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연구 논문

교모세포종에서 커큐민에 의한 AKT/Wnt/β-카테닌 경로 조절 및 큐프로토시스 유도

655 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69663

⸱

2026년 1월 27일

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

이 논문에서

요약

커큐민(CUM)은 AKT/Wnt/β-카테닌 축을 억제하여 교모세포종(GBM) 진행을 억제합니다. 이 프로토콜은 CUM이 GBM에서 악성 진행을 방해하는 분자 기전을 조사하고, CUM이 이 경로를 조절하여 큐프로토시스를 유도하는 방법을 설명합니다.

초록

커큐민(CUM)은 교모세포종(GBM)의 악성 행동을 조절할 수 있습니다. 본 연구는 CUM이 AKT/Wnt/β-카테닌 신호 전달 경로를 통해 cuproptosis를 유도하여 GBM 진행을 억제하는지 여부를 조사합니다. 최적의 커큐민 농도는 MTT 분석법을 사용하여 결정되었습니다. A172와 U251 세포는 CUM, AKT 억제제 MK-2206, Wnt 억제제 LGK974, Elsm-Cu(엘레스클로몰 + CuCl2)로 처리되었습니다. 세포 증식, 이동, 침입, 세포자멸사는 각각 카복시 플루오레세인 석시니미딜 아미노 에스터 염색, 스크래치 분석, 트랜스웰 분석, 유세포 분석을 통해 평가하였다. 미토SOX 형광, 해마 대사 분석, 면역형광, Cu2+ 검출, 웨스턴 블로팅을 사용하여 미토콘드리아 산화 스트레스와 유전자유증을 평가하였습니다. AKT/Wnt/β-카테닌 축은 TCF/LEF1 리포터 키트와 서부 블롯을 사용해 분석하였다. GBM 이종이식 모델이 확립되었고, CUM은 5주간 개베지(개베지)로 투여되었습니다. 종양 성장, 자두돌증, AKT/Wnt/β-카테닌 경로 단백질 발현에 미치는 CUM의 효과를 평가하였다. 세포는 시험관 내에서 10 μM 및 20 μM CUM으로 처리되었습니다. CUM 치료는 증식, 이동, 침범을 줄이면서 산화 스트레스와 구두병증을 촉진했습니다. CUM은 또한 Wnt/β-카테닌 신호 전달 활성을 억제했습니다. 경로 억제는 활성 산소종(3.7배)과 Cu2+ (3.1배) 수치를 증가시키고, 디하이드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라제 발현을 감소시켜 악성 행동을 억제하였습니다. 누드 마우스에서 CUM은 종양 성장을 유의미하게 감소시키고, 자두돌증을 촉진하며, AKT/Wnt/β-카테닌 축 활성화를 억제했습니다. 우리 결과는 CUM이 AKT/Wnt/β-카테닌 신호를 억제하고, 유두토유산증을 촉진하며, GBM의 진행을 방해한다는 것을 보여줍니다.

서론

교모세포종은 중추신경계(CNS)에서 가장 흔한 원발성 두개내 악성 종양입니다1. 4등급 교모종은 보통 교모세포종(GBM)을 의미하며, 예후가 좋지않습니다. GBM은 매우 침습적인 뇌종양으로, 중추신경계 악성 종양의 거의 50%를 차지하며, 중앙 생존 기간은3년 미만입니다. 이 질환은 높은 악성 종양과 높은 재발률로 알려져 있습니다 4.5. 현재 GBM 치료 전략은 주로 수술에 의존하며, 방사선 치료, 화학요법 및 기타 종합 치료 방법으로 보완됩니다6. 면역치료, 생물치료, 나노의학과 같은 신흥 치료 전략들이 전임상 연구에서 놀라운 성과를 거두었음에도 7,8, 전체 5년 생존율은 4.3%에 불과하다. 가장 일반적으로 사용되는 화학요법은 잘 알려진 스투프 요법입니다; 그러나 메틸화되지 않은 MGMT GBM 환자의 경우 전체 생존율이 유의미하게 연장되지 않습니다10. 따라서 새로운 치료 전략을 모색하는 것은 환자의 생존 기간을 연장하는 데 매우 중요합니다. 이 연구는 GBM에 대한 커큐민(CUM)의 항암 기전이 유두병증과 관련되어 있다고 가설을 세웁니다.

구리 대사가 비정상이거나 구리로 인한 세포 손상은 일련의 질병을 유발할 수 있습니다11. 기존의 산화환원 조건에서는 환원된 Cu+를 산화하여 Cu2+로 만들 수 있습니다. 츠베트코프 등은 구리에 의한 세포사사의 이전에 발견되지 않았던 기전인 구리 유혈증(cuproptosis)을 발견했습니다. Cu2+ 이온은 아실화 화합물에 결합하고, 이후 Fe-S 클러스터 단백질의 발현이 하향 조절되어 세포 사멸을 일으킨다12,13. 광범위한 연구를 통해 구두균증이 종양의 병태생리학적 과정과 밀접하게 연관되어 있음이 확인되었습니다14,15. Cuproptosis 관련 lncRNA와 유전자는 GBM 예후와 치료에 잠재적인 바이오마커를 나타냅니다16. BCMD는 Cu2+를 방출하고, 구리 단백질증을 유도하며, 면역원성 세포 사멸을 유발하여 GBM17을 치료할 수 있습니다. 따라서 우리는 큐프로토시스가 GBM 치료의 새로운 표적으로 활용될 수 있다고 믿습니다. 그러나 대부분의 기존 방식은 엘레스클로몰-구리(Elesclomol-Cu)와 같은 합성 운반체나 고농도 구리 이온의 직접 유도에 의존합니다. 이 외인성 급진적 개입이 자기돌증 개념을 입증할 수 있지만, 생리학적 상관성과 표적 지정이 부족해 임상적 변형 전망은 제한적입니다. 따라서 GBM의 cuproptosis를 내인성적으로 정확하게 조절하고 상류 신호 전달 메커니즘을 밝힐 수 있는 천연 또는 소분자 화합물을 찾는 일은 이 새로운 기전과 임상 치료 사이의 핵심 다리가 되었습니다.

한의학은 항종양 약물 연구에 있어 널리 가치 있는 자원으로 여겨져 왔습니다. CUM은 전통 중의학 강황에서 추출한 폴리페놀 물질입니다. 현대 약리학은 이 약이 항산화, 항염증, 항종양 기능을 가지고 있음을 확인했습니다. CUM은 다양한 항종양 활성을 가지고 있습니다. 이 기전은 세포자사멸사, 다분자 경로 교란 및 기타 기전을 촉진하여 GBM 세포의 활동을 줄일 수 있습니다18. 시험관 내 실험에 따르면 저선량 CUM과 방사선 치료가 시너지 효과를 내어 항GBM 증식을 촉진할 수 있음이 밝혀졌습니다19. 더불어, CUM은 MAPK20을 포함한 GBM과 관련된 핵심 경로를 조절할 수 있습니다. 전통적인 테모졸로마이드(TMZ) 화학요법과 비교할 때, CUM은 독특한 치료적 이점을 보여줍니다. 테모졸로마이드의 효능은 GBM의 강력한 DNA 수리 기전에 의해 제한되는 경우가 많아 약물 내성을 유발합니다; CUM이 미토콘드리아 대사를 표적으로 하여 큐프로토시스를 유도하는 메커니즘은 TMZ와 무관하다. CUM은 CUPROPTOSIS와 관련된 대사 과정을 조절할 뿐만 아니라, GBM 진행과 관련된 여러 주요 신호 경로를 동시에 방해하여 단일 치료의 한계를 극복하고 복합 치료 전략을 개발할 수 있는 잠재적 길을 제공합니다. 본 연구에서 사용된 CUM의 농도 범위(10-20 μM)는 전임상 치료 연구에서 보고된 유효 농도와 일치합니다23. CUM의 구강 생체이용률이 낮고 혈액-뇌 장벽을 통한 전달 효율이 실용적 적용에서 주요 과제이지만, 신흥 나노 전달 시스템과 표적 변형 전략은 이 병목 현상을 극복할 유망한 해결책을 제공하고 있습니다24.

GBM에서 CUM의 프로아폽토시, 항증식 및 이동 억제 효과는 많은 연구에서 보고되었지만(25,26), 기존 연구의 대부분은 전통적인 세포자멸사 또는 자가포식 경로에 미치는 영향에 초점을 맞추고 있습니다. 본 연구는 CUM이 CUPtosis를 조절하여 GBM의 악성 진행을 억제하는지 명확히 하는 것을 목표로 합니다. 우리는 CUM이 AKT/Wnt/β-카테닌 축을 억제하여 GBM을 억제함으로써 부분적으로 쿠프로토스를 유도할 수 있는지 조사했습니다. 이를 바탕으로 본 연구는 CUM이 GBM 치료를 개선하고 GBM 치료에서 새로운 표적 개발을 위한 실험적 기반을 제공합니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 실험동물의 인도적 돌봄과 사용에 관한 확립된 기관 기준에 따라 수행되었으며, 기관 동물윤리 위원회의 공식 승인을 받았습니다. 동물들의 불편함과 고통을 가능한 한 줄이기 위한 조치가 취해졌습니다.

화학 화합물, 염료, 생물학적 샘플을 이용한 작업은 잠재적 위험을 완화하기 위해 확립된 생물안전 관행을 따랐습니다. 파라포름알데히드, 구리 기반 시약, DHE 등 잠재적으로 위험한 물질은 장갑, 마스크, 안전안경 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하여 취급했습니다. 사용된 시약과 오염된 일회용 물품과 같은 모든 폐기물은 지정된 생물학적 위험 용기로 분리되어 기관 및 환경 안전 규정에 따라 승인된 유해 폐기물 관리 서비스에 의해 처리되었습니다. 전체 실험 설계는 그림 1에 개요가 있습니다.

그림 1
그림 1: 이 연구의 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

세포 배양 및 그룹화
정상 인간 뇌 성상교세포(NHA)와 교모세포종 세포주 A172, U251, LN229, SHG-44(재료 표 참조)를 10% 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배양지에서 배양하였으며, 3°C에서 5% CO₂ 함유의 인큐베이터에서 유지하였습니다. 배지는 이틀에 한 번씩 교체되었고, 세포가 약 80% 합당할 때 통과시켰습니다. CUM의 적절한 용량과 노출 시간은 MTT 분석법을 사용하여 결정되었습니다. NHA, A172, U251, LN229, SHG-44 세포는 각각 24, 48, 7 μM 동안 0, 2.5, 5, 10, 20, 4 μM의 다양한 농도로 처리되었다. 그 후 2μL MTT 용액을 첨가했습니다. 각 우물에 15 μL 디메틸 설폭화물을 첨가하고 부드럽게 혼합했다. 45 nm 대역의 광학 밀도(OD)는 마이크로플레이트 리더기를 사용해 측정되었습니다. 모든 실험에서 미처리된 세포(대조군)가 음성 대조군으로 사용되었습니다.

A172와 U251 세포는 처리 조건에 따라 대조군, CUM 저용량(1 μM), 고용량 CUM 그룹(2 μM), AKT 억제제(MK-2206), AKT 억제제 + Wnt 억제제(MK-2206 + LGK974), Elsm-Cu(엘레스클로몰 + CuCl₂)로 나누어 투여 조건에 따라 나누었습니다. CUM 그룹의 세포는 4시간 동안 10 또는 2 μM CUM으로 처리되었습니다. MK-2206 그룹의 세포는 2시간 동안 1 μM MK-2206을 받았습니다. MK-2206 + LGK974 그룹 세포는 MK-2206 노출 후 h에 대해 μM LGK974로 처리되었습니다. Elsm-Cu 그룹 세포는 100 nM Elesclomol과 μM CuCl₂로 4시간14분간 처리하였다.

유세포검사
각 그룹의 배양된 A172 및 U251 세포는 1 μg/mL PI 염색액이 포함된 PBS와 함께 1분간 배양하였습니다. 그 후 세포는 0.25% 트립신으로 처리되고 원심분리(20 × g, min, 상온)로 수집되었습니다. PI 양성 세포는 PE 채널이 있는 플로우 사이토미터(488 nm 여기)를 사용해 검출되었으며, 세포 사망률은27로 계산되었습니다.

카복시 플루오레세인 석시니미딜 아미노 에스터 (CFSE) 분석
A172와 U251 세포는 μmol/L CellTrace CFSE 염료와 3°C에서 1분간 어두운 환경에서 배양하였습니다. 배지를 중화한 후 세포를 20 × g에서 실온에서 min 원심분리했습니다. 채집 후, 세포는 그룹에 따라 배양 및 처리되었습니다. CFSE 형광 강도는 유세포 측정(488 nm 여기)을 사용해 분석하였다27.

세포 클론 형성 분석
배양된 A172와 U251 세포를 소화하고 재현탁한 후 계수하였습니다. 준비된 셀 현탁액 2밀리리터가 추가되었습니다. 부드러운 혼합 후 약 14일간 세포를 인큐베이팅했습니다. 세포는 4% 파라포름알데히드로 3분간 고정한 후 고정제를 버렸습니다. 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후에요. 군체 이미지가 촬영되었고, 클론 형성률은14로 계산되었다.

셀 스크래치 테스트
A172와 U251 세포(1× 106 세포/웰)를 90% 융합률에 도달할 때까지 배양했습니다. 세포 단일층은 멸균된 2 μL 팁으로 한 번 긁어 상처를 만들고, 이후 다양한 농도의 CUM으로 h시간과 48시간 동안 처리했습니다. 현미경으로 이미지를 촬영했습니다. 긁힌 치유율은 ImageJ 소프트웨어를 사용해 평가되었습니다. 이미지는 8비트 형식으로 변환되었고, 스크래치 영역과 셀 영역을 구분하는 통합 임계값이 설정되었으며, 0시간과 48시간 지점의 스크래치 영역은 Analyze Particles 함수를 사용해 계산되었습니다. 긁힌 치유율(%) = (0시간 거리 − 48시간 거리) / 0시간 거리 × 100%23.

트랜스웰 실험
A172와 U251 세포는 지정된 처리에 노출된 후 효소로 분리되어 200 × g에서 실온에서 5분간 원심분리했습니다. 세포들은 혈청이 없는 배지에 재현탁되었습니다. 마트리젤은 혈청 없는 배지에서 1:8 비율로 희석되어 완전히 혼합한 후 5 μL을 트랜스웰 인서트 상부 챔버에 적용한 후 4시간 배양했다. 우물당 5× 10개의4 셀이 상부 챔버에 추가되었고, 하부 챔버에는 20% FBS를 보완한 60 μL 배지를 배치했습니다. 48시간 배양 후, 세포는 파라포름알데히드로 고정되고 결정 바이올렛으로 염색되었다. 각 우물의 중심과 주변에서 다섯 개의 시야장이 선정되었습니다. 세포를 현미경으로 관찰하고 영상화했습니다. 침윤 세포는 ImageJ를 사용하여 계산되었습니다. 이미지는 8비트 형식으로 변환되었고, 염색된 세포와 배경을 구분하기 위해 임계값이 적용되었으며, Analyze Particles 함수는 막을 통과한 세포를 세었다23.

미토콘드리아 막 전위(MMP) 검출
각 그룹의 배양된 A172와 U251 세포는 JC-1 작업 용액 mL와 함께 어둠 속에서 30분간 배양하였습니다. 세포는 미리 냉각된 JC-1 버퍼로 부드럽게 세척하고, 형광 현미경으로 관찰 및 촬영했습니다. 488 nm 여기를 사용하여 JC-1 고분자 및 단량체 신호는 각각 590 nm와 530 nm 방출 필터를 사용해 수집되었습니다. 적색/녹색 형광 비율(JC-1 집합체와 단량체)은 ImageJ 소프트웨어를 사용해 MMP변화를 평가하기 위해 분석되었습니다. 빨간색과 녹색 채널의 이미지를 별도로 추출하였고, 동일 영역의 평균 형광 강도를 정량화하였습니다.

산소 소비율(OCR) 감지
배양된 A172와 U251 세포를 시딩하였습니다. 플레이트는 적응을 위해 3°C의 예열된 분석기에 넣었습니다. 적응 후에는 결정 매체가 추가되었습니다. 자동 보정 후, 판은CO2 없이 3°C에서 15-2분간 평형을 맞췄습니다. 기저 OCR을 측정하고, 검사 프로그램은 정해진 간격으로 미토콘드리아 OCR을 기록하도록 설정했습니다. 데이터는후속 분석을 위해 내보내졌습니다.

MitoSOX 형광 탐침 반응성 산소종(ROS) 검출
A172와 U251 세포는 1×10 4 cells/mL의 밀도로 조정되었고, 웰당 1mL를 공초점 접시에 시딩한 후 약물 개입이 시행되었습니다. 세포 상정액은 버려지고 희석된 MitoSOX 프로브 1mL(1:1,000)를 추가했다. 세포는 3°C에서 1분간 어두운 환경에서 배양했습니다. 형광 신호는 형광 현미경(여기/방출: 510/580 nm)을 사용해 미토콘드리아 ROS 수준29를 평가하였습니다.

면역형광
커버슬립은 DMEM 배양액으로 한 번 세척했습니다. 그 후 세포 시딩과 약물 개입을 위해 6웰 플레이트에 배치되었습니다. 24시간 후, 세포를 4% 파라포름알데히드에 고정시키고 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 30분간 차단했습니다. 차단액을 제거하고, 디하이드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라제(DLAT)와 β-카테닌을 표적으로 희석한 1차 항체를 적용한 뒤, 1박 동안 °C30에서 배양하였다. 형광 표지된 2차 항체를 도입하여 3°C에서 30분간 배양했습니다. 세포 핵은 DAPI로 카운터 염색을 하고, 슬라이드는 안티페이드 시약을 사용해 장착되었습니다. 형광 이미지는 형광 현미경으로 촬영되었고, 신호 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화되었습니다. 이미지는 8비트 형식으로 변환되었고, 목표 신호와 배경 잡음을 구분하기 위해 일관된 임계값이 적용되었습니다. Rectangle 도구를 사용해 원하는 세포 영역을 선택했고, 평균 형광 강도는27을 측정했습니다. 미토콘드리아를 시각화하기 위해 세포는 20 nM MitoTracker Red CMXRos로 30분간 처리한 후 파라포름알데히드30으로 고정하였습니다.

TCF/LEF1 루시퍼레이스 리포터 키트
A172와 U251 세포 내 Wnt/β-카테닌 활성화는 TCF/LEF1 루시페라제 리포터 키트를 사용하여 평가하였습니다. TCF/LEF 리포터 벡터는 TATA 박스와 T 세포 인자/림프구 강화 인자(TCF/LEF) 반응 요소를 포함하고 있어, 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 통해 β-카테닌 전사 활성을 간접적으로 검출할 수 있습니다. 배양된 A172와 U251 세포는 5 ng TCF/LEF 리포터 벡터로 역형질전환하였습니다. 형질전환 16시간 후, 각각 488 nm와 51 nm 발광 설정의 마이크로플레이트 리더를 사용해 형광 강도를 기록했습니다.

종양 보유 쥐
7주 된 수컷 BALB/c 누드 마우스 10마리(2 ± 2g )는 특정 병원체가 없는 환경(2 °C, 습도 65%)에서 표준 음식과 물을 제한 없이 섭취하는 환경에서 유지되었습니다. 모든 절차는 양쯔대학교 제1부속병원 윤리심사위원회의 승인을 받았습니다(2023092 없으며; 승인일: 2023년 10월 18일).

GBM 이종이식 모델을 구축하기 위해 A172 세포(4 ×10 6 cells/mL)를 혈청 무첨가 배지에 현탁하고, 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 0.1 mL를 피하 주입했습니다. 동물들은 무작위로 대조군 또는 CUM 처리군(n=5개)에 배정되었다. CUM 그룹은 경구 개베이지를 통해 매일 60 mg/kg의 커큐민을 투여받았고, 대조군은 동일한 양의 식염수를 투여했습니다. 종양 직경은 7일마다 베르니어 캘리퍼를 사용해 기록했으며, 종양 부피는 길이 × 너비2 (mm3) × 1/2 공식으로 계산되었습니다. 5주 후, 쥐들은 경추 탈구로 안락사되었고, 종양은 무균 환경에서 채취되어 무게 측정을 위해32번을 측정하였다.

TUNEL 분석법
종양 조직은 4% 파라포름알데히드에 24시간 고정하고, 에탄올로 탈수된 후 파라핀에 박힌 후 μm 두께로 절개하였습니다. 절제는 왁싱 및 재수분 처리, PBS 세척, 항원 추출을 위해 단백질분해효소 K로 50분간 처리하고, 3% 과산화수소로 배열하였습니다. TUNEL 반응 혼합물을 1시간 동안 적용한 후 안티페이드 시약으로 마운팅했습니다. 형광 이미지는 현미경으로 획득되었고, ImageJ 소프트웨어를 사용해 필드당 TUNEL 양성 세포를 정량화하였습니다.

면역조직화학
파라핀 내비 종양 절편은 6°C에서 베이킹한 후 자일렌에서 탈왁된 후 등급별 에탄올 시리즈를 통해 재수화되었습니다. 가열된 EDTA 버퍼를 사용하여 항원 회상이 수행되었고, 이어서 내인성 과산화효소 활성을 소환하였습니다. 슬라이드는 항-Ki-67 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 °C에서 배양하였다. 2차 항체와 20분간 인큐베이팅한 후, 절편을 5분간 디아미노벤지딘(DAB)으로 염색하고 헤마톡실린으로 교환 염색하였습니다. 탈수 후 중성 수지로 마운트한 후, 슬라이드는 현미경으로 촬영되었습니다. 양성 염색은 갈색-황색 침전물로 확인되었고, Ki-67 양성 세포는 ImageJ27을 사용해 정량화되었습니다.

디하이드로에티듐(DHE) 형광 염색
ROS 수치는 DHE 형광 염색을 사용하여 평가하였습니다. 냉동 종양 조직 절편은 PBS로 세척하였다. 배경 형광을 소광한 후 각 단면에 3분간 μM DHE를 첨가했습니다. PBS 세척 후, 일부 구역은 어둠 속에서 밀봉되었습니다. 형광은 현미경으로 관찰되었으며(여기/방출 비율: 518/605 nm), 그룹별로 다섯 장의 무작위 이미지를 수집하였다. ImageJ는 ROS 수치를 정량화하는 데 사용되었습니다.

Cu2+ 콘텐츠 검출
GBM 세포 및 종양 조직 내 Cu2+ 농도는 색도 검출 키트를 사용하여 평가하였습니다. 처리 후 A172와 U251 세포를 채취하여 1,500 × g에서 10분간 원심분리했습니다. 세포 탄환은 0에 재현탁되었습니다. 증류수 mL를 얼음에서 초음파 처리한 후 다시 원심분리했습니다. 종양 조직은 증류수에서 균질화한 후 4°C에서 10분간 원심분리했습니다. 상청액(1 μL)은 96웰 플레이트에 옮긴 후 23 μL 염색 시약과 혼합한 후 밀봉 후 5분간 배양했습니다. 58nm에서 마이크로플레이트 리더기를 사용해 광학 밀도(OD)를 측정했고, Cu2+ 농도는14로 계산되었습니다.

웨스턴 블롯 (WB)
단백질은 배양된 세포와 종양 조직에서 분리되었습니다. 상청액은 12,000 × g에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 얻었으며, 단백질 농도는 BCA 분석법으로 정량화되었습니다. 변성 후 SDS-PAGE로 샘플을 분리하여 PVDF 막으로 옮긴 후 5% 탈지유로 1시간 동안 차단했습니다. 막은 TBST에서 세척되어 FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, P-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-카테닌, p-β-카테닌, β-액틴에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 배양했다(재료표 참조)14,33. 추가 TBST 세척 후, 막은 HRP 결합된 2차 항체와 1시간 동안 인큐베이팅되었으며, ECL 시약을 사용해 개발하고 화학발광으로 시각화하였습니다. ImageJ 소프트웨어를 사용해 Rectangle 선택 도구와 Gels 분석 기능을 사용하여 신호 강도를 정량화했습니다. 상대 단백질 발현은 목표 밴드 회색값과 내부 대조군(GAPDH)의 비율로 계산되었습니다. A172와 U251 세포에서 추출한 핵 추출물은 핵 단백질 추출 키트를 사용해 준비되었습니다. β-카테닌과 라민 B1의 발현이 평가되었으며, 라민 B1이 핵 적재 제어34로 사용되었다.

통계 분석
정량적 결과는 세 개의 독립적인 복제 평균을 반영합니다. 모든 데이터는 정규 분포와 분산의 균질성을 평가하였습니다. 여러 그룹 간 비교에는 일원 ANOVA 후 Tukey의 사후 검정이 사용되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시됩니다. P값이 0.05 미만이면 통계적으로 유의미하다고 간주되었습니다. 이 절차들은 데이터의 견고성을 보장하고 결론의 신뢰성을 지원하기 위해 사용되었습니다.

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결과

GBM 세포 생존 억제와 유도된 세포 사멸
첫째, 2시간, 48시간, 72시간 동안 CCM 개입 후 NHA 세포 생존력에 유의미한 변화가 없었으며(그림 2A), 이는 사용한 CUM 농도가 정상 세포에 독성 영향을 미치지 않았음을 시사합니다. 반면, GBM 세포주(A172, U251, LN229, SHG-44)는 1 μM ≥ CUM 농도에서 생존 가능성이 유의미하게 감소했습니다(P < 0.05-0.001)(그림 2B-E). 이 결과를 바탕으로 이후 실험을 위해 1 μM 및 2 μM CUM과 4시간 노출 시간이 선택되었습니다. CUM 처리 시 A172, U251, LN229, SHG-44 세포의 IC50 값은 각각 21.62, 37.99, 66.11, 49.2 μM이었습니다(

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토론

GBM의 재발률은 악성 생물학적 특성과 관련이 있습니다36. CUM은 산화 스트레스, 세포자살사, 자가포식, 전이, 침윤 및 주요 분자 표적을 조절하여 항GBM 효과를 발휘합니다37. 이 연구에서 세포 수준 실험은 CUM이 GBM 세포 사망률을 유의미하게 증가시키고 증식, 군집 형성, 이동 및 침입을 억제하는 결과를 보여주었으며, 이는 이전 보고서와 일치하는 결과였다20.

Cuproptosis는 GBM30,38을 포함한 다양한 암의 진행과 관련이 있습니다. 생물정보학 분석은 CUM이 간세포암에서 CUP토스시스에 영향을 미칠 수 있음을 시사하지만, ...

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공개 사항

저자들은 이해 상충이 없다고 선언한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1% 결정 바이올렛 염색 용액서비스바이오G1014표지 세포
4% 파라포름알데히드비요타임P0099세포나 조직을 고정하세요
AKT 억제제 (MK-2206)Selleck.cn, 상하이, 중국S1078특정 AKT 억제제
항체(1차 및 2차 항체)ABclonal Technology, 우한, 중국 / abcam, 케임브리지, 영국 / Servicebio, 우한 / Beyotime, 상하이, 중국 / Cell Signaling, Danvers, MA, 미국A8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025단백질 발현 수준 검출
세포 세포자멸사 검출 키트서비스비오, 우한, 중국G1021세포자멸사 검출
세포 흔적 CFSE 염료인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국C34570세포 증식 검출
화학발광 영상 시스템바이오-래드, 허큘리스, 캘리포니아, 미국케미 닥 XRS+단백질의 초고감도 검출
Cu2+ 색도 분석 키트엘랩사이언스, 우한, 중국E-BC-K300-M종양 조직과 GBM 세포에서 Cu2+ 함량 검출
CuCl2독일 다름슈타트의 시그마-알드리히751944큐프로토시스 유도제
커큐민 (CUM)상하이 소스 잎, 중국 상하이S19245폴리페놀 화합물
DHE 탐지 키트비오타임, 상하이, 중국S0063ROS 농도 검출
디메틸 설폭사이드 (DMSO)서비스바이오G4101-2MTT 분석용 용매
ECL 개발자서비스바이오G2161웨스턴 블롯에 사용됨
엘레스클로몰Selleck.cnS1052큐프로토시스 유도제
유세포검사BD 바이오사이언스, 뉴저지, 미국BD FACSAria III세포사멸 및 CFSE 검사에 사용됨
형광 현미경올림푸스, 도쿄, 일본IX73면역형광, ROS, TUNEL, DHE 및 MMP 분석에 사용됨
교모세포종 세포주 A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393), SHG-44 (RRID: CVCL_6902)푸노사이 바이오테크놀로지 유한, 우한, 중국CL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207인간 교모세포종 세포주
그래프패드 프리sm 9.0 소프트웨어그래프패드 소프트웨어 LLC버전 9.0통계 분석
ImageJ 1.53k 소프트웨어국립 정신 건강 연구소버전 1.53k통계 계산
JC-1 작동 솔루션솔라비오, 베이징, 중국M8650MMP 탐지
수컷 BALB/c 누드 마우스슬랙 킹다 실험동물 주식회사, 후난, 중국쥐 실험
마이크로플레이트 리더바이오텍, 버몬트, 미국ELX-800OD450 nm 값 측정을 위해
현미경올림포스BX53세포 스크래치 테스트, 트랜스웰 실험, 면역조직화학 분석에 사용됨
미토소스 프로브서모피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠, 미국M36008ROS 감지에 사용
미토트래커 레드 CMXRos써모피셔 사이언티브M7512살아있는 세포에서 미토콘드리아의 특이적 표지
MTT 탐지 키트서비스바이오G4101-1세포 생존 가능성 검출
정상 인간 뇌 성상교세포 NHA 세포 (RRID:CVCL_B0DK)화투오바이오테크놀로지 유한회사, 중국 선전HTX2408대조군 실험용 세포주
핵 단백질 추출 키트비요타임P0027핵 단백질 추출
해마 세포 에너지 대사 분석기애질런트, 그리고 nbsp; 중국 베이징해마 XFOCR 검출에 사용
TCF/LEF1 루시퍼레이스 리포터 키트바이오랩 테크놀로지 유한회사, 베이징, 중국Wnt/β-카테닌 신호 전달 경로의 활성 검출
TUNEL 탐지 키트비요타임C1088종양 조직에서 세포자멸사 검출
Wnt 억제제 (LGK974)Selleck.cnS7143특정 Wnt 억제제

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