직류 전기장 하에서 인간 지방유래 줄기세포의 연령 의존적 전기주행성 시각화

Summary

소수의 여성 기증자 집단에서는 노화가 hADSC의 전기전위 이동을 감소시켰습니다. DCEF는 유전자 발현을 변화시켰습니다(업 747, 하강 624). 이는 나트륨 수송/채널 GO 항과 PI3K-Akt KEGG 경로를 풍부하게 하여 연령 관련 전기주행성 관여를 시사하지만 인과관계를 입증하지는 못했습니다.

Abstract

인간 지방유래 줄기세포(hADSC)는 조직 재생과 상처 치유에 매우 중요하며, 이들의 지향적 이동은 이러한 치료 효과를 발휘하기 위한 전제 조건입니다. 전기장(EF)은 상처 수리 중 세포 이동을 이끄는 주요 단서로 잘 알려져 있지만, hADSC의 전기적 특성, 특히 기증자 특성(예: 나이)이 이 행동과 그 근본적인 분자 메커니즘을 어떻게 조절하는지는 아직 잘 이해되지 않았습니다. 이러한 지식 격차는 재생 의학에서 hADSC의 최적화된 적용을 제한합니다. 본 연구에서는 hADSC에서 전기주행성 존재를 먼저 검증하고 그 전압 의존성을 확인했습니다: 100-200 mV/mm 직류 전기장(DCEF) 하에서 hADSC는 양극 쪽으로 방향성을 향해 이동했으며, 더 강한 EF 강도는 이동 방향성과 속도를 향상시켰습니다(0 mV/mm 제어 시와 비교). 그 후 200 mV/mm DCEF 자극 후 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 사용하여 젊은 여성 기증자(27.00 ± 4.58년)와 노년 여성 기증자(62.33 ± 4.04년)의 hADSC를 비교하였습니다. 전사체 분석에서는 노령 hADSC에서 747개의 상향 조절 유전자와 624개의 하향 조절 유전자가 확인되었으며, 이들 유전자는 전기주행에 중요한 생물학적 과정/경로(나트륨 이온 막관통 수송, 전압 개폐 나트륨 채널 활성(GO 용어), PI3K-Akt 신호 경로(KEGG 경로) 등에서 풍부하게 발현된 유전자를 포함합니다. 기능적으로, 노령 hADSC는 DCEF 자극 하에 젊은 hADSC에 비해 양음 이동(누적 거리, 유클리드 거리, 직접성 감소)이 유의미하게 감소했습니다. 이 연구는 hADSC에서 연령 의존적 전기주행성에 대한 최초의 증거를 제공하며, 기증자의 나이가 전기전능 능력 저하와 상관관계가 있음을 보여줍니다. 또한 나트륨 채널 활동 조절 이상과 PI3K-Akt 신호가 이러한 연령 관련 감소의 근본 원인일 수 있음을 밝혀냅니다. 이 발견들은 hADSC 전기주행성의 잠재적 조절 메커니즘을 시사하며, 조직 재생과 상처 치유 결과를 개선하기 위해 최적의 기증자 선정 또는 나트륨/PI3K-Akt 경로를 표적으로 하는 hADSC 기반 치료법을 맞춤화하는 데 새로운 통찰을 제공합니다.

Introduction

지방유래 줄기세포(ADSC)는 강한 자기 갱신 능력과 상당한 재생 잠재력을 가지고 있습니다. 적절한 유도 조건에서 이들은 골세포, 연골세포, 지방세포 등으로 분화할 수^{있습니다.} 파라크린 신호를 통해 ADSC는 혈관 및 림프관 생성을 지원할 수 있습니다 ^2,3, 흉터 형성 억제^{4, 면역} 조절 효과⁵. 따라서 ADSC는 재생의학에서 세포 기반 치료에 이상적인 씨앗 세포로 간주됩니다.

ADSC의 기능은 기증자의 나이, 체질량지수, 성별 등 다양한 기증자 특성에 의해 영향을 받으며, 이는 기증자 나이, 체질량지수, 성^{별 등 세포} 치료에서의 잠재적 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 고령 기증자에서 유래한 ADSC는 더 뚜렷한 노화 특성을 보이며, 지방 생성 분화 잠재력, 골형성 분화 잠재력, 이동 능력 ^7,8,9가 감소합니다. 더불어, 각질성 증식을 촉진하고 신체의 자기 수리 메커니즘을 자극하는 능력도 감소합니다¹⁰.

세포 지향 이동은 상처 치유와 조직 재생에서 중요한 생리학적 메커니즘이며, 전기장(EFs)은 세포 이동을 유도하고 상처 수리를 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다¹¹. 예를 들어, 상피 장벽이 손상되면 즉시 내인성 전기장이 생성되어 상처가 치유되고 상피 장벽 기능이 회복될 때까지 지속됩니다 12,13,14. 방향성 세포 이동을 안내하는 신호 중 하나로서, 전기 신호는 접촉 억제, 기계적 힘, 화학작용 인자와 같은 다른 공존 신호보다 우선순위가 높은 것으로 나타났습니다^15,16. 상처 치유와 조직 재생을 촉진하기 위해 약물과 외부 전기 자극 장치를 통해 인체 내인성 전기장을 강화하거나 모방하는 여러 방법이 개발되었습니다^17,18. 전장의 구배에 따라 세포가 이동하는 능력을 전기주행성(electrotaxis)이라고 합니다. 시험관 내 연구에서는 다양한 종류의 세포가 전기장 내에서 방향성 이동이 가능하다는 것이 밝혀졌습니다. 포유류 두개신경능 세포, 인간 성상교세포, 인간 유방암 세포 등 일부 세포는 양극 쪽으로 이동합니다 19,20,21. 다른 세포들은 인간 신장 세뇨관 상피세포, 인간 피부 섬유아세포, 그리고 인간 호중구^22,23,24와 같이 음극 쪽으로 이동합니다. ADSC는 직류(DC) 전기장 내에서 양극 쪽으로 이동하도록 유도할 수 있으며, 장기간 배양 조건에서 외부 펄스 전류는 세포 생존력을 유지하면서 ADSC가 양극으로 방향성 이동하는 것을 효과적으로 촉진하는 것으로 나타났다²⁵. 현재까지 인간 지방 유래 줄기세포의 전기주행성 특성에 대한 연구는 여전히 부족하며, 이들의 전기전술 행동을 조절하는 기저 메커니즘도 완전히 이해되지 않았습니다.

우리는 구배 직류 전기장(DCEF) 하에서 젊은 여성과 노령 여성 기증자의 hADSC에서 연령 의존적 전기전위학적 차이를 체계적으로 연구하고, 전사체 분석을 통해 나트륨 채널 활성과 PI3K-Akt 신호 전달과 관련된 기전을 더욱 밝혀냈습니다. 이 연구에서는 DCEF가 hADSCs에 미치는 영향을 조사했습니다. RNA 시퀀싱과 차별 유전자 풍부화 분석을 사용하여, DCEF 자극 후 젊은 및 노령 여성 기증자로부터 유래한 두 hADSC 그룹 간 유전자 발현 프로필을 비교하여 연령 관련 전사 차이를 확인하였습니다. 우리는 기증자의 노화가 hADSCs의 전기적응 반응성을 저하시키며, 이 연령 관련 감소가 나트륨 채널 활동 변화와 PI3K-Akt 신호 전달과 연관되어 있다고 가설을 세웠습니다.

Protocol

조직 채취 전에 모든 참가자로부터 사전 동의를 받았습니다. 이 연구는 중국의과대학 제1부속병원 윤리위원회(승인 번호: [2018]2018-110-2)의 승인을 받았습니다. 조직 채취 전에 모든 참가자로부터 서면 동의를 받았습니다

hADSC 분리 및 문화
조직 채취: 중국 의과대학 제1부속병원 성형외과에서 시행된 정기 선택적 지방흡입 시술 중에 인체 복부 지방 조직 샘플을 채취하였다. 모든 기증자는 미용 복부 지방흡입을 받은 건강한 여성 자원봉사자였으며, 연구 목적으로 추가적인 수술적 개입은 이루어지지 않았습니다. 조직 표본은 흡인 직후 수술 외과의가 멸균 조건에서 수집하여 30분 이내에 멸균 용기에 넣어 얼음 위에 보관했습니다.

표본 크기: 총 6명의 기증자가 포함되었으며, 3명은 젊은 기증자(나이: 27.00± 4.58세)와 3명의 나이 든 기증자(나이: 62.33± 4.04세)였습니다.

조직 처리: 지방 조직 조각을 50mL 원뿔관에 옮기고, 1,800 x g 에서 4°C에서 3분간 원심분리한 후, 상부 기름상을 조심스럽게 흡인하여 과도한 지질을 제거합니다. 조직 펠릿에 0.2% 콜라겐제 IV형(최종 용량: 지방 조직 1g당 5-10mL)을 넣은 후, 튜브를 37°C 수조나 인큐베이터에 45분간 넣습니다. 소화 중에는 10-15분마다 튜브를 부드럽게 흔들어 콜라게나제와 조직 간의 균일한 접촉을 보장합니다. 소화 후에는 저포도당 DMEM에 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 반응을 종료합니다(중화배지와 콜라게나제 용액의 부피 비율 = 1:1).

주의: 콜라게나제를 다룰 때는 일회용 장갑, 실험복, 안전 고글을 착용하여 피부와 눈 접촉을 피하고, 시약을 생물학적 안전 캐비닛(BSC)에 준비하여 에어로졸 오염을 방지하고, 유출 시 즉시 75% 에탄올로 닦고 오염된 물질은 생물학적 폐기물로 폐기하세요.

세포 격리: 중화된 소화 혼합물을 1,200 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만듭니다. 상청액을 버린 후, 펠릿을 적혈구 용해 완충제(155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA; pH 7.4; 부피: 펠릿당 2-3 mL)에 재현탁한 후 실온(22-25 °C)에서 5분간 배양하여 잔류 적혈구를 용해합니다. 세포 현탁액을 순차적으로 200 μm 체를 통해 여과하여 소화되지 않은 조직 이물질을 제거하고 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

세포 세기: 씨앗 전에 세포 수는 헤모세포미터를 사용해 정량화되었습니다. 간단히 말해, hADSC는 0.25% 트립신-EDTA로 분리한 후 재현탁된 후 0.4% 트라이판 블루 용액과 1:1 혼합하였다. 생존 가능한 세포(염색되지 않은 세포)는 노이바우어 혈구계를 이용해 광학 현미경 하에서 수동으로 집계했으며, 총 생존 가능한 세포 수는 세포 수/mL = (평균 검수된 세포 x 희석 인자 x 10⁴)로 계산되었습니다.

세포 배양: 여과된 세포를 5 x 10 밀도의³ cells/^{cm 2} 크기로 성장 배지(저포도당 DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 씨를 뿌리고, 37°C에서 5%_CO2와 함께 배양합니다. 배지를 2-3일마다 교체하여 비부착 세포를 제거하고 최적의 배양 조건을 유지하세요. 이후 실험에 사용된 모든 hADSC는 세포 특성화(표면 마커 검출, 삼계통 분화 분석), DCEF 자극, 이동 및 형태 분석, 노화/증식 분석, RNA 시퀀싱 등 3번에서 5번에 걸쳐 있었습니다.

hADSC 특성화
세포 표면 마커의 발현: 세포를 70% 합류율로 배양한 후, 0.25% 트립신-EDTA로 부착 세포를 해리합니다(37°C에서 3분간 배양). 세포 현탁액을 300 x g에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 버리고 세포 펠릿을 1x PBS(부피: 1-2 mL)에 재현탁합니다. 샘플당 10 x 10^{5개의 세포}를 100 μL 1x PBS에 재현탁하여 지정된 희석 비율로 형광 결합 항체를 첨가합니다: 항-CD44(1:50), 항-CD90(1:100), 항-CD29(1:50), 항-CD73(1:50), 항-CD105 (1:20)^1,4,7. 항체-세포 혼합물을 4°C에서 어두운 곳에서 30분간 배양하여 형광체 소광을 방지하세요. 배양 후에는 1,000 x g 원심분리기를 4 °C에서 5분간 원심분리하여 상상액을 완전히 흡인합니다. 펠릿을 1-2 mL 1x PBS에 재현탁한 후, 다시 1,000 x g에서 4 °C에서 3분간 원심분리한 후 상원액을 버린 뒤, 이 세척 과정을 2회 반복하여 결합하지 않은 항체를 제거합니다. 마지막으로, 세포 펠릿을 200 μL 신선한 1x PBS에 재현탁하고, 유세포계를 이용해 형광 데이터를 수집한 후 FlowJo 소프트웨어(v10)로 정량 분석을 수행합니다. 게이팅 워크플로우는 표준 MSC 표현형 분석 절차를 따랐습니다: FSC-SSC 게이트로 잔해를 배제하고 크기와 과립도를 기준으로 주요 세포 집단을 선택했으며, 이어서 FSC-A 대 FSC-H, SSC-A 대 SSC-H 플롯을 이용한 더블렛 배제를 통해 단일 세포 사건을 보장했습니다. 그 후 트리판 블루 양성 또는 PI 양성 사망 세포를 배제하기 위해 생세포 게이팅을 시행했습니다. 단일 염색 대조군에는 형광 게이팅이 적용되었고, 염색되지 않은 대조군은 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105(양성 표지자), CD34, CD45(음성 표지자)의 임계값을 설정하는 데 사용되었습니다. 대표적인 게이팅 플롯을 내보내 분석하여 hADSC의 동일성을 확인하였습니다.

분화 가능성
지방 생성 분화: 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 85% 합류율에서 P3 생성 hADSC를 채취한 후, 24웰 플레이트에 1 x 10⁵ 셀 밀도(완전 DMEM 배양 사용)로 시딩하고, 5%_CO2 와 함께 37°C에서 세포가 다시 85% 합류도를 달성할 때까지 배양합니다. 유도 시에는 지방생성 분화 키트를 사용하고, 매뉴얼에 따라 키트 A(지방생성 유도제)와 B(지방생성 유지제)를 재구성하고, 처음 3일간은 A를 사용한 후 1일간 B로 전환하세요. 이 과정을 3주 동안 반복합니다. 염색 시에는 유도 배지를 흡인하고, 세포층을 손상시키지 않도록 3 mL 1x PBS로 세포를 부드럽게 세척한 후, 4% 파라포름알데히드(PFA)로 실온에서 20분간 고정한 후, 0.3% 오일 레드 O 용액(60% 이소프로판올에 준비됨)과 실온에서 15분간 배양합니다. 세포를 1배 PBS로 3번 세척해 과도한 착색을 제거하고, 거꾸로 광학 현미경으로 지질 방울을 20배 촬영합니다.

골형성 분화: 12웰 플레이트에 1 x 10⁵ 세포 밀도로 hADSC를 씨앗하고, 세포가 85% 수합에 도달하면 골형성 분화 키트를 사용해 유도합니다 -- 저포도당 DMEM(최종 농도: 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.1 μM 덱사메타손, 10 mM β글리세로인산 10 m) 키트 구성 요소 A(골생성 유도제)와 성분 B(골생성 보조제)를 재구성합니다. 0.05 mM 아스코르브산-2-인산)을 3주간 3일마다 교환합니다. 염색 시에는 4% PFA가 포함된 세포를 실온에서 15분간 고정한 후, 1x PBS로 3번 세척한 후, 2% 알리자린 레드 S 용액(pH 4.2, 탈이온수에서 준비)과 함께 실온에서 30분간 배양합니다. 분리된 착색물을 제거하기 위해 1배 PBS로 세포를 3번 세척한 후, 위상 차이 현미경으로 칼슘 침착 결절을 20배 영상화하고, ImageJ 소프트웨어를 사용해 알리자린 레드 S-양성 결절의 면적을 측정하여 광화를 정량화합니다.

연골성 분화: 500 x g 에서 500 x g의 250,000 hADSC를 4 °C에서 5분간 15 mL 원뿔형 튜브에 원심분리하여 세포 펠릿을 형성하고, 튜브에 500 μL 완전 DMEM 배지를 추가한 후 37 °C에서 5%_CO2 와 함께 하룻밤 배양하여 펠릿을 안정화합니다. 다음 날, 연골형성 분화 키트를 사용해 유도 시술을 진행하고, 키트 구성 요소 A(연골 유발제)를_CO2 독립적 배지(최종 농도: 1% 페니실린/스트렙토마이신, 10 ng/mL TGF-β3, 50 μg/mL 아스코르브산-2-인산, 100 μg/mL 피루브산나트륨)에서 재구성하고, 3일마다 배지를 부드럽게 갱신합니다(펠릿을 건드리지 않도록 함). 3주 유도 후 4% PFA로 실온에서 30분간 고정, 고정제를 흡입, 0.1% 톨루이딘 블루 O 용액(0.1 M 아세테이트 완충제, pH 4.0에 준비)을 실온에서 15분간 인큐베이팅하고, 착색물을 흡입한 후 펠릿을 탈이온수로 3번 헹구어 과도한 염료를 제거합니다. 그 후 밝야 현미경(20배)으로 촬영하고, ImageJ 소프트웨어를 사용해 톨루이딘 블루 O 염색의 평균 광학 밀도(OD)를 측정하여 황산화 프로테오글리칸 축적량을 정량화합니다.

주의: 4% PFA(독성 및 부식성 시약)를 다룰 때는 일회용 장갑, 실험복, 안전 고글을 착용한 채 반드시 연기후드 안에서만 작업하여 증기 흡입이나 피부 및 눈 접촉을 피하세요. 접촉이 발생하면 즉시 흐르는 물로 15분간 헹구고 의사의 진료를 받으세요. 유해 폐기물 처리를 위해서는 사용된 PFA 및 PFA 오염 물질(예: 피펫 팁, 플레이트)을 PFA 폐기물이라는 전용 화학 폐기물 용기에 수거하고, 기관의 유해 폐기물 프로토콜에 따라 폐기되며, 생물학적 폐기물과 혼합되지 않도록 주의해야 합니다.

전기주행성 챔버 조립: 10cm 페트리 접시 뚜껑 중앙선 양 끝에 직경 0.75cm의 두 구멍을 구멍 뚫고, 접시 가장자리에서 1cm 떨어진 곳에 위치하세요(아가르-소금 다리를 수용하기 위함). 페트리 접시 바닥 중앙선을 따라 각 가장자리에서 4cm 떨어진 곳에 진공 그리스(길이 ≤ 2cm, 너비 ≤ 1cm)를 얇게 바르세요(그림 1A). 멸균된 미세한 핀셉을 사용해 각 그리스 패치에 멸균 1cm x 2cm 유리 커버슬립을 붙이고, 부드럽게 눌러 단단히 밀봉되도록 합니다(커버슬립 파손 방지; 그림 1B-C). 각 부착된 커버슬립 위에 진공 그리스를 얇게 한 겹 더 바르고, 그리스 위에 1cm x 2cm 크기의 멸균 유리 커버슬립을 직접 올려 이중 커버슬립 스택을 만듭니다. 두 커버슬립 사이에 단단히 밀착되도록 부드럽게 눌러 (매체 누출 방지; 그림 1D). 한 커버슬립 스택의 왼쪽 상단 모서리를 가장 가까운 접시 가장자리로, 반대쪽 스택의 오른쪽 아래 모서리를 가장 가까운 가장자리로 연결하는 대각선 선을 따라 진공 그리스를 바르어 연속적인 장벽을 만듭니다. 벽은 접시 바닥에 단단히 붙어 있어야 하며(틈이 없어야 하며), 높이는 약 2cm, 너비는 약 0.5cm여야 합니다(그림 1E). 조립된 챔버를 자외선 아래에서 20분간 멸균하여 미생물 오염을 제거한 후, 사용 전까지 실온에서 멸균 상태로 보관합니다(그림 1F).

DCEF 자극: 멸균 유리 슬라이드(세포 씨앗 투여용)를 10cm 페트리 접시에 넣고, 37°C에서 5%_CO2 와 함께 하룻밤 배양하여 슬라이드를 사전 컨디셔닝(세포 부착 촉진)합니다. 스타인버그 용액 10 mL를 ddH₂O 90 mL에 희석하여 제조합니다 (멸균; 최종 농도: 58 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 0.44 mM Ca(NO₃)₂4H₂O, 0.83 mM MgSO₄7H₂O, 10 mM HEPES; pH 7.4). 준비된 스타인버그 용액 20mL에 0.3g 한천을 추가하고, 한천이 완전히 녹아 용액이 투명해질 때까지 20초간 전자레인지에 돌린 후, 즉시 맞춤형 유리 소금 다리에 뜨거운 한천-스타인버그 혼합물을 채우고 실온에서 고체화시킵니다. 고체 후 소금 다리를 UV 조명으로 15분간 멸균하고, 각각 30mL 스타인버그 용액이 담긴 두 개의 비커를 UV 조명으로 15분간 멸균합니다. 사전 조건화된 멸균 슬라이드 위에 2 x 10⁴ 세포/cm² 밀도의 P3 생성 hADSC를 37 °C에서 5%_CO2 와 함께 24시간 배양하여 세포 접착을 돕습니다. 그 후 세포 시딩된 슬라이드를 조립된 전기주행성 챔버의 활주로로 옮기고, 움직임을 방지하기 위해 멸균된 사이드 슬라이드로 고정합니다. 활주로 밀봉은 진공 그리스 위에 3cm x 2cm 크기의 유리 커버슬립을 덮고, 부드럽게 눌러 단단히 밀폐되도록 하며, 상단 커버슬립 가장자리에 추가 진공 그리스를 발라 장벽을 형성하여 중간 증발을 방지합니다. 챔버의 저장소에_CO2 독립 배지(10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신 보충; 저장소당 5-8mL 용량)를 채우고, 멸균된 한가-소금 브리지를 페트리 접시 뚜껑의 구멍을 통해 삽입합니다(한쪽 끝은 챔버의 매질 저장소에, 다른 쪽 끝은 Steinberg 용액이 채워진 비커에 담가). 그리고 비커를 Ag/AgCl 전극을 통해 전원 공급에 연결하여 안정적인 직류를 공급합니다. 4시간 동안 2 V/cm의 DC 전기장(DCEF)을 적용하고, 디지털 멀티미터로 15분마다 전압을 모니터링하며(필요 시 일정한 전장 강도를 유지하기 위해 조정), 소프트웨어(5배 대관, 밝은 영역 모드)에서 4개의 무작위 자기장에서 5분마다 셀 이동의 타임랩스 이미지를 촬영합니다.

참고: 전기 장비를 사용할 때는 전원 공급 장치와 전극을 건조하게 하여 감전을 방지하기 위해 비전도성 표면에 놓으세요. 전극을 연결하거나 분리할 때는 절연 장갑을 착용하고, 설정 조정 전에 전원을 차단하며, 전기 부품에 누설이 있을 경우 즉시 전원을 차단하고 75% 에탄올에 적신 흡수성 종이로 닦으세요. 이 연구에서는 전기영동실 두께를 최소화하고 약 1mm로 유지하며, 챔버 양쪽 끝에서 다점 전압 측정을 수행함으로써 전장 세기 변화를 10% 이내로 제어하였습니다. 이러한 조건에서 배양 영역 내 전기장 분포는 본질적으로 균일한^것으로 간주됩니다.

이동 및 형태 분석
실시간 영상: DCEF 자극 하의 hADSC 경우, 타임랩스 이미지 시퀀스(5분 간격)를 ImageJ 소프트웨어로 가져오고, 수동 추적 플러그인을 사용해 시작점(t=0)부터 자극 종료(t=4시간)까지 4개의 독립 필드에 걸쳐 100개의 셀을 수동으로 추적하고, 평균 이동 속도(μm/min)와 방향성(D/T 비율, D = 시작부터 끝까지의 직선 거리)을 계산합니다. T = 총 경로 길이)를 사용하며, Chemotaxis Tool 플러그인(ImageJ)을 사용합니다.

추적: 전선 특성 거동을 정량화하기 위해 다음 이동 매개변수를 계산합니다: 방향성 (Σcosθi/n, 여기서 θi는 셀의 변위 벡터와 전기장 방향(EF) 사이의 각도, n은 추적된 셀의 총 수로, -1에서 1까지 범위이며, 값이 1에 가까울수록 더 강한 양극 지향 이동을 나타냅니다), 누적 거리(자극 기간 동안 각 셀이 이동한 총 경로 길이), μm 단위), 추적 속도(누적 거리를 자극 시간으로 나눈 μm/h), 유클리드 거리(각 셀의 직선 시작에서 끝 변위, μm 단위, 순이동을 반영함).

형태계측학: DCEF 자극 후, 4% PFA로 실온에서 20분간 세포를 고정하고, 1배 PBS로 3회 세척한 뒤, 세포골격을 Phalloidin-TRITC(1배 PBS에 1:500 희석; 24웰 플레이트의 경우 200 μL 부피)로 실온에서 30분간 염색하여 F-액틴을 표지하고, 핵을 DAPI(1 μg/mL 1x PBS; 부피: 웰당 100 μL) 5분간 투여했습니다. 세포는 형광 현미경으로 20배 배율로 촬영되었으며(대표적인 고해상도 이미지는 40배로 촬영됨). 팔로이딘-TRITC는 여기 파장 540-555 nm와 방출 파장 565-580 nm로 시각화되었고, DAPI는 여기 파장 358-405 nm와 방출 파장 420-480 nm로 영상화되었습니다. 그 다음 ImageJ에서 다음 형태학적 매개변수를 측정합니다: 장축(최대 페렛 직경, 셀 경계에서 임의의 두 점 사이의 가장 긴 거리), 수직 길이(셀의 긴 축에 수직인 너비), 그리고 수직도(sinα, 여기서 α는 셀의 장축과 EF 방향 사이의 각도이며, 값이 클수록 EF와의 정렬이 더 커짐을 나타냅니다).

노화 및 확산 분석
SA-β-갤 염색: 노화 검출 키트를 사용해 명예상치 현미경(20배 대물렌즈)으로 노화 세포(청색 염색 세포)를 식별하세요. 씨앗 P3 생성 hADSC를 6웰 플레이트에 2 x 10^{5 셀 밀도} 로 배치하고, 80% 수율까지 배양하고, 배양지를 흡입한 뒤, 세포를 1x PBS로 3번 부드럽게 세척하고, 각 웰당 1mL 고정액(키트에 제공됨)을 추가한 뒤 실온에서 15분간 배양, 고정 후 잔여 고정액을 제거하기 위해 1x PBS로 세척 셀을 3회 세척합니다. 매웰당 SA-β갤런 염색 작업 용액 0.5mL(키트 매뉴얼에 따라 50 μL SA-β갤런 기질과 450 μL 염색 버퍼를 혼합하여 제조), 투명 필름으로 플레이트를 밀봉(증발 방지), 37 °C에서 하룻밤(16-18시간) 배큐(_CO2 노출은 pH를 변경하고 효소 활성을 억제함) 배큐합니다. 다음 날, 우물당 ≥10개의 무작위 필드(10배 목표 관측)의 밝시야 이미지를 촬영하고, 청색 염색(SA-β-gal⁺) 셀 수와 총 셀 수를 세고, 노화 셀의 백분율을 (SA-β-gal⁺ 셀 수 / 총 셀 수) x 100으로 계산합니다.

Ki67 면역염색
SA-β갤런 염색 후 염색 용액을 흡인하고, 세포를 1배 PBS로 2회 세척하며, 0.1% Triton X-100(1배 PBS에 분제; 1mL 1 웰)으로 세포막을 투과시키고, 5% BSA(1x PBS; 1mL) 용액으로 세포막을 1시간 동안 차단합니다. 그 후 세포는 Anti-Ki67 1차 항체(1% BSA/PBS에 1:200 희석; 웰당 500 μL)와 함께 4°C에서 밤새 배양했습니다. 다음 날, 세포는 1배 PBS로 3회(각각 5분씩) 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거하고, Alexa Fluor 488 488 결합 2차 항체(1% BSA/PBS에 1:500 희석; 웰당 500 μL)와 함께 실온에서 1시간 동안 어두운 환경에서 배양했습니다. 세포는 1x PBS로 3회 세척한 후 DAPI(1 μg/mL in 1x PBS; 웰당 200 μL)로 5분간 교환했습니다. 형광 이미지는 형광 현미경을 사용해 20배 배율로 촬영했으며(대표적인 고해상도 이미지는 40배로 촬영됨). Alexa Fluor 488 표지된 Ki67⁺ 세포는 485-495nm의 여기 파장과 515-545 nm의 방출 파장으로 시각화되었으며, DAPI 염색된 핵은 358-405 nm의 여기 파장과 420-480 nm의 방출 파장으로 영상화되었습니다. 증식 세포의 비율은 다음과 같이 계산되었습니다: (Ki67⁺ 세포 수 / DAPI⁺ 핵 수) x 100.

참고: 1차 및 2차 항체를 취급할 때는 오염을 방지하기 위해 BSC에서 작업하고, 반복적인 동결-해동 과정을 피하기 위해 항체를 일회용 용량으로 분리하며, 항체 오염 물질(예: 피펫 팁, 플레이트)을 전용 오토클레이브식 생물학적 폐기물 봉투에 담아 오토클레이브로 멸균한 후 폐기해야 합니다.

hADSC의 연령 의존적 전기주행성 분석: DC 펄스 전원 공급 장치를 사용하여 0 mV/mm(대조), 100 mV/mm, 200 mV/mm 세 가지 강도의 DCEF를 생성하고, 라이브 셀 워크스테이션을 이용해 세포 이동을 실시간으로 관찰하고 기록하며, 각 EF 강도에 대해 젊은 및 노령 여성 기증자의 hADSC의 양극 이동 용량을 누적 거리를 측정하여 정량적으로 비교합니다. 유클리드 거리, 추적 속도, 방향성을 사용하며, 그룹별로 세 개의 독립적인 생물학적 복제를 통해 결과 신뢰성을 보장합니다. 전선적 이동 매개변수는 ImageJ(NIH)의 수동 추적 및 화학주성 도구 플러그인을 사용하여 정량화되었습니다. 개별 세포는 4시간 동안 전체 자극 기간 동안 수동으로 추적되었으며, 표준 방법에 따라 다음 매개변수가 계산되었습니다: 누적 거리: 기록 기간 동안 각 세포가 이동한 총 경로 길이. 유클리드 거리: 셀의 시작과 끝 위치 사이의 직선 거리입니다. 트랙 속도: 누적 거리를 총 추적 시간(μm/h)으로 나눈 값입니다. 방향성: 각 변위 벡터와 전기장 벡터 사이의 각도(θ)의 평균 코사인으로 계산되며(값은 -1에서 1 범위, 1에 가까운 값은 강한 양극 이동을 나타냅니다).

RNA 시퀀싱
RNA 추출 및 준비: 얼음이 채워진 용기를 자외선에 15분간 소독하여 RNA 안정성을 유지하고, 이후 모든 과정을 얼음 위에서 수행하세요. 전기주행실에서 멸균된 페트리 접시로 hADSC 시드 유리 슬라이드(1cm x 2cm)를 옮기고, 3mL의 얼음 냉각 1x PBS로 세포를 3번 세척합니다(PBS를 부드럽게 첨가하고 약간 저은 후 잔류 배지를 제거하기 위해 완전히 흡입). 그 후 각 슬라이드에 1mL의 TRIzol 시약을 추가하고 실온에서 20분간 배양하여 세포를 완전히 용해합니다(용해액이 세포층 전체를 덮도록 하세요). 용해물을 RNase 없는 1.5mL 원심분리관으로 옮기고, 0.2mL의 클로로포름을 추가한 뒤, 15초간 강하게 소용돌이를 돌려 상 분리를 유도하고, 튜브를 얼음 위에 15분간 배양한 후 12,000 x g 에서 4°C에서 15분간 원심분리합니다. 이로 인해 용해액은 세 층으로 분리됩니다: RNA를 포함하는 상부 수상, 중간 단백질 층, 그리고 하부 유기상. 상단 수용상(≈ 0.5 mL)을 새로운 RNase 없는 튜브로 조심스럽게 옮기고(중간 층은 접촉하지 않음), 0.5 mL 이소프로필라올을 추가하고, RNA를 침전시키기 위해 부드럽게 소용돌이를 돌리고, 얼음에서 10분간 배양한 후 12,000 x g 용량에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다; RNA는 튜브 바닥에 흰색 펠릿을 형성합니다. 상청액을 버리고, RNA 순도를 높이기 위해 이소프로판올 침전을 한 번 반복한 뒤, 상원액을 완전히 흡입하고, RNA 펠릿을 실온에서 BSC에서 5-10분간 자연 건조(과도하게 건조하지 마세요, 용해도를 낮추므로 말라), RNA 펠릿을 DEPC 처리수 30 μL에 재현탁하고, 55 °C에서 10분간 배양하여 용해를 돕습니다. 분광광도계를 사용해 A260/A280 비율(목표 1.8-2.0)을 측정하여 RNA 순도를 정량화하고, RNA 나노칩을 사용해 RNA 무결성을 평가합니다; 목표: RNA 무결 수(RIN) > 8.0이며, 시퀀싱 전까지 -80 °C에서 적격 RNA 샘플을 보관합니다.

주의: 트리졸과 클로로포름은 독성이 강하고 휘발성 있으며 발암성이 있으므로, 니트릴 장갑, 실험복, 안전 고글을 착용한 채 반드시 연기구 내부에서만 다루세요. 증기 흡입을 피하고, 피부에 쏟을 경우 종이 타월로 닦고 비누와 물로 10분간 헹구며, 표백제나 기타 산화제와 섞지 마세요(이는 독성 가스를 발생시킬 수 있습니다). RNA 추출과 관련된 유해 폐기물 처리의 경우, 혼합물, 이소프로판올 상원액, 오염된 튜브를 RNA 폐기물(수용성 폐기물 또는 생물학적 폐기물과 혼합하지 않음)라고 표시된 밀폐되고 화학적으로 내성적인 용기에 담아 처리하고, 기관의 유해 폐기물 프로토콜을 준수하여 배수구로 물을 쏟지 않도록 처리하십시오.

데이터 전처리 및 품질 관리: 제조사 프로토콜에 따라 VAHTS mRNA-seq 라이브러리 준비 키트를 사용해 시퀀싱 라이브러리를 준비합니다 -- 올리고(dT) 자기 구슬을 사용해 mRNA를 농축하고, 이가 양이온을 사용해 mRNA를 200-300배지의 조각으로 분기하며, 무작위 헥사머를 사용한 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하고 두 번째 가닥 cDNA를 합성하고, 말단 수리를 수행하며, A-테일을 추가하고, 시퀀싱 어댑터를 연결하며, PCR로 라이브러리를 증폭하고, 비즈를 이용해 정제합니다. 시서열 플랫폼(150 bp 쌍 종단 리드)에서 라이브러리를 시퀀싱하여 샘플당 약 5천만 개의 원시 리드를 생성한 후, 소프트웨어를 사용해 저품질 리드(프레드 품질 점수<20)를 가진 >50% 염기를 가진 리드를 제거함)과 어댑터 서열을 제거하여 샘플당 약 4,800만 개의 클린 리드(Q30 > 90%)를 유지하여 트리밍 후 후속 분석에 사용할 수 있습니다.

생물정보학 분석: Hisat2 v2.2.1 소프트웨어를 사용해 깨끗한 리드를 인간 참조 게놈(GRCh38/hg38)에 정렬하고, 정렬 결과를 BAM 파일 저장하며, htseq-count v0.13.5 소프트웨어를 사용해 각 유전자에 매핑된 리드 수를 세고(Ensembl 유전자 주석 기반), DESeq(2012) R 패키지의 estimateSizeFactors 함수를 사용해 배치 효과와 시퀀싱 깊이 차이를 제거하기 위해 유전자 수 데이터를 정규화합니다. nbinomTest 함수(DESeq 패키지)를 사용하여 차별 발현 유전자(DEGs)를 선택하며, 접힘 변화 임계값(FC) 2와 조정된 p-값(padj) 0.05>< 사용하여 차별 발현 유전자(DEGs)를 선택했습니다. clusterProfiler v4.0 R 패키지를 사용하여 DEG에 대한 유전자 온톨로지(GO) 풍부 분석(생물학적 과정, 분자 기능, 세포 구성 요소) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로 풍부 분석을 수행하며, 세포 이동(예: 세포 부착, 세포 이동), 이온 수송(예: 나트륨 이온 관통막 수송), 신호 경로(예: PI3K-Akt 신호 전달 경로)와 관련된 농축에 중점을 둡니다. pheatmap v1.0.12 R 패키지를 사용하여 DEG에 대해 비감독 계층 클러스터링을 수행하고, 표본 간 유전자 발현 패턴을 히트맵(행 척도 z-점수)으로 시각화합니다.

통계 분석: 모든 실험 데이터는 평균 ± 표준 오차(평균 ± SEM)로 제시되며, 그룹당 최소 3개의 독립적인 생물학적 복제(n ≥ 3)가 존재합니다. 학생 t-검정을 사용하여 두 그룹(예: 젊은 기증자 대 노인 기증자 간 차이)과 일방향 분산분석(ANOVA)을 사용하고, Tukey의 사후 검정을 사용해 세 개 이상의 그룹 간 차이(예: EF 강도 차이)를 비교합니다. SPSS 23.0 소프트웨어를 이용한 통계 분석을 수행하고 통계적 유의를 다음과 같이 정의합니다: *p < 0.05, **p < 0.01, p < 0.001.

Results

전기장 적용은 hADSC의 방향성 이동을 안내하고 이동 능력을 향상시킵니다
추출된 hADSC는 전형적인 간엽 줄기세포 표면 표지자(예: CD29, CD44, CD90, CD73, CD105)를 보였으며, 삼계통 분화 가능성(지방생성, 골형성, 연골생성; 그림 2A)는 hADSC 식별의 표준 기준을 충족합니다. 우리는 0 mV/mm, 100 mV/mm, 200 mV/mm 강도의 직류 전기장(DCEF)을 적용하여 hADSC의 전기적 진정 반응을 조사하였습니다. 전기 자극이 없는 대조군(0 mV/mm)에서는 hADSC가 무작위 방향으로 이동했습니다. 그러나 200 mV/mm의 외인성 DCEF 자극 하에서 세포들은 양극 쪽으로 방향성을 이동했다(그림 2B). 더불어, 전기장 강도가 높아질수록 양극 쪽으로 이동하는 hADSC의 수가 증가했습니다(그림 2C-D<...

Discussion

조직 손상 복구 및 재생 초기 단계에서 전기장은 미세 환경에서 가장 초기의 물리적 단서 중 하나로 나타납니다. 이들의 방향성 특성은^{손상 부위}로 세포가 모집되는 시공간적 상관관계가 있습니다. 내인성 전기장은 상피 조직에서 편극된 이온 수송에 의해 생성된 초상피 전위에서 기원합니다. 상피 장벽이 파괴되거나 노화를 겪으면 전위는 2차적으로 변화하지만, 손상되지 않았거나 노화하지 않은 영역은 이온 수송을 유지하여 상피 표면과 평행한 DCEF²⁸을 생성하는 전압 구배가 발생합니다. 이 시나리오에서 손상 중심은 음극 역할을 하여 전기장의 핵심 구성 요소 역할을 합니다. ADSC는 지방 조직²⁹의 특정 줄기세포 지적 내에 존재합니다. 점점 더 많은 증거가 ADSC가 본래의 지위에서 벗어나 피부 회복^{과 재생에} 참여...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4° C/-20° C/-80° C 냉장고	하이얼, 중국	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
아가르	허시, 중국	10000561
애질런트 2100 바이오분석기	애질런트 테크놀로지스, 미국	G2939BA
알리자린 레드 S	시그마-올드리치, 미국	A5533
생물안전 캐비닛	서모피셔 사이언티픽, 미국	1300 A2 1.5 m
CaNO3· 4H2O	허시, 중국	10013960
원심분리기	서모피셔 사이언티픽, 미국	X4R 프로
CO2 인큐베이터	서모피셔 사이언티픽, 미국	포마 스테리-사이클 3307
콜라게나제 IV형	바이오샤프, 중국	BS076
공초점 현미경	자이스, 독일	LSM 900
DC 펄스 전원 공급 장치;	대도 파워트로닉스, 한국	DDP-500
덱사메타손	시그마-올드리치, 미국	D4902
디지털 멀티미터	플루크, 미국	플루크-175
DMSO	시그마-올드리치, 미국	D2650
전자 균형 및 nbsp;	사르토리우스, 독일	BSA224S-CW
FBS	깁코, 미국	10270-106
플로우 사이토미터	서모피셔 사이언티픽, 미국	A24858
IBMX (1-메틸-3-이소부틸크산틴)	시그마-올드리치, 미국	I7018
인도메타신  그리고 nbsp;	시그마-올드리치, 미국	I7378
인슐린	시그마-올드리치, 미국	I5500   그리고 nbsp;
역현미경	자이스, 독일	액시오 옵서버 7 / ACR
ITS-G	시그마-올드리치, 미국	I3146
KCl	허시, 중국	10019318
KH2PO4	허시, 중국	10019320
리놀레산	시그마-올드리치, 미국	L1376
라이브 셀 스테이션	라이브 셀 인스트루먼트, 한국	참리드 TC
저포도당 DMEM	깁코, 미국	11885084
MgSO4· 7H2O	허시, 중국	10019322
Na2HPO4middot; 12H2O	허시, 중국	10019324
나클	허시, 중국	10019318
나노드롭 2000 분광광도계	서모피셔 사이언티픽, 미국	ND-2000
오일 레드 O	시그마-올드리치, 미국	O0625
페니실린/스트렙토마이신	깁코, 미국	15140122
피펫	독일 에펜도르프	4920000061
SYBR 프리믹스 EX Taq	타카라, 중국;	RR420A
톨루이딘 블루 O  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp;	시그마-올드리치, 미국	T3260
트리스	허시, 중국	10019326
트리졸	비오타임, 중국	R0016
트립신-EDTA	깁코, 미국	25200056
직립 현미경	자이스, 독일	415200-0000-000
진공 그리스	다우 코닝, 미국	1597418
비타민 C  그리고 nbsp; 그리고 nbsp;	시그마-올드리치, 미국	A4544
정수 시스템	서모피셔 사이언티픽, 미국	그리고 nbsp; GenPure xCAD Plus UF-TOC
&β;-글리세로인산	시그마-올드리치, 미국	G9422