무성 양서류 배아과(Rorippa aquatica)의 재생 기반 아그로박테리움 매개 효율적인 변형

요약

우리는 자원 집약적 멸균 조직 배양 절차 없이 무성 양서류 배두과(Brassicaceae) 종인 Rorippa aquatica의 아그로박테리움 매개 변환을 위한 효율적이고 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 시각적 변형 마커와 새싹 재생 파이프라인을 활용해 거의 클론 변환체에 가까운 변환체를 성공적으로 생성하여 식물의 수중 환경에 적응하는 미래 연구를 진전시켰습니다.

초록

아그로박테리움 투메파시엔스에 의해 매개되는 식물의 안정적인 유전적 변형은 기초 식물생물학 연구와 작물 개선에 직접적인 영향을 미치는 식물 생명공학에 강력한 도구였습니다. 애기장대의 꽃 담근 방법과 같은 간단하고 효과적인 변형 파이프라인은 유전자 기능의 대규모 분석을 획기적으로 발전시켰습니다. 하지만 이러한 파이프라인은 성적 생식을 하지 않는 식물 종에는 적용할 수 없습니다. 로리파 아쿠아티카는 육상 또는 수중 환경에서 잎과 식물의 이종적이고 극적인 변화를 보이는 양서류 배추과(Brassicaceae) 모델 종입니다. R. aquatica는 전적으로 영양 번식만 합니다. 여기서 제시된 최적화된 파이프라인은 무균 조직 배양이 필요 없는 효율적이고 신뢰할 수 있는 아그로박테리움 매개 R. aquatica 형질전환을 제공합니다. 잎 삽목은 변환 버퍼에 부유된 아그로박테리움에 잠시 담가며, 이 매개체는 구성 프로모터 아래에 시각적 표지인 RUBY를 발현합니다. 그 후 접종제는 물에 적신 여과지 위에서 성장실에서 배양됩니다. 그 후 RUBY 붉은 색소가 있는 재생 식물을 분리하여 흙에 분갈이합니다. 초기 T1 재생제(R1-T1)는 빨간색 구역을 발현합니다. 빨간 구역을 제거하고 재생 단계를 반복함으로써, 다음 R2-T1 세대에서 많은 형질전환 형제가 생성되며, 이 중 일부는 거의 균일하게 붉은색을 띱니다; 이는 RUBY 발현을 나타냅니다. 이 간단한 변형 파이프라인은 R. aquatica 및 아마도 다른 영양 번식 식물종에 적용되어 관심 있는 유전자를 도입하여 육상 적응과 적응 기능을 연구할 수 있습니다. 수중 환경.

서론

안정적인 유전적 변형, 즉 특정 식물 종에 관심 있는 유전자를 도입하고 발현하는 것은 기초 식물 과학과 식물 생명공학의 핵심입니다. 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 변형은 안정적인 형질전환체를 신뢰성 있게 생성하기 위해 식물 유전공학 중 가장 널리 사용되는 수단입니다^. T-DNA 클로닝 벡터와 해제된 vir 보조 플라스미드를 두 개체로 분리하는 이진 벡터 시스템의 개발은 아그로박테리움 매개 변형 ^1,2에 혁신을 가져왔습니다. 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 경우, 간단하고 비용 효율적인 꽃 담근 변형 절차를 통해 기능유전학과 유전체학을 위한 클론(헤미지고스) 형질전환체를 고처리량으로 생성할 수 있었습니다 ^3,4. 하지만 주로 또는 전적으로 무성으로 번식하는 식물 종에는 이러한 접근법이 현실적이지 않습니다.

양서류 식물은 육상과 수중(수중) 환경 모두에서 번성할 수 있는 독특한 능력을 보입니다⁵. 로리파 아쿠아티카는 양서류인 브라시카과(Brassicaceae) 종으로, 이종 식물을 보입니다. 육상 환경에서 R. aquatica는 표면이 포장 세포와 기공으로 이루어진 둥근 잎을 발달시킵니다. 반면, 수생 잎은 수중 환경에 잘 적응한 형태를 보인다: 표면에는 절단된 포장 세포나 기공이 없는 매우 해부된 바늘잎 모양의 잎 ^6,7. 계통수학적으로 R. aquatica는 Arabidopsis thaliana 와 밀접한 관련이 있으며;두 과는 같은 과인 Brassicaceae⁶에 속합니다. 전체 유전체 서열 데이터와 R. aquatica와 A. thaliana 간 암호화 유전자의 높은 서열 보존과 함께, R. aquatica는 육지와 수역에 적응하는 분자 기초를 연구하는 신흥 양서류 모델 식물로 자리 잡고 있습니다^. 실제로 최근 생리학 및 유전자 발현 연구들은 빛과 호르몬 신호 전달 경로의 재배선이 R. aquatica ^7,8의 이종 성에 매우 중요함을 시사합니다.

후보 유전자와 경로의 분자 기능을 검증하기 위해서는 유전적 변형이 절대적으로 필요합니다. R. aquatica는 자연에서 영양 번식을 합니다 ^8,9. 따라서 Agrobacterium floral dip 변환은 R. aquatica에 적용할 수 없습니다. 놀랍게도 R. aquatica는 식물성 호르몬의 외부 보충 없이도 떨어진 잎에서 전체 식물을 쉽게 재생시킵니다¹⁰. 간단히 말해, 잎 조각이 떨어진 후 며칠 내에 절단면의 근위 혈관 조직에서 세포 증식이 활발해집니다. 일주일 이내에 뿌리와 새순 모두 재생하여 결국 어린 소생(로제트 소식)을 만듭니다. 개별 식물은 분리하여 성숙할 때까지 재배할 수 있습니다¹⁰. 이 자발적인 전체 식물 재생 과정은 R. aquatica의 유전적 변형에 쉽게 활용될 수 있습니다.

여기서 보고한 최적화된 파이프라인은 잎 분리 후 자발 재생 능력을 활용하여 R. aquatica의 효율적이고 신뢰할 수 있는 전환을 가능하게 합니다. 비용이 많이 드는 멸균 배양 과정을 필요로 하지 않고, 비침습적 시각 선택 마커인 RUBY가 채택되었는데, 이는 베탈레인¹¹의 생합성으로 이어지는 세 유전자를 가진 합성 벡터입니다. 박테리아 배양 조건, 접종 단계 및 잎 삽목의 재생 배양 과정을 최적화함으로써, 신뢰성 있게 형질전환 가능한 R. aquatica 식물을 성숙시킬 수 있었습니다. R1-T1 세대의 초기 변형체 거의 대부분은 붉은 부위를 보이며, 이는 이들이 이질적인 유전적 모자이크임을 나타냅니다. RUBY+ 붉은 잎 부위를 잘라내고 재생 과정을 반복함으로써, 이후 R2-T1 세대에서 완전히 붉은 로제트 식물, 즉 거의 클론에 가까운 R. aquatica 변형 식물이 생성될 수 있습니다. 이 형질전환 파이프라인은 관심 있는 외래 유전자를 R. aquatica에 도입/발현하는 데 쉽게 적용할 수 있어, 이종 유전자와 극한 환경에 대한 식물 적응에 대한 분자유전학 연구를 가속화할 수 있습니다.

프로토콜

시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 식물 재료 준비

1. 두 달 된 성숙한 어미 식물에서 완전히 갈라진 건강한 잎을 1-2cm 조각으로 절단합니다(그림 1A).
2. 식물 번식 트레이(20 x 30cm 퍼마 네스트 트레이)에 오토클레이드 접힌 종이 타월 두 겹을 깔아두세요. 종이 타월에 멸균된 물로 적셔서 얇은 물층이 쌓이게 하세요.
3. 각 이식 부위 주변에 겹치지 않도록 절삭을 업사이드 사이드로 배치하세요(그림 1A).
4. 가지에는 가볍게 분무를 하고 쟁반을 비닐 랩으로 단단히 덮으세요.
5. 트레이를 성장실에 25°C에서 28°C까지 두고, 습한 조건에서 16시간의 빛과 8시간의 어두운 시간을 가진, 50 μmol/^{m 2}/s의 빛 강도로 둡니다.
6. 일주일에 2-3번 깨끗하고 습한 번식 트레이를 점검하고 유지하세요.
   1. 멸균수를 넣어 포화 종이 타월 위에 얇은 물층을 유지하세요.
   2. 접착력이 떨어졌거나 오염 징후(예: 눈에 띄는 물 탁도)가 있는 랩을 교체하세요.
7. 마이크로 가위나 메스를 사용해, 정착 후 14일에서 21일 사이에 새싹과 뿌리가 모두 있는 재생된 건강한 로제트 식물을 신중하게 절제합니다(그림 1B).
   참고: 새싹과 뿌리가 온전한 단일 로제트 식물을 얻기 위해서는 신중한 절제가 필요합니다. 로리파 로제트 식물은 잎 외곽과 중갈맥이 만나는 교차부를 따라 밀집하여 개별 로제트 식물 식별을 복잡하게 만듭니다. 로제트 식물의 새순은 근방향으로 자라지만, 뿌리는 잎 표면 아래에서 자라기 때문에 전체 로제트 식물의 시야가 어렵습니다(그림 1B).
8. 개별 로제트 식물을 습한 토양 배지(분갈용 혼합물: 버밀큘라이트: 펄라이트 비율 2:1:1)와 서방형 비료가 포함된 화분에 이식합니다(그림 1B).
9. 수돗물에 0.25g/L 입자 NPK 비료를 첨가한 물, 습도 돔이나 랩으로 덮어 습도를 유지하세요.
10. 트레이를 성장실에 이전 조건(25°C-28°C, 16시간 빛, 8시간 어둠, 습한 조건, 50 μmol/^{m 2}/s 빛 강도) 하에 배치합니다
    참고: 습한 토양 상태를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 화분 심은 식물 아래에 얇은 물층을 유지하세요.

2. 형질전환을 위한 농박테리움 배양

1. 스트릭 A. 투메파시엔스는 30 mL LB 플레이트에 리팜피신(0.03 mg/mL), 겐타마이신(0.025 mg/mL), 스펙티노마이신(0.05 mg/mL)이 들어 있는 Ti-플라스미드 pMP90(pTiC58DT-DNA)을 보유한 GV3101 균주를 가지고 있으며, 28°C에서 48-72시간 동안 단일 군집이 나타날 때까지 증육합니다.
2. 단일 군집을 선택하여 5mL의 MG/L 육수를 비오틴과 선별 항생제로 개량한 채 접종하고(표 1), 28°C 회전 셰이커에서 200rpm 속도로 16시간 배양합니다.
3. 접종물을 250 MG/L 육수가 담긴 원뿔형 플라스크에 옮기고, 28°C 회전 셰이커에서 200rpm으로 16시간 배양합니다.
4. 분광광도계를 사용해 액체 배양 온도가 최소_{OD 600} 또는 1.2를 갖도록 하세요. 박테리아를 3396 x g 에서 원심분리하여 실온(약 22 °C)에서 10분간 박테리아를 펠릿으로 흡수합니다. 접종 육수에 200 μM 아세토시린곤(AS)을 첨가합니다.
   참고: 필터 멸균 AS의 알리코트는 DMSO에서 100 mM 작업 농도로 준비되어 -20 °C에서 보관됩니다. 접종 육수는 신선하게 만들어야 합니다. 원심분리 단계 직전에 분해를 최소화하기 위해 AS가 첨가됩니다. 미디어 설명과 구성 요소는 표 1에 나열되어 있습니다.
5. 박테리아 펠릿이 직접 교란되지 않도록 상원액을 버리고 펠릿을 접종 육수에 재현탁합니다.
6. 플라스크를 손으로 돌려 약 0.8의 OD₆₀₀ 이 되도록 합니다.
7. 접종 물질을 상온(약 22°C)에서 90rpm 속도로 2.5시간 동안 배양합니다.
8. 관련 조건(배양 및 접종 OD₆₀₀, AS 농도 및 계면활성제 양, 접종 기간, 형상 변환 효율에 필요한 실험 단위 수)을 기록합니다.
   참고: 최적의 박테리아 및 현탁 배양 농도는 과도한 박테리아 증식을 최소화하면서 형질전환 효율을 극대화하는 데 필수적입니다. 원심분리 전에 박테리아 배양액의 최소 OD600이 1.2임을 확인하고; 접종 OD600 0.8로 재현탁. 유도 육수에 대한 수정은 재생 생존력을 저해하지 않으면서 변형을 촉진하도록 최적화됩니다. 권장 농도는 AS는 150-225 μM, 계면활성제는 0.005%입니다.
   주의: 모든 형질전환 박테리아와 식물은 지정된 생물학적 위험 폐기물 용기에 폐기하십시오.

3. R. aquatica 잎 삽목의 변형

1. 접종 재현탁 배양이 부화 중이면, 건강한 잎과 완전한 가장자리를 가진 2개월 된 여러 대나무 식물을 선별하세요.
2. 2겹의 고출력 종이 타월로 식물 번식 트레이(20 x 30cm 퍼마 둥지 트레이)를 준비하세요. 종이 타월을 접으세요. 종이 타월에 멸균된 물로 적셔서 얇은 물층이 쌓이게 하세요.
   참고: 예방접종되지 않은 식물들이 동일한 환경 조건을 겪는 음성 대조 트레이를 설정하세요.
3. 실험실 작업대에는 100-500 mL ddH_2O, 예상 재현탁 접종량에 적합한 멸균 용기, 마이크로피펫, 팁이 갖추어져 있는지 확인하세요.
4. 부화 단계가 끝나기 전에, 선택한 가축 식물의 잎자루 밑부분에서 10개의 잎을 빠르게 잘라내세요. 엑스플랜트를 멸균된 물이 담긴 페트리 접시에 넣으세요.
   참고: 잎 접종을 위해 신선한 절제 조직을 사용하는 것이 잎 건조를 방지하는 데 매우 중요합니다.
5. 2.5시간 후, 50 μL 계면활성제를 1L 부탁액(계면활성제 농도0.005%)에 피펫 넣고 부드럽게 돌려 플라스크를 섞습니다(그림 2A). 접종 후 발목을 놓을 수 있도록 번식 트레이가 접근 가능하도록 하세요(그림 2B).
6. 잎의 배쪽 면을 위로 올리고 메스로 중앙갈기를 따라 1cm 길이의 조각으로 자릅니다(그림 2C).
7. 즉시 새로 잘라낸 잎을 회전 튜브 믹서에 적합한 50mL 튜브에 넣어 접종 제거 식물로 사용하세요.
8. 감염 물질을 추출 튜브에 일정 용량으로 부어 모든 재료를 포화시키고, 그 후 로터리 믹서에서 실온에서 10분간 교반하여 접종을 합니다(그림 2D,E).
9. 접종된 잎은 모두 겸자로 용액에서 제거하여 준비된 번식 트레이에 직접 놓으세요.
10. 적신 엑플랜트를 분리하여 적셔서 포화 종이 타월 위의 얇은 물층에 부분적으로는 담그지 않고 뿌리세요(그림 2F).
    주의: 무균 상태를 유지하고 아 그로박테리움 시술 중 사용되는 표면이나 도구와의 접촉을 피해야 합니다.
11. 각 트레이를 랩으로 밀봉하고, 상온(22°C) 어두운 환경에서 3일간 배양하세요.
12. 암기 기간이 끝나면 트레이를 투명 랩으로 밀봉하고, 수분 수준을 유지하기 위해 ddH_2O로 트레이를 수정하세요.
13. 접종 트레이를 영양 번식 조건의 성장실로 옮기세요.
    주의: 접종 폐기물을 폐기물에 통합하고, 10% 표백제 용액으로 처리한 후 생물안전 지침에 따라 폐기하세요.

4. 장미 소식의 재생과 R1-T1 세대의 확립

1. 접종 트레이를 주 2-3회 점검하여 깨끗하고 습한 상태를 확인하세요.
   1. 짜는 병을 사용해 ddH_2O를 추가하세요. 가능하다면 트레이를 다시 밀봉하기 전에 분무기로 분무를 하세요.
   2. 접착력이 떨어졌거나 오염 징후가 보이는 플라스틱 랩(예: 눈에 띄는 물 탁도)은 교체하여 높은 습도를 유지하세요.
2. 재생된 로제트 식물의 이식 적합성 특성을 육안으로 점검하세요. 이상적인 재생 물질은 최소 2-3mm 길이의 여러 잎과 뿌리를 가진 온전한 새순을 보입니다(그림 2G).
   참고: 형질전환 로제트 식물은 일반적으로 재생 속도가 더 느리며, 성장실에 넣은 지 21-28일 이내에 이식 적합성을 갖춥니다.
3. WT 클론 재생균과 동일한 조건에서 온전한 형질전환 로제트 식물을 절단하고 이식합니다.
4. (선택 사항) 재생된 변형체의 수를 기록하고, 그 변환 조건과 연관하여 효율성을 평가합니다.
   참고: 선택 시 각별히 주의하세요. 형질전환 재생체는 종종 작고 쉽게 간과됩니다. 수율을 극대화하고 손상을 최소화하기 위해 겸자로 아드액시얼과 아브액시얼 잎 표면을 모두 꼼꼼히 점검하세요.
5. 로제트 식물을 제거하되, 유전자 변형 잎은 만지지 않도록 하세요. 형질전환 잎 주변의 과잉 잎사귀를 다듬으세요. 화분당 한 그루씩 심으세요.
6. 각 식물에 빠르게 비료를 주고, 물을 주고, 분무한 뒤 습도를 유지하기 위해 플라스틱 돔 아래에 두세요(그림 2G,H).
7. 각 형질전환 묘목을 라벨링하고 기록하세요.
8. 새싹이나 뿌리가 없거나 번식 트레이에 이식하기 어려워 보이는 변형체가 포함된 이식 식물을 반환하여 추가 선별을 위해 이식할 수 없습니다. 성장이 충분하면 추가 형질변환체를 이식합니다.
9. 첫 주에는 매일 안개와 수분 이식을 하세요. 쟁반에 항상 물이 있어야 합니다.
10. 노화되었거나 더 이상 RUBY 색소 발현이 보이지 않는 이식 식물은 제거하여 폐기하세요.
    주의: 모든 형질전환 물질은 기관 생물안전 규정에 따라 폐기해야 합니다.

5. 이후 재생 및 근클론 R2-T1 생성의 확립

1. 로제트 소식이 크고 건강한 식물로 자라면(2개월), 한 묘목에서 확장된 RUBY를 발현한 잎을 제거한다(그림 2H).
   참고: 루비를 표현하는 잎은 균일하게 붉게 보일 수 있지만, 더 흔히 키메라입니다. 두 표현형 모두 전파에 적합합니다. 다음 단계에서는 표준 식물 번식 방법을 사용하세요.
2. 변형된 잎 조각을 나누어 번식 쟁반에 넣으세요. 각 번식 트레이에는 해당 묘목 기증자 ID를 명확히 표시하세요.
   주의: 여러 묘목의 잎을 같은 트레이에 섞지 마세요. 각 묘목은 고유한 유전자 변형 사건을 나타내며, 별도의 세대로 추적되어야 합니다.
3. 이식 후 14-28일 후의 재생된 R2-T1 식물. 각 식물에 두 번째 상태를 반영하는 새로운 식별자를 할당하세요. 앞서 설명한 대로 이식 후 표준 치료를 계속합니다(그림 2I,J).

결과

A. tumefaciens 변형의 매개변수는 RUBY를 발현하는 형질전환 식물인 R. aquatica 식물을 성공적으로 생산하도록 최적화되었으며, 불임 제한을 우회하고 빠른 무성 재생 속도를 활용했습니다(그림 1 및 그림 2). 잎 조각 제거 식물을 접종하고 이후 72시간 암처리를 한 후, 재생된 식물들은 설명된 조건 하에서 2주 이내에 자라기 시작했습니다. 이식이 가능할 만큼 큰 키메라 RUBY 부위를 가진 재생된 소식은 접종 후 3-5주 사이에 발견되었으며(그림 3), 발현되지 않은 로제트 소식보다 다소 작았다. 대조군 야생형 트레이에서는 RUBY 재생된 식물이 발견되지 않아 이 현상이 R. aquatica의 생리학과는 다르다는 것을 확인했다. 박테리아 배양 육수, 재현탁 접종 육수, 침윤 방법, 접종 기간은 변환체 생성 능력이나 속도에서 유의미한 차이가 없었습니다(표 2 및 표 3). 전환 효율에 긍정적인 영향을 준 처리 인자로는 잎 제거 접종 전 AS 농도 증가와 옥신 노출 처리가 포함되었습니다. 계면활성제 농도가 증가하면 수율에 부정적인 영향을 미쳐 적합하지 않다고 판단되었습니다.

R 버전 4.4.2^{12, 13, 14, 15}는 로제트 식물 개체수 데이터에 대한 포아송 일반 선형 혼합 모델(Poisson GLMM) 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. 그러나 실험 D(표 2D)에서는 RUBY가 발현된 재생제를 15분 접종에 150 μM AS 또는 225 μM AS로 수정하여 검사했으나, 분산 부족으로 인한 가정을 위반하여 대신 음성 이항 GLMM이 적용되었습니다.

다양한 박테리아 육수와 배양 조건이 형질전환 효율에 미치는 영향을 면밀히 조사하였다. 다섯 번의 실험 복제 중 Miller의 LB 육수 또는 형질전환 특이적 MG/L 육수를 사용했을 때, 거의 동일한 매개변수에서 RUBY 를 발현하는 형질전환체가 나타났으며, 효과에는 큰 차이가 없었다(표 2A). 개별 잎 조각에서 재생된 로제트 식물을 발현한 RUBY 방법은 각 처리당 15-60개의 엑스플랜트로 구성되었으며, LB 및 비MS 기반 재현탁액을 사용한 실험에서 생성된 재생물질이 1.61± 0.71 양(대조 유도 육수, 표 1)에서 MG/L 및 최적화 유도 육수를 사용한 실험에서 생성된 재생 물질이 3.23 ± 1.13 양 사이였습니다. 주관적 관찰로 인해 유의미한 차이가 없었음에도 불구하고, MG/L 배양과 최적화된 유도 육수(표 1)가 향후 최적화 실험을 위해 선정되었습니다.

다음으로, 박테리아 부하와 분열조직 식물 조직에 접근하는 능력에 영향을 미치는 요인들을 테스트했습니다. 8개의 복제(표 2B) 중에서, 계면활성제 농도가 0.01% 증가한 접종 제거 식물은 한 달 후 극심한 스트레스를 보여 작고 대부분 생존 불가능한 재생체가 나타났습니다. 복제체들 중에는 재생된 변형체가 없었으나, 추출 식물의 스트레스 재생 표현형은 자주색, 갈색, 노란색 색소였으므로 잠재적 변형체가 있었을 가능성이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 재생제의 생존 가능성은 0.005% 계면활성제 농도를 유지하는 것이 정당화되었다.

원하는 DNA를 숙주 식물에 주입하는 두 가지 기전적 기법인 교반 또는 진공 침투 기법이 비교되었다. 대조군 침투법은 50mL의 재현탁 접종액에 엑스플랜트를 담근 후 튜브 믹서에서 회전시키는 방식으로, 나열된 처리법에서 루비 발현 재생 물질을 성공적으로 생산하였습니다. 진공 침투를 적용하면 RUBY가 발현된 재생 물질도 생성되었으나, 대조 방법과 비교해 변환 효율은 차이가 없었습니다(p = 0.478, 표 2D). 진공 침투 또는 물리적 교반을 통해 접종된 경우, 전파 트레이당 약 2-5개의 루비 발현 재생 물질이 관찰되었습니다.

수정된 세균 접종물의 아세토시린온(AS) 농도는 형질 효율에 미치는 영향이 명확히 달랐다. AS 농도를 150 μM에서 225 μM로 증가시키면 RUBY 발현 형질전환 식물의 생산이 크게 향상되었습니다(p = 0.000309, 0.000458; 표 3C, D). 네 가지 실험 중 각 치료는 40개의 동일하게 처리된 접종된 엑스플랜트가 담긴 트레이로 구성되었습니다. 높은 농도로 접종된 경우, 대조군 AS 트레이당 1개에 비해 평균 거의 5개의 RUBY 발현 재생제가 나타났습니다(표 3C). 더불어, AS 효과는 접종 기간과는 별개로 보였습니다.

15분 접종 기간을 가진 세 실험 중 225 μM AS로 수정된 엑스플랜트를 포함하여, 평균 7.28 ± 4.13 RUBY 발현 재생제가 발견되었으며, 이는 150 μM 처리의 2.03 ± 1.32 재생률보다 명확히 높았습니다(표 3D). 150 μM AS 대조 처리(p = 0.676)에서는 평균 10분 접종률이 1.48 ± 0.954인 반면, 15분 접종 중 재생 물질은 1.84± 1.230명에 비해 시간 간격에 명확한 영향이 나타나지 않았습니다(표 3B). 마찬가지로, 10분 225 μM 처리된 접종제는 한 처리당 약 5개의 RUBY 발현 로제트 소식을 재생했으며, 이는 15분 접종제 처리에서 트레이에 6-7개의 재생 물질이 필요하다는 점과 명확한 차이가 없었습니다(표 3A).

또한, 식물 재생을 돕는 식물 호르몬 옥신도 시험되었습니다. 접종 전에 갓 절단된 잎 조각을 펄스 옥신 처리에 노출시켰을 때, ddH₂O에 비해 RUBY 재생이 명확히 증가하는 긍정적인 효과가 나타났습니다(p = 0.00969, 표 2C). 285 μM 인돌-3-아세트산(IAA)을 첨가한 ddH_2.0에 배치했을 때, 추출 플랜트는 1회 처리당 평균 6.67 ± 1.490 변환율을 보였으며, 이는 옥신 없는 처리의 평균 재생률 2.00± 0.816의 재생률을 보였습니다.

즉시 재생된 형질전환 계통은 R1-T1 세대(그림 2)로 지정되었으며, 개별 재생 계통이 계통으로 지정되었습니다. 초기 R1-T1 로제트 식물들은 다양한 키메라 패턴을 가진 키메라 잎 형태로 RUBY 를 표현했습니다. 가장 흔한 경우, 1-3개의 작은 식물 잎이 RUBY가 발현된 조직과 발현되지 않은 조직이 중앙갈리브에서 갈라지는 뚜렷한 키메라를 발현합니다. 1개월 된 R1-T1 묘목의 대부분은 키메라 발현을 유지했으나(그림 3A), 완전히 RUBY를 발현하는 묘목은 소수로 발견되었습니다.

R1-T1 묘목잎 조각에서 무성생식으로 증식한 루비 색소 키메라 부위(그림 3B)는 절제 후 2-4주 이내에 완전 RUBY나 키메라 R1-T1 로제트 소생을 재생했습니다(그림 3C). 한 달 후, 대부분의 R2-T1 묘목은 주로 RUBY색 잎을 보였으며, 일부는 미발현 키메라 영역이 소규모로 나타났습니다(그림 3D,E).

그림 1: 식생 번식 프로토콜 및 연대표. 대표적인 이미지들은 무성 로제트 식물 재생에 사용되는 생산 파이프라인을 보여줍니다. (A) 이미 자리 잡은 어미 식물에서 성숙하고 건강한 통째 갈래잎을 뽑아 2-3조각으로 잘라낸다. (B) 발산식물을 번식 트레이에 배치하고 지정된 조건 하에서 유지합니다. 3주 후, 로제트 식물을 제거하여 토양 매체에 이식했습니다. 아래는 어머니 잎 절단에 아직 붙어 있는 재생된 로제트(분홍색 화살표)의 실제 사진입니다. 이 소식들은 이식에 최적의 단계에 있습니다. 스케일 바: 10 mm. 이 도형의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: R. aquatica 잎 절단의 변형 및 RUBY 전사체를 발현하는 변형체의 재생. 변형 재생 물질의 변형 절차와 생성에 대한 그래픽 개요. (A) 박테리아 접종 확보. (B) 멸균 필터지와 물을 이용한 번식 트레이 준비. (C) 잎을 잘라내는 작업. (D) 식재료에 익스플랜트를 담그는 것. (E) 회전 믹서에서 1분당 20r, 10분 교반. (F) 포화된 외부 식물을 트레이에 퍼뜨리고 플라스틱 돔으로 덮고, 어두운 환경에서 72시간 배양. (G,H) 1개월 후, 아그로박테리움에 노출된 외부 식물에서 온전한 변형 재생 물질을 제거하고 이식하여 성숙한 식물을 확립합니다. (I,J) 전파 단계(G,H)를 반복하여 거의 클론에 가까운 R2-T1 생성을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: RUBY 형질전환 계통의 무성 전파 세대. (A) RUBY 를 발현한 키메라 잎을 보이는 성숙한 R1-T1 묘목. 스케일 바: 1 cm. (B) 3개월 된 묘목에서 번식 트레이에 갓 배치된 20개의 제거 식물 중 2개가 (A)에 나타난 모종입니다. 외곽 식물들은 중앙맥에서 분리된 루비의 키메라 무늬를 보인다. 스케일 바: 1 cm. (C) 이식 전 절제 1개월 후 키메라 RUBY 발현 정도가 다양한 재생된 R2-T1 로제트 식물. 재생된 RUBY 양성 뿌리(마론 화살). 스케일 바: 2 cm (D) R2-T1 묘목, 이식 후 1개월 후 RUBY 발현 보입니다. 스케일 바: 2 cm (E) 이식 후 3개월 후 작은 부위를 보이는 성숙한 R2-T1 묘목(녹색 화살표). 스케일 바: 2 cm. 이 피규어의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 최적화된 파이프라인의 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: 미디어 구성 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 네 가지 최적화 매개변수가 R. aquatica의 변환 효율에 미치는 영향. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 3: 접종물 아세토시린원 농도가R. aquatica의 형질전환 효율에 미치는 영향. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구에서는 무성생식만 하는 배추과(Brassicaceae) 양서류 식물인 R. aquatica의 간단하고 직접 재생 기반의 아그로박테리움 매개 안정적인 형질전환을 확립했습니다^10,16. 영양 번식 양서류 식물의 철저한 변형 파이프라인은 아직 확립되지 않았으며, R. aquatica의 실용적인 변형 가능성은 시각적 표지와 함께 활용된 바 없습니다. 특히, 이 파이프라인은 번거롭고 무균 식물 조직 배양 공정이나 특수 식물 성장 인큐베이터가 필요하지 않습니다. 따라서 이 프로토콜은 과학 연구실부터 교실에 이르기까지 다양한 실험 환경에 널리 적용될 수 있습니다.

시험된 다양한 접종 및 배양 조건 중 몇 가지 요인이 형질 전환 효율을 크게 향상시켰습니다. 특히, 약간 더 높은 아세토시린온(AS) 농도와 인돌-3-아세트산(IAA) 농도가 형질전환 효율에 긍정적인 영향을 미쳤습니다(표 1 및 표 2). AS는 아그로박테리움을 끌어들이는 페놀 화합물로, 애기장대(Arabidopsis¹⁷)에서 식물 변형 효율을 향상시키는 것으로 입증되었습니다. 식물호르몬 옥신은 식물 세포 재프로그래밍에 중심적인 역할을 합니다. 상처 유도 재생 과정에서 옥신 관련 유전자 발현이 급격히 증가하는 것이 관찰되었다¹⁰. 이러한 이유로, 식물 제거 시 외부 적용된 옥신(IAA)이 재생 효율을 높일 것으로 추정할 수 있습니다. 그러나 세 차례 시험에서 관찰된 재생 식물 수에는 차이가 관찰되지 않았습니다(대조군 57 대 59.67 대 5.51). 따라서 옥신 처리는 재생 자체보다는 형질전환 과정을 돕는 역할을 할 가능성이 큽니다.

비이온성 계면활성제인 알콕실화 트리실란(Silwet L-77으로 알려짐)은 플로랄-딥 방법³을 통해 애기장대의 형질전환 효율을 크게 높여 식물 생물학계에서 널리 사용됩니다. 실웨트 L-77을 첨가한 추출 식물에서는 플로럴 딥에 권장된 농도인 0.005%에서 식물 스트레스가 거의 관찰되지 않았습니다. 이 용량을 두 배(0.01%)로 늘렸을 때, R. aquatica 잎 삽목이 심각하게 손상되어 거의 변질균이 회복되지 않았습니다(표 2B). 애기장대의 꽃 담그는 과정에서 계면활성제 사용은 접종제의 표면 장력을 낮추고 꽃봉오리에 대한 접근성을 향상시킵니다. 반면, 양서류 식물인 R. aquatica는 트리코움이나 두꺼운 큐^티클이 없는 매끄러운 잎을 발달시킵니다. 계면활성제 증가는 잎 조직에 손상을 일으켰으며, 이는 비털 잎 조직에서 전환 효율을 위해 계면활성제 이외의 요인을 우선시해야 함을 시사합니다. 계면활성제는 조직 침투를 촉진하는 음모 표현형에 더 적합합니다. 모든 테스트된 매개변수를 통합한 후, 가장 최적의 조건을 가진 파이프라인이 흐름도(그림 4)로 제공됩니다.

시각적 표지기인 RUBY의 활용은 이 변환 파이프라인에 매우 중요합니다. RUBY는 세 개의 코딩 유전자(CYP76AD1, DODA, 글루코실 트랜스퍼라제)를 암호화하는 합성 리포터로, 밝은 붉은 색소인 베탈레인¹¹을 합성합니다. R1-T1 재생체에서 RUBY 발현이 관찰되었을 때, 붉은 부위로 발현되어 키메라 형태일 가능성이 높음을 나타냈습니다(그림 2 및 그림 3). 이전 연구에 따르면 R. aquatica의 재생은 절단된 잎¹⁰부의 혈관 캠비움에서 기원한다는 것이 밝혀졌습니다. 눈에 띄게도, R1-T1 재생 물질은 가끔 중맥을 따라 키메라 경계를 보이며, 잎의 절반은 빨간색, 나머지 절반은 녹색이다(그림 3A,B). RUBY 부대에서 재생 과정에서 때때로 뿌리가 붉은 완전한 붉은 식물이 나타났으며(그림 3C, 자주색 화살표), 이 식물들은 균일한 붉은 R2-T1 식물로 성장했습니다(그림 3D). RUBY 과발현이 R. aquatica 성장 및 발달에 미치는 부작용은 관찰되지 않았습니다(그림 3). 이를 뒷받침하는 결과, RUBY 부위가 있는 R1-T1 로제트 잎의 크기와 형태에서 뚜렷한 차이는 관찰되지 않았습니다(예: 그림 3B). 강력하고 구성적인 프로모터 구동 트랜스유전자가 정상적인 식물 성장과 생리적 반응을 방해할 수 있습니다.

때때로 이 '거의 클론' RUBY 식물들은 녹색 부위(그림 3E, 녹색 화살표)를 발달시켰는데, 이는 회귀 또는 형질전환 침묵을 시사합니다. 이는 RUBY 와 같은 가시적 표지자가 향후 분자기전적 연구에서 관심 유전자의 자궁외 발현 또는 침묵(예: RNAi)에 필수적임을 의미합니다. 관심 있는 형질전환유전자를 RUBY 카세트에 도입하면 빨간색 RUBY 구역의 표현형을 관찰할 수 있습니다. 결론적으로, 잎 절단에 의해 유도되는 직접 재프로그래밍과 비침습적 가시적 표지자를 활용하여, 영양 번식하는 브라시카과인 R. aquatica에 최적화된 단순하고 효율적인 변환 파이프라인이 완성되었습니다. 이 프로토콜의 범위를 벗어나지만, 변형된 R. aquatica 의 재생 기원에 대한 미래 이해는 식물 세포 재프로그래밍에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1000 & 마이크로; L 저저 유지율 LTS 여과식 피펫 팁	레이닌	30389213
아세토시링곤	시그마-올드리치	D134406-1G
박토 효모 추출물, 기술적	피셔 사이언티브	DF0886-17-0
BD 박토 아가	피셔 사이언티브	214030
BD 디프코 LB 브로스, 밀러	미들랜드 사이언티픽	DIFCO 244610
BD 백토 탈수 트립톤	피셔 사이언티브	DF0123-17-3
비오틴 동식품 분말	시그마-올드리치	B4501-100MG
PermaNest 트레이용 클리어 돔	그로워스 솔루션	GD221
투명 랩	토마스 사이언티픽	22-305654
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에탄올, 200 프루프	피셔 사이언티브	04-355-720
팔콘 50 mL 원뿔형 원심분리기 튜브	피셔 사이언티브	14-432-22
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L-글루탐산 일나트륨 염 하이드레이트	시그마-올드리치	G1626-100G
염화마그네슘	시그마-올드리치	M8266-100G
황산마그네슘, 헵타하이드레이트	시그마-올드리치	M9546-250G
MaxQ 6000 인큐베이터 셰이커	써모 사이언티픽	SHKE6000
MES 하이드레이트	시그마-올드리치	M8250-100G
무라시게 및 스쿠그 기저염 혼합물(MS), 분말	시그마-올드리치	M5524-50L
MX-RL-pro: 로티세리 튜브 회전기	실로젝스	824222019999
미오-이노시톨	시그마-올드리치	I7508-100G
퍼시벌 성장실	퍼시벌	AR36L3
펄라이트 식재 토양 첨가제	PVP 인더스트리	PVP105408
퍼마 네스트 식물 트레이 8'''x12''	VWR 인터내셔널	470150-476
pH 미터 세븐 컴팩트 5220	메틀러 톨레도	30019028
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