CUT&RUN을 이용한 신경내분비 소세포폐암 세포주에서 히스톤 변형 및 전사인자 결합 부위의 전면 지도 작성

요약

뉴클레아제를 이용한 최적화된 표적 하 절단 및 방출 후 차세대 시퀀싱(CUT&RUN-seq) 프로토콜이 신경내분비 소세포암 세포주에 대해 기술되었습니다. 이 기술은 다양한 히스톤 변형과 전사인자(예: E2F7) 결합 부위의 유전체 매핑을 가능하게 하여 SCLC 병리생물학에서 후생유전학 및 전사 탈조절을 조사할 수 있게 합니다.

초록

염색질 재형성 단백질과 전사인자(TFs)는 소세포폐암(SCLC) 종양 생물학에서 중요한 역할을 합니다. 히스톤 번역 후 변형(PTM)과 TF 결합 부위의 유전체 전체 특성 분석은 SCLC에 대한 더 깊은 기전적 이해를 이끌고 치료 개입 표적을 지정하는 조절 DNA 요소와 유전자 경로를 규명하는 데 필수적입니다. 뉴클레아제를 이용한 표적 절단 및 방출 후 차세대 시퀀싱(CUT&RUN-seq)은 세포 게놈 내 다양한 단백질의 특정 히스톤 변형을 매핑하고 DNA 결합 프로필을 결정하는 강력한 방법입니다. CUT&RUN에서는 단백질 A/G에 융합된 미세핵효소(MNase)가 항체를 통해 염색질 관련 단백질의 유전체 위치에 모집되며, MNase 활성화 및 절단 시 전체 염색질에서 DNA 조각이 방출됩니다. 이 국소적 소화는 시퀀싱에 적합한 작고 유좌 특이적인 DNA 조각을 생성합니다.

여기서는 SCLC 내에서 히스톤 변형인 H3K4me3(활성 또는 개방 프로모터와 관련)와 H3K4me1(활성 증강제와 연관됨), 그리고 전사인자 E2F7을 프로파일링하는 상세 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 큰 핵, 적은 세포질, 현탁 상태의 비부착 응집체로 성장하는 특징을 가진 신경내분비(NE) SCLC 세포주 모델에 최적화되었습니다.

서론

히스톤 번역 후 변형(PTM)과 전사 인자(TF)는 유전자 발현의 중심 조절자입니다. 아세틸화, 메틸화, 인산화, 유비퀴틴화 등 히스톤 PTM은 주로 N-말단 꼬리에서 나타나 염색질 구조 ^1,2에 영향을 미칩니다. 암에서는 히스톤 PTM이 종종 조절 불균형을 겪어 종양유전자의 비정상적인 활성화나 종양 억제 유전자의 침묵을 초래합니다^. TFs는 프로모터나 인핸서에 특정 DNA 서열에 결합하여 표적 유전자를 활성화하거나 억제하며, 종종 크로마틴 재형성을 조절하는 히스톤 변형 효소를 모집^합니다. 히스톤 표식을 작성, 삭제, 읽는 효소들, 예를 들어 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT), 히스톤 탈아세틸화제(HDAC), 메틸트랜스퍼라제(HMT)와 같이 암에서 자주 돌연변이나 조절 이상을 겪기 때문에 치료 표적으로 매력적인^5.

SCLC에서는 후생유전학적 변화와 계통 정의 전사인자(LDTFs)가 종양 생물학의 핵심 동인입니다^. 유전적 돌연변이와 달리, DNA 메틸화와 히스톤 변형을 포함한 후생유전학적 변형은 근본적인 DNA 서열을 바꾸지 않고 유전자 발현을 조절합니다. 이러한 변형은 종양 억제 유전자를 침묵시키거나 종양 유전자를 활성화시켜 SCLC의 공격적인 행동을 부추길 수 있습니다. 예를 들어, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 KMT2D는 대규모 실제 SCLC 환자 코호트⁷ 에서 12.9%의 변이 빈도로 자주 돌연변이되며, 히스톤 H3 라이신 4 단일메틸화(H3K4me1)를 담당하는데, 이는 게놈 내 활성 증강체 영역과 관련된 표식입니다. SCLC는 분자적으로 이질적인 질환입니다. SCLC는 네 가지 LDTF의 차별 발현을 기반으로 분자 아형으로 분류됩니다: 아카에테-스큐트 상동체 1(ASCL1), 신경유성 분화 인자 1(NEUROD1), 예-관련 단백질 1(YAP1), 그리고 POU 클래스 2 홈박스 3(POU2F3). ASCL1과 NEUROD1을 포함한 신경내분비(NE) 아형은 SCLC 사례의 약 70-80%를 차지합니다⁸. 따라서 다양한 SCLC 아형에서 다양한 히스톤 PTM과 TF 결합 부위의 분포와 프로파일을 조사하면 치료 개입에 취약한 아형 특이적 유전자 프로그램을 밝혀낼 수 있습니다.

유전체 수준에서 히스톤 PTM과 서열 특이적 조절 단백질의 결합 부위를 식별하는 전통적인 방법은 염색질 면역침전염기서열(ChIP-seq)⁹입니다. 하지만 ChIP-seq는 많은 수의 입력 세포를 필요로 하며, 종종 게놈 전반에 걸쳐 높은 배경 정보를 제공합니다. 따라서 ChIP-seq는 진짜 신호와 잡음을 구분하기 위해 표적 단백질의 높은 수준의 농축이 필요하며, 효과적인 데이터 분석을 위해 깊은 시퀀싱이 필요합니다. 또한, ChIP-seq에서 사용되는 포름알데히드 가교결합은 에피토프를 가리고 위양성 결합 부위를 생성할 수 있습니다¹⁰. 뉴클레아제를 이용한 표적 하 절단 및 방출 후 차세대 시퀀싱(CUT&RUN-seq)은 온전한 세포 내에서 히스톤 PTM과 TF 결합 부위를 현장에서 매핑하는 고해상도 대안입니다. 이 방법에서는 투과화된 세포를 관심 있는 염색질 관련 단백질을 표적으로 하는 항체와 함께 배양한 후, Protein A(G)-미세대인 뉴클레아제(MNase) 융합 단백질과 결합합니다. 관심 단백질 양옆에 위치한 표적 DNA 소화를 고칼슘/저염 조건에서 유도하여 정제를 위해 특정 DNA 조각을 방출합니다. 정제된 DNA 조각은 바코드화된 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 데 사용되며, 이를 고처리량 시퀀싱^{11, 12, 13, 14}를 위해 풀링할 수 있습니다. ChIP-seq와 비교했을 때, CUT&RUN은 입력으로 필요한 세포 수가 훨씬 적고, 배경 잡음이 적으며, 가교 아티팩트를 피하고, 시퀀싱 리드 수가 적어 비용 효율적으로 암의 동적 크로마틴 상태를 연구하는 데 특히 적합합니다.

CUT&RUN 기술은 히스톤 변형, TF 결합 부위, 염색질 관련 복합체 등 염색질 상호작용 단백질의 유전체 위치를 조사하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 후생유전학적 조절 지형을 밝혀냈습니다^11,12. 이 기법은 발달 및 질병 진행 과정에서 인핸서-프로모터 구조, 전사 네트워크 조절, 염색질 상태 역학에 대한 상세한 분석을 가능하게 했습니다¹⁵. 암 연구에서 CUT&RUN은 히스톤 마크^16,17과 종양 전사인자 점유의 정밀한 지도화를 가능하게 하여, 계통 특이적 조절 프로그램과 잠재적 치료 표적을 식별하는 데 도움을 줍니다^15,16. 더 나아가, CUT&RUN은 CD8+ T 세포¹⁷을 포함한 세포 내에서 현장 시위에서 수행할 수 있으며, 조직 샘플^18,19에도 적용할 수 있습니다.

SCLC 아형에서 PTM과 전사인자 E2F7 결합 부위의 유전체 위치를 검출하기 위해, 우리는 KMT2D 돌연변이 유무와 관계없이 네 가지 SCLC NE 세포주 모델인 H146과 DMS79(ASCL1 아형), 그리고 H446과 H82(NEUROD1 아형)에 CUT&RUN-seq를 적용하였습니다. 우리는 주로 KMT2D에 의해 촉매되는 강화제 관련 변형인 히스톤 마크 H3K4me1과 ASCL1의 보조인자인 것으로 밝혀진 E2F7을 프로파일^{링했습니다.} 활성 프로모터와 관련된 히스톤 마크 H3K4me3는 양성 대조군으로, IgG는 음성 대조군을 수행했습니다.

여기서는 상업적으로 이용 가능한 CUT&RUN 키트(재료표 참조), Skene과 Henikoff의 원본 연구 ^11,12,13, 그리고 자체 실험실 최적화를 바탕으로 SCLC NE 세포주에 대한 상세한 CUT&RUN-seq 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜(그림 1)은 일반적으로 비부착 집단체나 부동 클러스터로 성장하는 SCLC NE 세포주에서 CUT&RUN-seq를 수행하는 단계별 지침을 제공합니다.

1. 세포 배양

1. DMS79(ASCL1 아형), H146(ASCL1 아형), H82(NEUROD1형), H446(NEUROD1형)을 13mL의 RPMI-1640 배지에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신( 재료표 참조)을 보충하여 75mL 플라스크에 유지합니다. 세포를 37°C, 5%_CO2로 인큐베이터에서 배양합니다.
   참고: 본 연구에 사용된 모든 세포는 ATCC에서 구입했으며, 단거리 연계 반복 프로파일링으로 인증되었습니다.

2. 세포 투과화

참고: 적절한 세포 투과화는 항체, pAG-MNase, 소화된 단백질-DNA 조각이 자유롭게 세포 안팎으로 확산되도록 하는 데 필수적입니다. 새로운 세포주에서 CUT&RUN 프로토콜을 시작하기 전에, 효과적인 투과를 위한 이상적인 디토닌 농도를 결정하기 위한 최적화를 수행해야 합니다. CUT&RUN 프로토콜에서는 95% 이상의 투과성(세포의 95%가 '죽음')을 달성하는 최소 농도를 사용해야 합니다.

1. 5% 디토닌 육수, 프로테아제 억제제, 스퍼미딘을 얼음 위에 올려 완전히 녹이도록 하세요.
2. 표 1에 따라 워시 버퍼를 준비하고 얼음 위에 보관하세요.
3. 5% 스톡 10 μL와 990 μL 워시 버퍼를 혼합하여 0.05% 디토닌 작업 용액을 준비합니다. 소용돌이로 충분히 섞고 얼음 위에 보관하세요.
4. 이전 용액을 순차적으로 희석하여 각 튜브 1mL의 최종 부피로 희석하여 희석 연속 디토닌(0.05%, 0.01%, 0.001%, 0.0001%)을 생성합니다. 다음 희석으로 넘어가기 전에 각 희석을 소용돌이로 돌리세요. 동시에 워시 버퍼에서 0.05% 디메틸 설폭사이드(DMSO) 대제제(총 100 μL; 표 2 참조)를 준비합니다.
   참고: 디지토닌과 DMSO는 유해 화학물질입니다. 모든 폐기물은 안전하게 뚜껑이 있는 적절한 라벨이 붙은 유해 폐기물 용기에 조심하여 폐기하세요.
5. 모든 디토닌 희석 용액과 DMSO 대조제는 사용할 때까지 얼음 보관하세요.
6. 투과성 조건 수에 검사당 필요한 세포 수를 곱하여 필요한 세포 수를 결정합니다. 피펫팅 변동을 보완하기 위해 추가로 20%를 포함하세요(예: 5×10⁵ 셀 5개 조건 대략 1.2 x 5 x 5 x 10^{5 셀 준비}).
7. 600 × g 에서 원심분리하여 상온(RT)에서 3분간 필요한 배양 세포 수를 수집합니다. 펠릿을 1× PBS 600 μL 용액에 재현탁합니다(조건당 100 μL 추가로 20% 추가).
8. PBS 재현탁 세포 100 μL를 5개의 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 분리하는데, 각 디지토닌 농도별 튜브와 DMSO 대조용 튜브 하나씩.
9. 튜브를 600 × g 에서 3분간 RT 원심분리합니다.
10. 상청액을 조심스럽게 제거하고 각 펠릿을 해당 디지토닌 또는 DMSO 조절 버퍼 50 μL에 재현탁합니다.
11. 샘플을 RT에서 10분간 배양하세요.
12. 처리된 세포 10 μL과 트리판 블루 10 μL을 섞고, 혼합물 10 uL을 세포 카운팅 슬라이드에 적재합니다.
13. 세포 카운터를 사용해 생존 가능한 세포(염색되지 않은 것)와 생존 불가능한 투과성 양성 세포(염색된 파란색)를 정량화하세요.
14. 트리판 블루 양성 세포 비율이 가장 높은 디토닌 농도를 식별하세요. 이 농도를 하위 CUT&RUN 실험에 활용하세요. DMSO 대조군이 정상 건강한 세포 배양과 동일한 생존 가능성을 유지하는지 확인하십시오.

3. CUT & RUN 순서

참고: 이 프로토콜의 시약은 5회 반응에 맞게 조정되며, 피펫팅 손실을 고려해 추가 반응이 추가됩니다. 재료 및 장비 목록은 재료표를 참조하세요. 각 CUT&RUN 실험마다 최소 두 개의 독립적인 생물학적 복제체가 권장됩니다.

1. 1일차
   1. 컷앤런 버퍼 준비
      1. 표 3에 명시된 대로 프리워시 버퍼, 25x 프로테아아제 억제제, 1M 스퍼미딘을 혼합하여 세척 완충액을 준비합니다.
      2. 표 3에 따라 세척 버퍼에 5% 디지토닌을 첨가하여 셀 투과화 버퍼를 준비합니다.
      3. 표 3에 설명된 적절한 디토닌 농도로 100 μL 혈액 투과성 버퍼에 0.4 μL EDTA를 첨가하여 항체 버퍼를 준비합니다. 준비된 버퍼를 얼음 위에 올려놓으세요.
      4. 남은 세포 투과 완충제는 2일차에 사용할 수 있도록 4°C에 보관하세요.
   2. 콘카나발린 A(ConA) 비즈 활성화
      1. ConA 비즈 서스펜션을 부드럽게 다시 현지하여 고르게 분포하도록 하세요.
      2. 비즈 현탁액 55 μL(샘플당 11 μL)을 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.
      3. 튜브를 1.5 mL 자기 랙에 올려 구슬이 완전히 분리될 때까지 놓은 후, 피펫으로 상원액을 제거합니다.
      4. 즉시 500 μL 얼음 차가운 비드 활성화 버퍼(샘플당 100 μL)로 두 번 세척합니다. 각 세척마다 부드럽게 피펫팅하여 구슬을 다시 현탁하고, 마그네틱 랙을 사용해 세척 사이에 상원액을 제거합니다.
      5. 최종 세척 후에는 상원액을 제거하고 활성화된 구슬을 55 μL(샘플당 11 μL) 얼음 차가운 비드 활성화 버퍼에 부드럽게 재현탁합니다.
      6. 8스트립 튜브 세트의 각 튜브에 10 μL 비즈 현탁액을 할당하고 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
   3. 세포를 채취하여 활성화된 구슬에 결합시킵니다
      참고: 세포 생존성은 신호/배경 비율에 중요합니다. 그러나 SCLC NE 세포주의 생존 가능성은 본질적으로 높은 세포 교체율과 현탁 상태에서 중대형 집합체로 성장하는 선호로 인해 변동성이 70%-90%에 달라질 수 있습니다.
      1. 37 °C 인큐베이터에서 세포를 꺼내 현미경으로 검사하여 품질을 확인하세요.
      2. 세포 현탁액을 50mL 원뿔 튜브로 옮기고 원심분리기를 1,000-1,200 × g에서 5분간 RT 상태로 가열합니다.
      3. 원뿔 튜브에서 배지를 흡입한 후 세포 펠릿을 1× PBS 20mL로 세척합니다.
      4. 다시 원심분리기로 삼아 PBS를 흡입한 후, 펠릿 크기에 따라 37°C에서 아큐타제와 함께 3-5분간 소화합니다.
      5. 소화를 종료하려면 PBS 5mL + FBS 10%를 추가하세요. 혈청학적 피펫으로 부드럽게 위아래로 피펫을 움직이며 단일 세포 현탁액을 얻으세요.
      6. 세포를 1,000-1,200 g ×에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버리고 세포 펠릿을 5mL PBS에 재현탁합니다.
      7. 시작 세포 수를 세고, 세포의 생존 가능성과 완전성을 확인하세요.
      8. 반응 수에 반응당 세포 수를 곱하여 총 세포 수를 계산합니다 (5×10⁵). 피펫팅 오차를 고려하기 위해 20% 초과 × 추가하세요(예: 6 반응에 대해 1.2 × 6 × 5 10⁵ ). 계산된 세포 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 원심분리기는 600 x g, RT 3분.
         참고: 백업으로 최소 한 가지 추가 반응을 준비하세요.
      9. RT 워시 버퍼에서 세포를 반응당 5×10^{5 셀(} 총 6회 반응) 밀도로 재현탁하고, 반응당 100 μL를 사용하며, 부드럽지만 철저한 피펫팅을 통해 균일한 현탁을 보장합니다. 원심분리기에서 600 x g 에서 3분간 RT 가열. 피펫으로 상정액을 제거하세요.
      10. 세척 단계(9단계)를 한 번 더 반복하세요.
      11. 8-스트립 세트의 각 튜브에 10 μL 활성화된 CoA 비즈를 포함해 100 μL 세척 세포를 분할 투여합니다. 피펫으로 부드럽게 섞은 후 미니 원심분리기에서 빠르게 돌려 슬러리를 수집하세요(비드는 가라앉지 않아야 합니다).
      12. 세포가 비즈에 결합할 수 있도록 RT에서 10분간 배양합니다.
      13. 튜브를 0.2mL 튜브 자석 선반에 올려놓고 슬러리가 맑아질 때까지 기다린 후 피펫으로 상원액을 제거합니다. 세포가 구슬에 결합되었는지 확인하기 위해 상정액 10 μL을 보관하세요. 남은 상정액을 버리고 빠르게 다음 단계로 넘어가세요.
      14. 자석에서 튜브를 제거하세요. 각 반응마다 즉시 50 μL의 얼음 냉각 항체 버퍼를 추가하고 부드럽게 피펫으로 구슬을 재현탁합니다.
      15. 상정액 10 μL 양쪽과 세포/비드 현탁액 10 μL (항체 버퍼 재현탁)을 10 μL 트리판 블루와 혼합하여 세포 카운터 슬라이드에 적재합니다.
      16. 셀 카운터로 분석해. 상청액에 거의 구슬이나 세포가 없고, 구슬/세포 혼합물에는 구슬로 둘러싸인 투과성 세포가 포함되어 있는지 확인하세요.
          참고: 세포 CoA 구슬의 결합 호환성을 확인하는 것이 중요합니다.
   4. 투과화 및 항체 결합
      참고: CUT&RUN의 성공은 항체가 표적에 얼마나 친화되어 있는지, 그리고 특정 실험 조건에서의 특이성에 결정적으로 달려 있습니다. 저희는 다음을 권장합니다: 1. CUT&RUN에 검증된 상업용 항체를 사용 가능한 경우 사용하세요. 2. CUT&RUN 검증이 없는 표적에 대해서는, 면역형광(IF) 검증된 항체를 고려하는데, IF 항체는 CUT&RUN에서 투과화된 세포 내에서 항체가 표적 에 현장 결합 하는 것과 유사하게 본래 세포 맥락에서 에피토프를 인식합니다. 3. 3-5개의 항체를 병행하여 특정 용도에 가장 효과적인 항체를 선별합니다.
      1. K-MetStat 패널과 피펫을 빠르게 돌려 재현수하세요. H3K4me3 양성 및 IgG 음성 대조군 반응에 2 μL K-MetStat 패널을 추가하세요. 혼합용 피펫과 빠른 스핀 튜브(선택 사항).
      2. 각 반응마다 H3K4me3, H3K4me1, IgG 항체를 각각 0.5 μg, 그리고 서로 다른 출처의 E2F7 폴리클론 항체 0.6 μg을 첨가합니다(표 4). 8스트립 튜브에 라벨을 붙이세요.
      3. 각 반응관을 적절히 섞기 위해 부드럽게 피펫을 사용하세요. 튜브 캡을 올린 상태에서 4°C에서 하룻밤 배양하세요. 튜브를 회전시키거나 뒤집지 마세요^.
2. 2일차
   1. pAG-MNase의 항체 결합
      참고: 비즈가 밤새 가라앉는 것은 정상이며 결과에 영향을 주지 않습니다. 하룻밤 부화 후 구슬이 뭉치거나 끈적거리면 부드러운 피펫으로 다시 현탁하세요. 일관성과 처리량을 높이기 위해 다중 채널 피펫팅이 권장됩니다. 8스트립 튜브를 사용할 때는 ConA 비드가 마르지 않도록 한 스트립씩 버퍼를 제거하고 교체하세요.
      1. 자석 받침대를 얼음 위에 올려놓으세요.
      2. 4 °C 배양 상태에서 8스트립 튜브를 제거하고 빠르게 회전시켜 액체를 수집합니다.
      3. 슬러리가 맑아질 때까지 튜브를 자석 스탠드 위에 올려놓으세요. 피펫을 조심스럽게 피펫으로 제거하고 상정액을 제거합니다.
      4. 튜브는 자석 스탠드 위에 두세요. 튜브를 200 μL 냉각 투과화 완충제로 두 번 세척합니다. 피펫으로 상정액을 제거하세요.
      5. 자석 스탠드에서 튜브를 제거하고 즉시 각 반응에 50 μL의 냉 세포 투과성 버퍼를 첨가합니다. 피펫팅으로 세포/비드를 부드럽게 재현탁합니다.
      6. 각 반응에 2.5 μL pAG-MNase를 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 잘 혼합합니다.
      7. RT에서 반응을 10분간 인큐베이팅하세요.
      8. 튜브를 빠르게 돌려서 다시 자석 받침대에 올려놓고, 슬러리가 맑아질 때까지 보관하세요. 피펫으로 상정액을 제거하세요.
      9. 튜브를 자석 스탠드에 올려놓고, 200 μL 냉각 투과성 버퍼로 두 번 세척합니다. 피펫으로 상정액을 제거하세요.
      10. 자석 스탠드에서 튜브를 제거하고, 50 μL 냉각 투과성 버퍼에 부드럽게 재현탁합니다. 튜브를 얼음 위에 올려놓으세요.
   2. 표적 크로마틴 소화 및 방출
      참고: 접근 가능한 DNA¹²의 의도치 않은 MNase 절단을 최소화하기 위해 0°C에서 Ca²⁺ 의존성 소화를 수행하십시오. 대장균(Escherichia coli, E. coli)과 같은 스파이크인 DNA를 포함하여, 전체 시퀀싱¹³의 약 0.5-5%(이상적으로는 ~1%)를 차지하도록 합니다. 스파이크인 DNA는 시퀀싱 깊이를 정규화하는 데 사용되며, 특히 시퀀스 간 샘플을 비교할 때 중요합니다. 예를 들어, 히스톤 변형 효소의 억제 또는 유전적 결실 후 전 지구적 히스톤 변형 변화를 평가할 때 그렇습니다.
      1. 얼음 위에 올린 상태에서 8튜브 스트립의 각 반응에 100 mM 염화칼슘 1 μL 1을 첨가합니다(단계 3.2.1.10 기준). 피펫을 부드럽게 사용해 구슬을 완전히 재현지하고 효율적인 소화를 보장합니다.
      2. 튜브를 4°C에서 2시간 동안 배양하고, 뚜껑이 덮인 끝을 들어 올립니다.
      3. 새로운 1.5mL 튜브에 스톱 버퍼 믹스를 준비하세요. 각 반응마다 33 μL 스톱 버퍼와 1 μL 대장균 스파이크인 DNA(0.5 ng)를 결합합니다. 부드럽게 소용돌이를 섞으세요.
      4. 2시간 배양 종료 시 각 반응에 33 μL의 정지 버퍼를 첨가합니다. 부드럽게 피펫팅으로 섞으세요.
      5. 반응을 37°C의 열순환기에서 10분간 인큐베이팅합니다.
      6. 빠르게 돌려 바닥에 내용물을 모은 후, 용액이 맑아질 때까지 자석 선반에 올려놓습니다.
      7. CUT&RUN에서 방출된 DNA가 포함된 약 84 μL 상청액을 신선한 1.5 mL 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.
   3. DNA 정제 키트를 이용한 DNA 정제( 재료표 참조)
      참고: 처음 사용하기 전에 DNA 결합 버퍼에 6.9 mL 이소프로판올을, DNA 워시 버퍼에는 95% 에탄올 20 mL≥ 추가하세요.
      1. 각 상청액에 420 μL의 DNA 결합 버퍼를 추가합니다. 잠깐 보텍스를 만들어 완전히 섞으세요.
      2. DNA 정화 컬럼을 채집관에 넣으세요.
      3. 각 샘플을 해당 컬럼에 로드하세요.
      4. 원심분리기 16,000 g × RT 30초 동안 진행. 플로우 스루를 버리고 컬럼을 수집관으로 되돌려.
      5. 각 컬럼에 200 μL DNA 세척 버퍼를 추가하고 16,000 x g 에서 원심분리기에서 30초간 RT 상태에 넣습니다. 플로우 스루를 버리고 컬럼을 채집 튜브에 다시 넣습니다.
      6. 세탁 과정을 한 번 반복하세요.
      7. 16,000 x g 에서 다시 원심분리기를 30초 동안 RT 상태로 돌려 잔류 세척 버퍼를 완전히 제거합니다.
      8. 컬럼을 라벨이 붙은 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
      9. 컬럼 중앙 막에 12 μL 용출 버퍼를 직접 적용합니다.
      10. RT에서 5분간 배양한 후 RT에서 16,000 × g 에서 1분간 원심분리하여 DNA를 희출합니다.
          참고: 이곳은 안전한 정지 지점입니다. 용출된 DNA는 -20°C에 보관하여 향후 처리를 위해 보관합니다.
   4. 컷앤런 DNA 정량화 및 조각 크기 분포 분석
      참고: dsDNA 고감도 분석키트를 사용하여 DNA를 정량하라. 이 키트는 흡광도 기반 방법보다 이중 가닥 DNA를 더 정확하게 측정할 수 있다.
      1. 각 샘플당 1μL을 사용하여 DSDNA 고감도 분석 키트(재료 표 참조)를 사용하여 CUT&RUN DNA 농도를 측정합니다.
      2. 추가로 1 μL의 DNA를 사용하여 절단된 조각의 존재와 크기 분포를 평가합니다. 제조업체의 지침(선택 사항)에 따라 고감도 DNA 키트 (재료표 참조)를 사용하여 조각 분석을 수행하세요.
         참고: 히스톤 번역 후 변형(PTM)과 같은 매우 풍부한 결합 단백질은 이 단계에서 쉽게 검출될 수 있습니다. 하지만 저함량 전사 인자는 검출이 더 어려울 수 있습니다.
   5. 라이브러리 구성, 조각 분석 및 시퀀싱
      참고: dsDNA 고감도 분석키트 정량화를 통해 측정된 ≤ ng 총 CUT&RUN DNA가 CUT&RUN 차세대 시퀀싱(NGS) 라이브러리 구축에 사용되었습니다. 어댑터 다이머를 최소화하기 위해, 어댑터 연결을 위해 일루미에서 어댑터를 1 μL로 줄이세요. 라이브러리 구축 중 PCR 사이클 수는 입력량, 라이브러리 수율, 복제율에 따라 조절할 수 있습니다. 표적-히스톤, PTM, 전사 인자에 따라 다양한 DNA 정제 자기 비즈 (재료표 참조) 크기 선택 전략이 사용될 수 있습니다.
      1. 도서관 제작은 키트 제조사의 지침에 따라 CUT&RUN 도서관 준비 키트( 재료표 참조)를 사용해 소폭 수정을 거쳐 제작되었습니다. 간단히 말해, 라이브러리 준비를 위한 권장 입력으로 5ng의 CUT&RUN DNA가 사용되었습니다. 5 ng 미만의 DNA는 라이브러리 준비에 가능한 한 많이 사용하세요. 성공적인 다중화 시퀀싱을 보장하기 위해 각 샘플마다 이중 i5 및 i7 인덱스 프라이머가 사용되었습니다.
         참고: 이곳은 안전한 정지 지점입니다. DNA는 추가 가공을 위해 -20°C에서 저장할 수 있습니다.
      2. 형광도계와 dsDNA 고감도 분석 키트로 CUT&RUN 라이브러리 농도를 측정하세요. CUT&RUN NGS 라이브러리의 크기 분포는 고감도 DNA 키트 가이드를 기반으로 한 고감도 DNA 키트(재료 표 참조) 또는 유사한 모세관 전기영동 기기인 TapeStation(재료 표 참조)을 사용하여 결정되었습니다.
         참고: CUT&RUN 라이브러리를 희석하여 dsDNA 고감도 분석 키트와 고감도 DNA 키트의 검출 범위 내에 농도를 맞추세요.
      3. 분자 및 고유 인덱스가 동일한 수준을 기반으로 한 풀 라이브러리(40-46). DNA 정제 자기 구슬 크기 선택 후, Illumina NovaSeq 6000 시스템에서 Illumina NovaSeq 6000 시스템에서 반 S-Prime(SP)을 기준으로 라이브러리당 약 1,000만 번의 리드 깊이로 풀린 라이브러리에 대한 쌍말 시퀀싱(100 bp 리드 길이)을 수행했습니다.
   6. 컷앤런 데이터 분석
      1. 맞춤형 파이프라인을 사용하여 CUT&RUN 데이터를 분석합니다(그림 5A). FastQC로 읽기 품질을 평가하세요. Cutadapt를 사용해 읽기 시작 부분에서 어댑터 시퀀스를 제거하세요. Bowtie2와 함께 인간 게놈(hg38)과 대장균 참조 게놈에 정렬 쌍말 리드를 사용합니다. Samtools를 사용해 매핑되지 않은 리드를 제거하세요. Picard로 중복 리드를 제거하고, Bedtools를 사용해 bedGraph 파일을 생성하세요. DeepTools로 bigWig(흑색) 파일을 만드세요. IGV와 DeepTools를 사용해 데이터를 시각화하세요. 총 읽기 수를 급증한 대장균 읽기 수에 정규화하세요. CUT&RUN을 위한 SEACR(희소 풍부화 분석)¹⁹를 사용하여 피크 호출을 수행합니다.

결과

전형적이거나 '고전적인' SCLC NE 세포주는 큰 핵, 적은 세포질, 그리고 부착 응집체 또는 현탁된 조밀한 구체로 성장하는 것이 특징입니다. NCI-H146, DMS79와 같은 ASCL1 높은 세포주와 NCI-H82, H446과 같은 NEUROD1 높은 세포주들은 전형적인 SCLC 표현형을 보인다: 소형에서 중간 크기 세포를 가진 세포질이 적고, 미세한 과립 염색질, 주로 비부착성 응집체 또는 조밀한 구형 형태로 성장하는 경향이 있다. NEUROD1 높은 모델은 NE 마커 발현을 유지하지만, 신경 분화, 세포골격 재형성, 세포 이동과 관련된 전사 프로그램에 대해 풍부하게 작용합니다. 예를 들어, NCI-H82는 크고 느슨하게 결합된 현탁 집합체에서 자라며, H446은 혼합 형태를 보인다—약 80%가 부착 세포, 20%가 현탁 세포—줄기 유사 특징과 표현형 가소성을 모두 강조한다(그림 2).

토론

후생유전학적 조절 이상과 LDTFs는 SCLC 종양^생물학의 주요 동인입니다. SCLC에서 특정 히스톤 변형과 DNA 결합 단백질의 유전체 분포를 규명하면 획득된 치료 내성과 표현형 가소성의 잠재적 메커니즘을 밝혀낼 수 있습니다. CUT&RUN-seq는 세포와^{조직에서 히} 스톤 및 비히스톤 단백질-DNA 상호작용을 고해상도로 매핑하는 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 SCLC NE 세포주에서 치료 개입에 적합한 새로운 유전자 경로를 식별하기 위해 전통적인 ChIP-seq 접근법에 대한 효과적이고 저비용의 대안을 제시합니다.

CUT&RUN-seq는 일반적으로 ChIP-seq에 비해 배경 잡음이 더 적습니다. 하지만 백그라운드 신호는 여전히 발생하여 데이터 분석 중 피크 콜링에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 배경 측정을 최소화하기 위해서...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<스트롱>시약
RPMI-1640 미디어	깁코 써모피셔 사이언티브	11875093	세포 배양 배지
태아 소 혈청 (FBS)	신경역학	FBS002-HI	세포 배양 배지의 구성 요소
1% 페니실린-스트렙토마이신	깁코 써모피셔 사이언티브	15140122	항생제, 세포 배양의 박테리아 오염을 방지하기 위한
트리판 블루 솔루션, 0.4%	깁코 써모피셔 사이언티브	15250061	트라이판 블루 염색을 사용해 자동 세포 계수기를 이용해 투과성을 평가하였다.
로슈 컴플레트, EDTA 프리 프로이즈 억제제 칵테일	로슈	11873580001	프로테아제 억제제. 워시 버퍼 컴포엔트
5% 디지토닌	에피사이퍼	21-1004	버퍼 구성 요소   버퍼 레시피는 버퍼 시트에서 확인할 수 있습니다
비즈 활성화 버퍼	에피사이퍼	21-1001	버퍼 구성 요소   버퍼 레시피는 버퍼 시트에서 확인할 수 있습니다
콘카나발린 A(ConA) 비즈	에피사이퍼	21-1401	ConA 공액 준자성 미세구는 지질막 결합을 가능하게 하는 렉틴 코팅된 자기 구슬입니다
컷& RUN 키트	CUTANA ChIC 에피사이퍼	14-1048	Reagents for CUT& RUN DNA 생성
DNA 정화 키트	CUTANA  에피사이퍼	14-0050	반응 이온에서 상부 내에서 방출된 표적 DNA 조각에서 DNA를 추출합니다
컷& RUN 도서관 준비 키트	CUTANA 에피사이퍼	14-001	CUT&를 생성하세요. RUN 차세대 시퀀싱(NGS) 라이브러리
그리고 nbsp; DNA 정제 자기 구슬	아장쿠르 AMPure XP 벡만 쿨터	A63880	PCR 프로듀트 정화 및 크기 선택 (예: 어댑터 다이머 및 프라이머 제거)
대장균 스파이크인 DNA	에피사이퍼	18-1401	일련의 샘플에서 시퀀싱 판독을 보정하기 위한 외부 스파이크인으로 사용됨; 예를 들어, 치료된 상태와 치료되지 않은 상태의 차이
pAG-MNase	에피사이퍼	그리고 nbsp; 15-1016	1차 항체에 결합한 효소는 칼슘에 의해 활성화되어 결합 단백질 양쪽의 표적 DNA 조각을 절단합니다
PBS PH7.4 1회	깁코 (써모피셔 사이언티픽)	10010-049	세척 셀
프리워시 버퍼	에피사이퍼	21-1002	버퍼 구성 요소   버퍼 레시피는 버퍼 시트에서 확인할 수 있습니다
dsDNA 고민도  분석 키트	큐빗TM 써모 피셔 사이언티브	Q32854	컷& RUN DNA 정량
정지 버퍼	에피사이퍼	21-1003	버퍼 구성 요소   버퍼 레시피는 버퍼 시트에서 확인할 수 있습니다
고감도 DNA 키트	애질런트 테크놀리지	5067-4626	컷& RUN DNA 및 NGS 리브레이, 쿼티피화 및 조각 크기 분포 분석
<강>물질
8스트립 0.2 mL PCR 튜브	에피사이퍼	10-0009k	CUT&S 0.2ml 튜브와 호환되는 RUN 반응 자기 분리 랙
LUNA 8채널 슬라이드	로고스 바이오시스템즈 INC	L72001	세포 세기용 슬라이드, 그리고 nbsp; 세포 생존 가능성 및 무결성 검사
다중 채널 시약 저장소	피셔 사이언티브	14-387-072	세척 완충 용기
DynaMagTM-2 (자기 분리 랙), 1.5 mL 튜브	써모피셔 사이언티브	12321D	ConA 비드는 자기 분리 랙을 통해 저장 버퍼에서 분리한 후, 1.5 mL 마이크로 원심분리관 내 활성화 버퍼 내 재현탁으로 활성화되었습니다.
자기 분리 랙, 0.2 mL 튜브	에피사이퍼	10-0008	분리 상태로 서라고; 구슬 결합 세포, 항체, 반응 및 세척 완충제에서 얻은 pAG/MNase
Eppendor Research와 8채널 피펫, 0.5-10 uL	에펜도르프	3125000010	흡기 8스트립 튜브 샘플   워크플로우를 가속화하기 위해, 비교 가능한 다중 채널 피펫터
에펜도르프 리프렌스 2 8채널 피펫, 30-300 uL	에펜도르프	4926000050	흡입 및 세척 단계로 작업 흐름을 가속화하는 기능, 유사한 다중 채널 피페터
<스트롱>장비
사이언티픽 인더스트리 보텍스-제니 2 믹서, 가변 속도, 120V	피셔 사이언티브	50-728-002	미니 원심분리기와 스핀
루나 FX7 자동 셀 카운터	로고스 바이오시스템즈 INC	L70001	셀 카운터
튜테이팅 믹서	VWR	82007-202	비즈 배화 단계(야간 항체 배양, pAG-MNase 소화 반응).
Eppendorf 6331 넥서스 그라디언트 마스터사이클러 열 사이클러	에펜도르프	6331	컷& RUN 차세대 도서관 건설
큐비트 4 형광도계	써모피셔 사이언티브	Q33226	DNA 정량화.
애질런트 2100 바이오분석기	애질런트 테크놀로지스	G2939A	CUT&를 위한 조각 크기, 농도 분석 DNA와 CUT& RUN 라이브러리, 그리고 nbsp; 유사한 모세관 전기영동 기기(예: Agilent TapeStation)
애질런트 테이프스테이션	애질런트 테크놀로지스	G2992AA	CUT&를 위한 조각 크기, 농도 분석 DNA와 CUT& RUN 라이브러리
일루미나 노바세퀀스 6000 시스템	그리고 nbsp; 일루미나, 캘리포니아주 샌디에이고		CUT&의 풀 시퀀싱 RUN libraries