이 비디오에서는, 우리는 새로운 초소형 유전자 총을 가진 살아있는 조직에 시약의 정확한 biolistic 전달 절차를 보여줍니다. 우리는 복부 신체 벽 및 단일 세그먼트의 신경에 dsRNA 분자를 제공함으로써 리치 태아의 축삭지도 분자 Netrin의 표현을 노크하고 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 비디오에서는, 우리는 살아있는 조직에 시약의 정확한 배달을 위해 biolistic 공압 모세관 총의 사용을 보여줍니다. 우리는 내부 통제로 치료 세그먼트를 떠나, 거머리 배아들 중 선택된 세그먼트에 교란 유전자 발현 패턴에 대한 절차를 사용합니다.
공압 모세관 총을는 표본을 열지 않고 개발의 초기 단계에서 세포의 내부 레이어에 도달하는 데 사용할 수 있습니다. 살아있는 조직으로 물질화된 도입하는 방법으로, 총을 가지고 biolistic 배달 몇 가지 장점이있다 : 그것은 빠른 연락 - 무료 비파괴입니다. 또한, 하나의 모세관 총을 서로 다른 물질의 독립적인 전송에 사용될 수 있습니다. 배달 지역 ~ 50-150 μm의 크기의 측면을 가지고 있으며 0과 50 μm의 사이에서 조정하는 의미 침투 깊이, 주변 ~ 15 μm의 이상 연장하실 수 있습니다. 이 배달 세포 주사를 통해 microinjection 및 체계 최저 또는 유전 방식에 의해 허물고 하나의 세포 사이의 중간 선택한 위치에 세포의 제한된 대상 수있는 장점이 있습니다.
쓰러뜨린 또는 자연적으로 일부 중앙 뉴런에 의해 및 복부 신체 벽 표현하는 축삭지도 분자 Netrin,하지만 등의 도메인의 표현을 두드리는 소리에 대한, 우리는 그리고 신체 벽에 dsRNA 분자 또는 플라스미드 - DNA를 제공 중앙 신경. , 총을로 코팅된 입자를 로딩 (I) 특정 분석을위한 실험 설정 (가속 압력을 조정)의 준비를하고, (ii) 코팅 dsRNA 또는 DNA의 분자와 입자 (III) :이 절차는 다음 단계를 포함 을 한 분석, (IV)의 두 시약을 (입자 전달 (V) 대상 조직 (바디 벽 또는 신경)으로 코팅 입자의 제공을위한 동물을 준비하고, (VI) 배아 가공 immunostaining, immunohistochemistry와의 연결을 납품 후 2-3일 일반적으로 결과를 시각화하는) 라벨.
입자가 netrin dsRNA와 코팅 때, 그들은 분명만을 입자를 (일반적으로, 세포 당 1-2 입자)이있는 세포에서 발생 netrin 표현의 노크 다운 표시가 발생했습니다. 입자들이 핵에 정지의 연결을 세포에 플라스미드 인코딩 EGFP 유도 형광 코팅.
프로토콜
입자는 이러한 dsRNA 분자, DNA의 plasmids 또는 염료와 같은 다른 시약과 코팅 수 있습니다. 입자의 종류와 직경이 시약과 조직의 목표 세포의 깊이에 따라 선택됩니다 더욱 침투 큰 입자, 그러나 조직에 손상을 일으킬 수 있습니다.
1. dsRNA 코팅 입자의 준비
- 얼음 이소프로판올 100 %를 놓으십시오.
- 100 ML 바인딩 버퍼에, Resuspend 5 MG 골드 입자 (평균 직경 1.6 μm의 S1600ri, 시쉘 기술, LLC.) 솔루션 준비가되면, 다음 단계로 진행합니다.
- 바인딩 버퍼, 소용돌이 간략와 clumping 피하기 위해 1-2 분 sonicate 100 μl를 추가하여 입자 솔루션을 희석.
- dsRNA / siRNA 5 - 10μg (dsRNAs / siRNA가 ~ 1μg/μl의 농도로 물에 용해한다)을 추가합니다.
- 2 분 실온에서 와동과 둡니다. siRNA에 이러한 집중과 시간 간격 결과는 금 입자를 포화.
- 펠렛 ~ 15 초에 대한 벤치 최고 원심 분리기에 ~ 2,500 rpm으로 원심 분리하여 siRNA / 골드 입자 단지.
- 뜨는을 제거하고 부드럽게 펠렛의 최소한의 중단과 함께 750....
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토론
이 예제에서, 우리는 안으로 안으로 살고 리치 배아의 작은화된 볼륨에있는 세포에 금 입자를 제공하고 유전자를 다운 노크 공압 모세관 총을를 사용합니다. 대상 지역은 일반적으로의 직경을했다 ~ 150 μm의 및 입자가 발견되면 0과 50 μm의 사이에 조정했던 의미 침투 깊이 주변 ~ 15 μm의. 입자가 축삭지도 팩터 netrin의 dsRNA 분자로 코팅 때, 그들은 분명만을 입자를 포함하는 세포에서 발생 netrin 표현의 노크 다운 표시가 발생했습니다. 입자들이 핵에 정지의 연결을 세포에 플라스미드 인코딩 GFP 유도 형광 코팅.
공압 모세관 총을 조직에 손상을 감지하지 않고, 3 차원에 갇혀 높은 정밀도와 함께 타겟으로하는 조직의 미세한 지역을 대상으로, biolistic 배달의 기술에 새로운 기능을 제공하는 방법 우리는 당신을 보여주었다.
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감사의 글
우리는 티가과 성장 감각 예측의 시간 경과 영화를 제공하는 유전자에 대한 구조를 생성하는 그의 도움 마이클 베이커 감사드립니다. 우리는 또한 공압 총기 실험과 기술 지원 버지니아 Vandelinder 감사하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 금 입자 | 기타 | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| 결합 완충액 | 시약 | Seashell Technology, LLC | ||
| 실리콘 고무 | 시약 | Dow Corning | Sylgard 184 |
참고문헌
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R.
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