초파리 멜라노가스터에 대한 제논 마취를 이용한 고압 시스템 검증

요약

대기압에서는 무해해 보이는 가스가 고압 조건에서 마취와 같은 행동을 유발할 수 있습니다. 기존의 고압 압력 챔버는 비용이 많이 들고 노동 집약적입니다. 이 연구는 4기압 이하의 중간 압력에서 제논이 Drosophila melanogaster에 미치는 영향을 간단하고 저비용으로 평가하는 방법을 제시합니다.

초록

고압 상태에서는 주변 가스의 농도가 높아지면서 다양한 동물에게 행동 반응이 나타날 수 있습니다. 이 행동들 중 상당수는 아직 잘 이해되지 않은 인지 상태의 변화를 나타냅니다. 대표적인 예로는 전신마취가 있습니다. 전신 마취, 즉 마취 상태에서 여러 가스가 고압 상태에서 행동에 미치는 영향은 의학에서 약물이 압도적으로 자주 사용되고 있음에도 불구하고 오랜 과학적 탐구로 남아 있습니다. 제논은 귀한 가스이자 마취제로 분류되며, 인간의 전신마취에 가장 안전한 선택 중 하나로 여겨집니다. 하지만 정상 기압 조건에서는 파리를 마취시키지 않습니다. 여기서 우리는 주변 압력을 최대 ~3기압까지 증가시키고, 가장 인기 있는 모델 생물 중 하나인 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster )에서 제논 마취를 연구할 수 있는 간단한 실험 장치를 구축했습니다.이 실험 장치는 고압 조건 하에서 다른 가스와 그 영향에 대한 연구를 더욱 용이하게 합니다.

서론

고압 상태에서 관찰된 행동 효과의 두 극단은 산소에 의한 경련과 질소에 의한 마취^입니다. 흥미롭게도, 의식 저하 수준 이전에 압력 상태에서 질소와 수소를 섭취했을 때 환각과 기억 장애와 같은 인지 장애가 보고된 바 있습니다. ^3,4. 고압 상태에서 제논, 크립톤, 아산화질소에 의해 유도된 마취가 ^{5,6 이전에 보고}된 바 있습니다.

전신마취는 의학의 초석이자 상당한 과학적 관심사를 지닌 현상입니다. 오랜 기간 널리 사용되었음에도 불구하고, 일부 화학물질이 일시적인 움직임, 기억, 통증, 의식 부재를 어떻게 유도하는지에 대한 우리의 이해는 제한^{적입니다.} 제논은 비한 기체로서 마취제 중 가장 특이한 존재로 분류될 수 있다. 빠른 유도와 회복, 최소한의 생리적 교란, 수술 후 메스꺼움 등 경미한 부작용만 동반하는 안전한 마취 옵션으로 여겨집니다 ^8,9.

마취의 의학적 중요성과 제논의 특이한 화학적 특성을 고려할 때, 본 연구는 간단한 동물 모델인 Drosophila melanogaster를 사용하여 제논 유발 마취를 조사하는 것을 목표로 합니다. 초파리를 이용한 다양한 연구 연구가 전신마취를 연구했으며, 다양한 제안된 설치 방법과 휘발성 마취제 사용이 10,11,12,13. 그러나 초파리에서 제논 마취에 대한 보고는 없습니다. 정상기압 조건에서는 제논이 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster, 흔히 과일파리)에서 마취를 유도하지 않습니다. 이 한계를 해결하기 위해 본 연구는 1기압에서 약 4기압 사이의 주변 압력을 제어하여 조절할 수 있는 고압 시스템을 제공합니다. 비슷한 호기심을 해결하기 위해 고압산소 챔버를 이용한 여러 연구가 있었습니다^14,15. 하지만 대부분의 상업용 고압산소 챔버는 견고하고 누설 방지 소재를 사용하지만, 용량이 많음(~3L)이고 운영이 체계적으로 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 대신 이 글에서 설명하는 방법은 간단하고 저렴하여 다양한 가스와 그 조합의 영향을 탐구할 수 있게 합니다. 이 시스템은 D. melanogaster와 C. elegans 같은 소동물 모델에 적합한 환경을 제공합니다.

프로토콜

1. 초파리 멜라노가스터 제제

1. 각 실험마다 1-3일 된 암파리 20마리와 수컷 20마리를_CO2를 사용해 채취합니다.
2. 실험 전 최소 24시간 동안 먹이와 함께 약 24시간 동안 ~22 °C 온도에서 선택된 파리를 안치시킵니다.

2. 마취 전달

1. 실험용으로 용기 가스 실린더에서 누출 방지 가스 주머니로 가스를 옮기세요. 용기에서 봉지로 가스를 직접 전달하려면 실리콘 튜브를 사용하세요.
2. 폴리프로필렌 주사기에 25mm(직경 3.4mm) 실리콘 튜브를 부착하세요. 그 다음 폴리프로필렌 주사기를 가스 주머니와 3방향 탭에 연결하세요. 명확성을 위해, 나머지 텍스트에서는 폴리프로필렌 주사기를 주사기 #1로 부르겠습니다.

3. 고압 장비 조립 (그림 1)

1. LED 조명 테이블을 테이블 위에 가로 방향(테이블 표면에 수평으로 긴 가장자리)으로 배치하세요.
2. 주입 펌프를 LED 라이트 테이블의 짧은 면 중 하나 옆에 배치하여 펌프의 방향이 실험용 주사기가 백라이트 위로 뻗어 나올 수 있도록 하세요.
3. 실험용 주사기가 위치한 부위를 가리기 위해 카메라를 설치물 위에 위치시킵니다.
4. 길이 75mm(직경 3.4mm)의 실리콘 튜브를 자릅니다. 중앙 노즐의 실리콘 튜브를 이용해 3방향 탭을 마노미터에 연결하세요.
5. 마노미터 옆면과 3방향 탭에 호스 스프링 클램프를 사용해 튜브가 단단히 조여 있는지 확인하세요.
6. 주입 펌프 제어 장치에 있는 이중 화살표 버튼을 사용해 속도를 80 mm/m로 설정하고, 플런저의 자동 압축 또는 감압 시간을 38초로 설정합니다.

4. 제논 마취 절차

1. 실험실 내 주변 조명을 제한하고 LED 조명 테이블을 켜서 밝기를 3단계로 설정하세요. 이렇게 하면 영상의 대비가 더 높아집니다.
2. 폴리카보네이트 주사기의 플런저를 제거하세요. 파리가 도망가지 못하도록 주사기 젖꼭지에 소량의 면을 넣으세요. 명확성을 위해 폴리카보네이트 주사기는 본문의 나머지 부분에서 주사기 #2로 불리겠습니다.
3. 40마리의 파리를 바이알에서 주사기 #2로 옮기려면, 먼저 바이알 뚜껑을 열고 주사기 통을 세로로 바이알 위에 올려놓습니다. 배럴 플랜지는 바이알 상단과 합쳐져 플라이가 주사기 배럴 안으로 들어갈 수 있도록 해야 합니다. 구조물을 180° 돌리고 탭하세요. 이렇게 하면 플라이가 주사기 배럴 바닥에 위치하게 됩니다. 플런저를 다시 꽂으세요. 플라이가 든 주사기를 주입 펌프 안에 넣으세요.
4. 주사기의 배럴 자국을 옆면에 위치시켜 카메라 시점에서 파리를 더 잘 볼 수 있도록 하세요.
5. 조절 가능한 나사를 사용해 주사기를 배럴과 플런저 헤드에서 주입 펌프로 고정하세요.
6. 주사기 #2 끝에 있던 면을 빼내고 3방향 탭으로 연결하세요.
7. 영상 녹화 시작해. 마노미터를 켜. 스톱콕을 돌려 마노미터와 주사기 #2를 연결하고, 마노미터로 주사기 내 압력이 0 kPa인지 확인하세요.
8. 실험 전에 3방향 탭을 옆으로 돌려 주사기와의 공기 교환을 허용하세요.
9. 플런저를 20에서 2mL 지점으로 이동하려면 주입 펌프의 수동 제어 옵션을 통해 가장 빠른 선택을 가능하게 합니다.
10. 가스 백에서 주사기 #1로 마취 가스 18mL를 흡입하세요. 주사기 #1을 측면 루어 락 포트의 3방향 탭에 연결하세요. 정확한 부피를 평가하기 위해, 총 20mL 혼합물 중 18mL의 마취 가스가 가스 비율의 90%를 제공합니다. 이는 원하는 최종 가스 비율에 따라 변경할 수 있습니다.
11. 플런저를 주입 펌프의 수동 옵션으로 20mL 라인으로 다시 옮기세요.
12. 스톱콕을 돌려 마노미터와 주사기 #2를 연결하세요. 보통 마노미터는 마취제 충전 후 ~-3 kPa 압력을 표시합니다.
13. 플런저를 자동으로 움직이고, 속도와 시간 설정을 80 mm/s와 38초로 설정하세요. 펌프는 38초 만에 배럴의 5mL bar에 도달할 것으로 예상됩니다. 플런저가 멈추면 최대 압력은 ~200 kPa여야 합니다.
14. 플런저를 5mL 위치에 20초간 두세요. 최대 압력을 주목하세요.
15. 주사기를 두드려 플런저에 달라붙은 파리를 떼어내어 바닥에 움직이지 않게 하세요.
16. 20초 말에 자동 감압을 시작하세요. 플런저가 20mL 바에 다시 닿으면 실험을 종료하세요. 누수 제어의 최종 압력을 주목하세요.

5. 데이터 분석

참고: 이 실험에서는 마취 출현을 최종 평가 지점으로 사용했습니다. 플라이 움직임은 플런저 감압 시작 시점부터 정량화되었다. 픽셀 분석과 플라이 트래킹이라는 두 가지 분석 방법이 개발되었습니다. 각 분석 방법마다 단점이 있었으며, 이는 토론에서 설명됩니다.

1. 픽셀 분석
   1. ScreenFlow를 사용해 영상을 편집하세요. 각 비디오를 관심 영역(ROI), 즉 주사기 배럴의 첫 5mL로 자릅니다.
   2. 영상을 주사기 감압 후 처음 20초로 잘라주세요. 편집된 영상을 GIF로 내보내세요. GIF를 복제하세요.
   3. 피지를 사용하면, 한 복제본에서 첫 번째 프레임을 제거하고, 다른 복제본에서 마지막 프레임을 제거하세요. 이를 위해서는 이미지 > 비디오 편집> 프레임 삭제를 선택하세요.
   4. 피지의 각 GIF 바이너리를 만들어서 파리가 검은 배경에 흰색으로 보이도록 하세요. 이를 위해 프로세스 > 바이너리 > 만들기를 선택하세요.
   5. 피지에서 두 GIF 모두 열어보세요. GIF 간 픽셀 차이를 계산하세요. 이를 위해서는 이미지 계산기 프로세스> 선택하세요. 이 작업은 픽셀 차이 GIF를 생성합니다.
   6. 픽셀 차이 GIF를 저장하세요. 다양한 GIF에서 입자를 분석하세요. 이를 위해 '피지의 입자 분석' > '분석 '을 선택하세요. 픽셀 크기 임계값을 조정하여 신호 대 잡음비를 높이세요.
   7. 입자를 분석한 후, 피지는 프레임당 픽셀 차이가 있는 CSV를 출력합니다. CSV를 아껴두세요. CSV 데이터를 사용해 프레임당 이동 현상을 도표할 수 있습니다. 프레임을 누적적으로 이동시켜 실험 간 통계적 차이를 부여하세요.
2. 플라이 트래킹
   참고: 파리 추적 방법에서는 AI 기술을 활용해 실험 영상에서 각 파리의 무게중심을 감지하고 추적했습니다. 이를 위해 두 가지 모델이 결합되었습니다: 탐지용으로 YOLO(You Only Look Once)와 추적을 위한 MASA(Matching Anything by Segmenting Anything)입니다. 모델들은 테슬라 T4 GPU를 사용해 구글 콜랩에서 실행되었습니다.
   1. Colab에 Ultralytics YOLO 라이브러리를 설치한 후 yolo11n.pt 모델을 불러오세요. CVAT(컴퓨터 비전 주석 도구)를 사용해 영상에서 추출한 프레임에 파리를 주석 달고, YOLO 형식으로 데이터셋을 내보내 학습을 하세요. 상세한 설치 및 교육 절차는 온라인 저장소에 설명되어 있습니다.
   2. 구글 콜라프에 MASA 저장소를 설치하고 칼만 필터를 적용해 연속된 프레임에 걸쳐 객체 추적을 수행하세요. 훈련된 YOLO 탐지 모델을 MASA 추적 프레임워크와 통합하세요.
   3. FixTrack을 사용해 MASA+YOLO 파이프라인이 결합된 트랙렛을 수동으로 검토하세요. 잘못 조각난 트랙렛이나 정체성 불일치를 식별하고 합쳐 개별 파리의 연속적인 궤적을 얻습니다. 자세한 설치 및 교육 절차는 FixTrack 저장소에 설명되어 있습니다.

결과

이 논문에서 설명한 방법은 고압 조건에서 비행체의 운동 활동 시기와 범위를 모두 모니터링할 수 있게 합니다. 이 구성은 정상 조건에서 마취 특성을 갖지 않는 제논과 아산화질소 같은 가스가 초 파리 멜라노가스터에서 마취를 생성할 수 있게 합니다. 이를 입증하기 위해 우리는 다양한 농도의 제논과 공기를 실험했습니다. 우리는 90% 제논, 10% 공기로 공정을 확립하기 시작했습니다. 그 후 마취 가스 양을 5% 증가하거나 감소시에 측정한 차이를 비교하여 방법론의 민감도를 입증했습니다. 그림 1 은 90% 제논 마취 프로토콜을 보여줍니다.

그림 1

토론

이 간단하고 저비용의 장비 덕분에 초파리에서 고압 행동 검사를 널리 접근할 수 있게 되어, 특수 압력 용기 없이도 빠르고 재현 가능한 실험이 가능해졌습니다. 하지만 몇 가지 한계가 있습니다. 중요한 타협점 중 하나는 기존 설비에 비해 최대 압력이 낮다는 점입니다. 이 설정으로 유도할 수 있는 최대 압력은 ~4기압이며, 초파리에 사용되는 압력 용기는 그 두 배에 달하는 것으로 보고되며, 쥐용 시스템은 최대 100기압까지 도달할 수 있습니다. 이러한 고압 용기의 단점은 종종 비용이 많이 들고 노동 집약적이며 대량의 가스가 필요하다는 점입니다.

방법 개발 과정에서 두 가지 주요 과제가 있었습니다; 첫 번째는 주사기 안에서 몇 분간 고압을 유지하는 것이었습니다. 특히 설정값이 높을 때 압력 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
밀폐 가스 백 (0.5L)	테킨스트로	7440440
카메라	애플	아이폰 15
이중 와이어 스프링 호스 클램프	출처 지도	a24120200ux2109
초파리 먹이 혼합물	고급 농장	DM900
초파리 멜라노가스터	다윈 생물학	LZ-210
주입관	아이토서를레아	B09M8G5BQ8
LED 조명 테이블	라이리	M1-3878368
마노미터	드와이어오메가	477AV-8
금속 3방향 압축 너트 스톱콕	시그마 올드리치	Z182184
폴리카보네이트 주사기 (20 mL)	DMC 메디컬	FD-1031NS
폴리프로필렌 주사기 (20 mL)	BD	301031
실리콘 튜빙
제논 가스	청두 태유 산업 가스