프로토콜에 따라 상용 검출 키트를 사용해 GSH 및 MDA 성분을 분석했습니다.

ROS 분석
세포 내 ROS 생성은 정해진 프로토콜25에 따라 형광 탐침 DCFH-DA를 사용하여 평가되었습니다. Brief, U251과 U87 교모종 세포는 24웰 플레이트에 시딩되어 CaA 농도(5, 20, 50 μM)로 처리되었습니다. Nrf2 과발현이 철세포투시증에 미치는 영향을 평가하기 위해, U87과 U251 세포에 Nrf2 발현 플라스미드 또는 빈 벡터를 형질전환하였습니다. 18시간 후에는 배지를 교체하고 세포를 50 μM CaA로 24시간 처리했습니다. 이후 세포는 37°C에서 5 μM DCFH-DA로 1시간 처리한 후, 과도한 염료를 제거하기 위해 PBS 세척을 시행했습니다. FITC 필터(여기 488nm, 방출 525nm)가 장착된 역형광현미경으로 형광 신호를 시각화하고, 분석을 위해 이미지를 촬영했습니다. 녹색 형광 강도 증가는 세포 내 ROS 수치 상승과 일치합니다.

동물 실험
모든 동물 실험은 미국 국립보건원(NIH)의 실험동물 관리 및 사용 가이드에 명시된 권고사항에 엄격히 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 위팡 인민병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인 번호 [2025SDL579]로 승인되었습니다. 교세포종 이종이식 모델을 생성하기 위해 2× 10개의6 개의 U87 세포를 0.2mL PBS에 재현탁하여 4주 된 수컷 BALB/c 누드 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 접종했습니다. 종양이 7일간 발생하도록 둔 후, 쥐들은 무작위로 세 그룹(n=8명)으로 배정되었습니다: 치료하지 않은 대조군, CaA 처리된 그룹(2.5 mg/kg), 그리고 CaA(2.5 mg/kg)와 Lip1(10 mg/kg) 병용 그룹. 치료는 14일 연속으로 매일 복막 내 주사를 통해 투여되었습니다. 종양 크기는 3일마다 캘리퍼스를 사용해 측정했으며, 부피는 부피 = (길이 × 너비²) / 2의 공식으로 계산되었습니다. 21일째에 모든 쥐가 안락사되었고, 종양은 절제되어 추가 분석을 위해 촬영되었습니다.

RNA 시퀀싱 및 KEGG 경로 분석
CaA 노출 후 전사 변화를 프로파일링하기 위해 RNA 시퀀싱이 수행되었습니다. RNA 무결성은 Illumina 플랫폼에서 시퀀싱 전에 마이크로볼륨 UV-VIS 분광광도계와 모세관 기반 전기영동 시스템을 사용하여 확인되었습니다. 깨끗한 리드는 HISAT2를 이용한 인간 기준 게놈(GRCh38)에 매핑되었고, 유전자 발현은 FPKM으로 정량되었습니다. DESeq2를 사용해 차별 발현 유전자를 확인하였으며(FDR < 0.05, |log₂FC| ≥ 1), 기능 풍부도는 KEGG 경로 분석으로 평가하였다(조정된 P < 0.05).

분자 도킹 분석
분자 도킹을 통해 CaA와 PI3K/Akt 경로 간의 상호작용을 예측하였습니다. 인간 PI3K 촉매 소단위 p110α(PIK3CA)의 결정 구조는 단백질 데이터 뱅크(PDB ID: 8BFU)에서 얻어졌습니다. CaA의 구조는 PubChem에서 추출되어 분자 모델링 소프트웨어를 사용해 에너지 최소화되었습니다. 분자 도킹 준비 소프트웨어를 사용하여 PIK3CA 구조에서 모든 물 분자와 비필수 리간드를 제거하고 수소 원자를 추가했습니다. PIK3CA의 활성 지점 주변에 도킹 그리드가 정의되었고(알려진 결합 지점 좌표를 기반으로 ), 도킹 알고리즘이 도킹을 수행했습니다. CaA의 결합 포즈가 상위 점수를 받는 것은 결합 친화도(kcal/mol)에 따라 선정되어 주요 상호작용을 조사하였습니다. 수소 결합과 소수성 접촉과 같은 단백질-리간드 상호작용은 분자 시각화 소프트웨어와 2D 상호작용 매핑 도구를 통해 시각화되었습니다.

안전 및 폐기물 처리
DMSO, 형광 염료(DCFH-DA, FerroOrange), 고정제와 같은 화학 시약을 사용한 모든 실험은 장갑과 안전 고글 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)와 함께 연기함 내에서 수행되었습니다. DMSO와 형광 탐침은 피부를 침투할 수 있고 세포독성이 있을 수 있기 때문에 신중하게 다뤄졌다. 피펫 팁, 배양 플레이트, 장갑 등 오염된 물질은 지정된 유해 폐기물 용기에 폐기되었습니다. 동물 조직과 사체는 생물학적 위험 폐기물로 취급되어 기관 생물안전 규정과 지역 환경 지침에 따라 소각되거나 고동멸균되었습니다.

통계 분석
모든 결과는 표준편차(SD)± 평균으로 제시됩니다. 두 그룹 간의 차이는 양측 학생 t-검정을 사용하여 평가되었습니다. 다수 그룹을 포함하는 분석의 경우, 일원 ANOVA 이후 적절한 사후 비교(예: Tukey 검정)를 적용하였습니다. p 값이 0.05 미만일 경우 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었습니다.

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결과

CaA에 의한 시험 관 내 U251 및 U87 세포의 증식 억제 및 화학감수성 증대
그림 1A 는 CaA의 구조를 보여줍니다. 우리는 먼저 정상 쥐 HT22 신경세포와 인간 교모종 U251 및 U87 세포에 대한 MTT 분석법을 사용하여 CaA의 세포독성 효과를 평가했습니다. 미처리 세포(0 μM CaA)와 비교할 때, CaA는 72시간 동안 100 μM 미만 농도에서 HT22 세포 생존력에 미치는 영향이 미미했습니다(그림 1B). 그러나 250 μM 및 500 μM CaA 치료를 72시간 동안 사용하면 HT22 세포의 생존율이 각각 약 40%와 60% 감소했습니다(그림 1B). 미처리 대조군(0 μM CaA)과 달리, CaA 치료를 72시간 동안 수행하면 ...

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토론

CaA는 PI3K/Akt/mTOR 경로와 Nrf2-페렙토시스 방어 기전이라는 두 가지 중요한 생존 축을 독특하게 조절함으로써 교모세포종에서 강력한 항종양 효과를 보입니다. PI3K/Akt 경로는 PTEN 손실 또는 RTK 활성화로 인해 다형성 교모세포종(GBM, 최대 ~88-90%의 경우 변형됨)에서 자주 과활성화되어 증식과 치료 저항성을 촉진합니다26. 그러나 이 경로를 표적으로 삼는 것만으로는 GBM에서 세포자살사가 제한적이었는데, 종양은 종종 세포 유지 또는 보상적 기전을 통해 PI3K 억제를 회피하기 때문입니다26. 여기서 CaA의 이중 작용은 새롭다: PIK3CA에 직접 결합하여 PI3K/Akt 신호를 억제함으로써 주요 성장 촉진 경로를 억제할 뿐만 아니라, 항산화 및 철학 보호 유전자의 주된 주된 조절자인 Nrf2의 분해를 촉진한다27

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Agilent 2100 Bioanalyzer캐필러리 기반 전기영동 시스템
Annexin V-FITC Apoptosis KitRoche Diagnostics11858777001N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)분자 도킹 준비 소프트웨어 (도킹 알고리즘)
Calceolarioside A (CaA)Sigma-AldrichSMB00246N/A
Chem3D분자 모델링 소프트웨어
cDNA Synthesis KitVazyme BiotechR223N/A
DCFH-DASigma-AldrichD6883N/A
DMEMThermo Fisher Scientific11965092N/A
DMSOMerckD8418N/A
FerroOrange probeDojindoF374N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF2442N/A
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAriaIII Flow CytometryAnnexin V 염색 세포를 분석하는 기기
Fluorescence microscopeOlympusIX73FerroOrange 및 DCFH-DA 형광을 관찰하는 기기
FTH1 antibodyAbcamab75973AB_1310150
GAPDH antibodyAbcamab8245AB_2107448
GLS antibodyAbcamab93434AB_10563527
GPX4 antibodyAbcamab125066AB_10972289
HT22 murine neuronal cell lineAddexBioC0011008CVCL_0321
jetPRIME transfection reagentPolyplus-transfection114-07폴리머 기반 형질주입 시약
Keap1 antibodyAbcamab139729AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081N/A
LigPlot+2D 상호작용 매핑 도구
Lipofectamine 3000Thermo Fisher Scientific지질 기반 형질주입 시약
Liproxstatin-1SelleckS7699N/A
MG132SelleckS2619N/A
Microplate readerThermo Fisher ScientificH1MMTT 분석(490 nm)에서 흡광도를 측정하는 기기
MTTSigma-AldrichM5655N/A
NanoDrop소량 UV-Vis 분광 광도계
Nrf2 antibodyAbcamab62352AB_945626
Nude BALB/c miceVital River, ChinaN/AIMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOL분자 시각화 소프트웨어
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master MixVazyme BiotechQ711N/A
TRIzol ReagentThermo Fisher15596026N/A
U251 human glioma cell lineCLS Cell Lines Service300385CVCL_0021
U87 human glioma cell lineATCCHTB-14CVCL_0022
Ubiquitin antibodyAbcamab7780AB_306981
xCT/SLC7A11 antibodyAbcamab175186AB_2715513
```

참고문헌

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정오


Formal Correction: Ferroptosis Induction in Glioma by Calceolarioside A via Modulation of the PI3K/Akt/Nrf2 Pathway
Posted by JoVE Editors on 8/06/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69643

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