방법 논문

LC-mate를 이용한 자동 HPLC 분리: 미세한 정제를 위한 통합 반복 오토샘플러 및 분획 수집기

DOI:

10.3791/69685

⸱

2026년 2월 27일

 , 
1Natural Product Research Center, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

반복적인 HPLC 분리를 자동화하기 위해 통합 오토샘플러 및 분획 수집기(LC-mate)가 개발되었습니다. 아날로그 신호를 출력하는 HPLC 검출기와 호환되는 LC-mate는 수동 조작 시스템의 성능을 향상시키고 고성능 액체 크로마토그래피에 의존하는 연구 워크플로우를 가속화합니다.

초록

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고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 고부가 화합물 정제에 중요한 역할을 하며, 학술 및 산업 환경에서 화학 및 생물학 분야의 증가하는 요구를 충족합니다. 그러나 미세한 정제 중 반복적인 수동 주입과 분획 수집은 효율성과 재현성을 크게 제한합니다. 이 병목 현상을 극복하기 위해, 우리는 임시로 LC-mate라는 이름의 통합 오토샘플러 및 분획 수집기 시스템을 개발했으며, 이는 HPLC 검출기에서 나오는 아날로그 신호에 직접 반응하여 반복 분리를 자동화합니다. 이 기기는 시료 주입을 위한 고압 6포트 스위칭 밸브와 분획 수집을 위한 선택 밸브를 중심으로 설계되었으며, 작동 매개변수는 직관적인 터치스크린 인터페이스를 통해 제어됩니다. LC-mate는 아날로그 출력이 가능한 상업용 HPLC 검출기와 호환되며, 동기 신호 트리거를 통해 그라디언트 용출 모드의 반복적 분리도 달성할 수 있습니다. 시범 실험을 통해 자연 제품 정제를 위한 안정적인 작동과 재현 가능한 분리가 확인되었으며, 수작업 처리 시간이 명확히 줄어들었습니다. 이 시스템은 기존 HPLC 워크플로우의 자동화를 향상시키기 위한 실용적이고 접근성 높은 솔루션을 제공하며, 수동과 완전 자동화 정제 시스템 간의 간극을 메워줍니다.

서론

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크로마토그래피는 20세기 초 M.S. 츠웨트에 의해 개척되었으며, 1960년대에 1,2,3 계측기의 발전과 함께 현대 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 발전했습니다.

오늘날 HPLC는 고부가가치 화합물 정제에 중요한 역할을 하며, 학계 및 산업 분야에서 생의학, 화학, 생물학 분야의 증가하는 요구를 충족하고 있습니다. 학술 연구에서 천연물의 미세한 정제와 키랄 분자의 분해는 반준비적 HPLC 기법 4,5,6,7,8에 매우 의존합니다. 대부분의 실용적인 경우, 연구자들은 예기치 못한 샘플 손실을 방지하거나 컬럼 크기의 한계로 인해 반복적인 샘플 주입과 분획 수집이 불가피하기 때문에 샘플 용액의 일부를 전체가 아닌 한 번에 HPLC 컬럼에 주입합니다. 탁월한 분리 능력에도 불구하고, HPLC의 샘플 정제 사용은 현재 계측과 작업 흐름의 본질적 제약에 의해 제한되고 있습니다. 주요 병목 현상은 특히 샘플 주입과 분획 채취에서 수작업 개입에 대한 높은 의존도에 있습니다. 이러한 공정은 시간과 노동 집약적일 뿐만 아니라 인간의 실수로 인해 처리량, 재현성, 전반적인 운영 효율성이 저하될 수 있습니다 9,10.

애질런트, 시마즈, 워터스 등 주요 HPLC 제조사의 상업용 오토샘플러와 분획 수집기는 신뢰할 수 있고 정밀한 자동화를 제공하지만, 일반적으로 독점 하드웨어 및 소프트웨어 생태계 내에 제한됩니다. 예를 들어, Agilent 1260 Infinity II 오토샘플러와 G1364F 분획 수집기는 Agilent HPLC 시스템에 완벽하게 통합되어 우수한 재현성을 제공하지만 크로스 플랫폼 호환성은 제한적입니다. 마찬가지로 시마즈의 SIL-20A/40C 오토샘플러와 FRC-40/FRC-10A 분획 수집기도 높은 처리량과 우수한 기계적 정밀도를 제공하지만, 시마즈의 LC-20과 넥세라 제어 아키텍처에 의존합니다. Waters Alliance의 HPLC 오토샘플러 및 분획 수집기 III 모듈도 강력한 성능과 유연한 수집 포맷(최대 300 mL/min)을 제공하지만, Waters의 독점 UHPLC 및 LC-MS 환경에 맞춰져 있습니다. 또한, 주입 바늘에 의존하는 전통적인 오토샘플러는 샘플 회수를 줄일 수 있으며, 튜브 기반 분획 수집기는 대용량 용출물 처리에 불편할 수 있습니다. 대부분의 다른 HPLC 기기에서는 반준비 분리가 여전히 반복적이고 지루한 수동 조작에 의존합니다.

이러한 도전 과제는 HPLC 워크플로우에서 샘플 정제를 자동화하는 혁신적인 접근법의 필요성을 강조합니다. 이 요구를 해결하기 위해 우리는 오토샘플러와 분획 수집 모듈을 하나의 플랫폼으로 통합한 컴팩트하고 다목적 기기인 LC-mate를 개발했습니다. LC-mate의 유체 코어는 두 가지 핵심 부품으로 구성되어 있습니다: 0.4mm 유량 경로를 가진 SUS 316 스테인리스 스틸로 제작된 고압 6포트 스위칭 밸브(SKVA-3130-S)로, 정밀한 시료 주입 제어를 위한 정밀한 시료 주입 제어가 가능합니다. 그리고 10채널 다단계 선택 밸브로, 최소 데드 볼륨(포트 간 27.5 μL 성능을 특징으로 합니다) 5 μL 로터 홈)을 갖추고 1.2mm 직경의 유동 채널을 사용하여 효율적인 분획 수집을 지원합니다. 이 구성은 데드 볼륨을 최소화하고 교차 오염 위험을 줄여줍니다. 상세 계측기 사양은 표 1을 참조하십시오. LC-mate는 HPLC 검출기에서 아날로그 출력을 받아 동기 신호 로 HPLC 기기를 작동시켜 샘플 주입과 분획 수집을 독립적으로 제어할 수 있습니다.

표 1: LC-mate 관련 기기 매개변수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

이 기기는 사용자 친화적인 제어 소프트웨어와 직관적인 터치스크린 인터페이스를 갖추고 있어 아날로그 크로마토그래피 신호를 실시간으로 시각화할 수 있습니다. LC-mate는 등각 분리 모드와 그라디언트 분리 모드를 모두 지원하여, 사용자가 주입 부피, 반복 횟수, 각 주입의 간격 시간, 수집 모드 [임계값 기반, 시간 기반 또는 모두 수집(임계값 위와 아래 분수 모두 수집)]등 주요 매개변수를 설정하고, 단일 명령으로 완전 자동화 작업을 시작할 수 있습니다. 이로 인해 반복적인 수작업 개입이 필요 없어지고 HPLC 정제의 효율이 크게 향상됩니다.

그림 1 은 HPLC 시스템과 통합된 LC-mate의 전체 외관, 작동 원리 및 구성을 보여줍니다.

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그림 1: LC-mate 시스템의 설계 및 설정. (A) 회로도 배치. (B) 계기판 도면. (C) 실용 설치 사진. (D) UV 검출기와 LC-메이트 사이의 신호 전송선 연결. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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프로토콜

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1. 연결 상태 확인

  1. HPLC, LC-mate, 크로마토그래피 컬럼 간의 용매 배관 연결을 확인하여 올바른 흐름 경로를 보장합니다(그림 1A).
  2. 그림 1D에 나와 같이 UV 검출기와 LC-메이트 사이의 신호 전송선 연결을 점검하세요.
    1. 검은색 선을 빨간 단자에, 흰색 선을 검은색 단자에 연결하여 아날로그 신호 출력의 극성을 맞추세요.
    2. LC-mate 디스플레이를 관찰하세요. 아날로그 신호 파형이 나타나면 연결이 올바른 것입니다.
      참고: 파형이 보이지 않으면 연결을 반대로 하세요: 검은색 선은 검은색 단자에, 흰색 선은 빨간 단자에 연결하세요.
  3. UV 감지기와 LC-mate 사이의 트리거 연결 부분을 확인해 보세요.
    1. 데이터 케이블 한 끝을 UV 감지기 출력 포트에 꽂으세요.
    2. 반대편 끝의 검은색과 흰색 선을 각각 LC-mate의 파란색과 검은색 트리거 단자에 연결하세요.
    3. 단자와 트리거를 단단히 조여서 단단히 연결하세요.

2. 통합 분리 시스템 시작

  1. HPLC가 제대로 작동하도록 하세요.
  2. LC-mate의 적절한 시동을 확인하세요.
    1. LC-mate 시스템이 시작되면 인터페이스에서 LC-mate 아이콘을 클릭하면 시스템 자체 테스트 프로그램을 자동으로 실행하고 주요 하드웨어 모듈을 초기화합니다.
    2. 자가 테스트가 완료된 후 화면에 "Self-Testing" 프롬프트가 사라질 때까지 약 0.5초 정도 짧은 Di 프롬프트 톤이 울리고, 초기화가 완료되었음을 나타냅니다.

3. 조건 최적화

  1. HPLC 분리 조건을 설정하고 용출을 시작하여 컬럼 평형을 실현합니다.
  2. LC-mate 화면 왼쪽에 있는 테스트 아이콘을 클릭하면 다음 인터페이스가 화면에 표시됩니다(그림 2A). 입력 주입량, 용출 시간, 반복 시간 매개변수를 입력한 후 시작 아이콘을 누르세요; 오토샘플러, 분획 수집기, HPLC 가동이 시작될 것입니다. 이 경우 용출액은 선택 밸브의 10번 포트를 통해서만 흘러나가며, 수동으로 수집하거나 폐기할 수 있습니다.
  3. 해상도, 실행 시간, 보존 시간, 주입 부피, 자외선 파장 등 실현 가능한 분리 조건을 파악하여 적절한 모드에서 후속 분리 및 분획 수집을 용이하게 합니다.

4. 자동 주행

참고: 가능한 분리 조건의 크로마토그램을 바탕으로, 인터페이스 왼쪽의 임계값, 타이밍 수집, 모두 수집 옵션에서 적합한 분획 수집 방식을 선택할 수 있습니다.

  1. 임계값에 기반한 분수 수집
    1. 인터페이스 왼쪽에 있는 임계값 기능 모듈을 선택하면 시스템은 그림 2B에 나타난 매개변수 설정 인터페이스를 표시합니다.
    2. 주입량, 반복 시간, 임계값, 용출 시간을 입력한 후 시작을 누르세요; HPLC와 LC-mate는 자동으로 작동합니다. 크로마토그래피 피크가 임계값을 초과하는 분획은 다양한 수집 병에 담겨 수집됩니다.
    3. 디스플레이에 수직으로 배열된 상태 표시기를 모니터링하세요: 샘플 도입이 시작되었는지 확인하기 위해 주입 진행 중을 관찰하세요. 크로마토그래피 분리가 진행 중인지 확인하기 위해 Separation in Progress 를 확인하세요. "주사기 비우기"를 참고하여 주사기가 잔류 액체를 배출하고 있음을 식별하세요. 해당 텍스트의 파란색 강조 표시를 통해 현재 활성화된 운영 상태를 확인하세요.
      참고: 분리 과정에서 "크로마토그램" 아이콘을 누르면 새로운 인터페이스에 크로마토그램과 임계선이 표시되며, 크로마토그램은 HPLC를 제어하는 컴퓨터 화면에 표시되는 것과 동일합니다.
  2. 시기별 분수 수집
    1. 인터페이스 왼쪽에서 타이밍 수집 모듈을 선택하여 매개변수 설정 메뉴를 열으세요(그림 2C).
    2. 필요한 매개변수를 입력하세요: 주입량, 반복 시간, 용출 시간, 그리고 필요한 수집 시간 일련의 집합.
    3. 시작 버튼을 눌러 자동 시퀀스를 시작하면 HPLC 시스템과 LC-mate가 설정된 매개변수에 따라 반복적으로 작동합니다.
  3. "모두 수집" 모드의 분수 수집
    1. 인터페이스 왼쪽에 있는 Collect All 기능 모듈을 선택하면 시스템이 그림 2D에 나타난 매개변수 설정 인터페이스를 표시합니다.
    2. 수집 임계값을 설정하면, 임계값을 넘거나 낮은 크로마토그래피 피크를 모두 따로 수집하여 혼합물 내 화합물이 손실되지 않도록 보장할 수 있습니다.
      참고: 아세토니트릴은 가연성 및 독성 용매입니다. 아세토니트릴이나 기타 유기 용매가 관련된 모든 절차는 반드시 환기가 잘 되는 실험실 공간에서 수행되어야 합니다. 직원은 항상 화학 방수 고글과 용제 저항 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 폐기물, 아세토니트릴 및 기타 유기 용매는 유해 화학 폐기물에 대해 지정되고 적절히 라벨링된 용기에 수집되어야 합니다. 이 폐기물들은 우리 기관의 환경 보건 및 안전 프로토콜에 따라 허가된 처리 서비스에 의해 처리되었습니다.

5. 파이프라인 정화

참고: 파이프라인을 청소하면 다음에 오토샘플러를 사용할 때 샘플이 파이프라인에 남아 있지 않도록 보장합니다.

  1. 깨끗한 용매가 담긴 작은 병을 준비하고, 오토샘플러의 주입 파이프라인을 용매에 삽입하세요.
  2. 왼쪽 인터페이스에서 정화 모듈을 선택하여 매개변수 설정 메뉴를 열어(그림 2E).
  3. 인젝터 파이프라인 정화
    1. 주입량을 0에서 1000 사이로 설정하고, 반복 횟수(제한 없음)를 설정하세요.
    2. "세척 완료" 아래 정 화 항목을 클릭하여 인젝터 파이프라인 세척을 시작하세요.
    3. "사이클" 수를 모니터링하여 완성된 세척 사이클 수를 추적하세요.
  4. 수집 파이프라인 정화
    1. 정화 시간을 설정하세요 (제한 없음).
    2. "현재 파이프라인" 아래 정화 항목을 클릭하여 수집 파이프라인 정화를 시작하세요.
    3. 시스템이 파이프라인 0에서 파이프라인 10까지 순차적으로 처리하는 동안 현재 파이프라인 표시를 모니터링하여 어떤 파이프라인이 청소되고 있는지 확인하세요.

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그림 2: 방법 작동을 위한 LC-mate 터치스크린 인터페이스. (A) 최적화 화면. (B) 임계값 모드. (C) 타이밍 모드. (D) 모두 수집 모드. (E) 파이프라인 정화. (F) 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. 데이터 저장 명령어

  1. 자동 저장을 활성화하세요. 시스템은 각 용출 사이클이 완료되면 자동으로 크로마토그램을 저장합니다.
  2. 수동 저장을 하세요. 용출이 완료된 후 저장 버튼을 클릭하세요. 파일을 저장하려면 대화 상자에 필요한 메타데이터를 입력하세요.
  3. 저장 위치를 선택하세요. 파일을 기기의 로컬 저장소, SD 카드, 또는 외장 USB 드라이브에 저장할지 선택할 수 있습니다.
    참고: 모든 데이터 저장에는 외장 USB 드라이브를 사용하여 용량 제한을 피하고 쉽게 데이터를 접근하도록 하세요.

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결과

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2"-O-갈로이얼-하이퍼로사이드의 정제
2"-O-Galloyl-hyperoside(2-GH)는 전통 중의학인 Euphorbia helioscopia L.의 주요 수용성 성분으로, 오랜 역사를 통해 가래와 습기 해소에 사용되어 왔습니다. 화학 구조는 그림 3에 나와 있습니다. 2-GH는 최근 동물 모델에서 항섬유화 효과를 가진 것으로 밝혀졌습니다.12. 추가 약리학적 조사를 위해 충분한 순수 2-GH 샘플을 준비하기 위해 LC-mate를 이용한 반준비적 HPLC 분리가 수행되었습니다. 상세한 분리 매개변수는 다음과 같습니다:

기둥: 샤프실 C...

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토론

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이 결과는 LC-mate 시스템이 설정된 매개변수에 따라 연속적인 샘플 주입 및 분획 수집을 자율적으로 수행할 수 있음을 보여주며, 이를 통해 수동 개입을 크게 줄이고 분리 효율을 높인다. 이 시스템은 사용자 친화적인 인터페이스를 특징으로 하며, 초기 하드웨어 설정만 하면 직관적인 터치스크린 조작이 가능합니다.

실험적 성공을 보장하기 위해서는 세 가지 중요한 측면에 주의가 필요합니다. 먼저, 아날로그 신호 케이블과 트리거 케이블이 HPLC 검출기와 LC-mate 사이에 올바르게 연결되어야 하며(프로토콜 1.2.2 단계에 상세히 설명됨), 이를 통해 정확한 신호 표시와 신뢰할 수 있는 피크 기반 분획 수집이 가능합니다. 둘째, 크로마토그래피 조건(프로토콜 단계 3)은 만족스러운 해상도와 보존 시간, 피크 형태, 신호 강도를 최적화해야 합니다. 마지막으로, 최적화된 크로마토그램에 따라 적합한 분획 수집 방식을 선택해야 합니...

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공개 사항

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웨이민 자오는 LC-mate 설계를 제안했으며, 이는 상하이 베터렌 의료기술유한회사의 엔지니어들이 수행했습니다. 이 기기에 대한 특허는 상하이 베터렌 의료기술유한회사와 중국 과학원 상하이 소재연구소가 공동 보유하고 있습니다.

감사의 글

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저자들은 화학자들을 지루한 HPLC 수동 조작에서 해방시키는 아이디어를 현실로 전환하는 데 기여해 준 상하이 베터렌 메디컬 테크놀로지 유한회사와 LC-mate의 반복 가능성을 시험해 준 웰치 머티리얼즈 주식회사의 쉬홍 허 씨에게 진심으로 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
고성능 액체 크로마토그래프 - EasySep-1050상하이 통웨이 분석 기술 유한회사. EasySep®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm 악기 웹페이지1009992프로토콜에 사용되는 모듈식 준비 HPLC 시스템입니다. 용매 공급 펌프, UV/VIS 감지기, 수동 주입 밸브가 포함되어 있습니다. 이 시스템은 LC-mate가 자동화하는 코어 분리 유닛을 형성합니다.
(액체 크로마토그래피 컬럼) 샤프실-U C18 150mm (L) 및 시간; 30 mm (신분증) S-10 및 마이크로; m, 100A상하이 선메이 산업발전유한회사.U180110-300150역방향 - 입자 크기 10 & mu의 C18상 크로마토그래피 컬럼; m과 공극 크기는 100 & Aring;입니다. 이 방법은 약물, 유기 화합물과 같은 소분자 분리를 위해 설계되었으며, 재현성과 안정성이 우수합니다. 컬럼 크기(길이 150mm, 내경 30mm)는 준비 또는 준준비 크로마토그래피에 적합합니다.
LC-메이트상하이 베터렌 의료기술유한회사. 문의가 있으시면 언제든지 연락 주시기 바랍니다. LC-mate 기기는 교신저자에게 이메일로 연락해 주세요: wmzhao@simm.ac.cn GD202200337샘플 주입, 이동상 관리, 데이터 수집에 사용되는 것으로 추정되는 액체 크로마토그래피 시스템용 보조 장비. HPLC 시스템과 통합하여 실험 공정의 자동화와 효율성을 향상시킬 수 있습니다

참고문헌

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