광유체 분석을 통한 단일 세포 해상도에서 키메라 항원 수용체 T 세포의 다중 모드 기능 평가

Summary

CAR-T 세포를 이용한 채택 T세포 치료는 혈액암 치료에 가능성을 보여주지만, 지속적인 반응은 일관되지 않습니다. 다기능 T 세포는 관해 내구성과 상관관계가 있지만, 표준 분석 결과는 주요 하위 집단을 명확히 하지 못합니다. 우리는 광유체 플랫폼을 이용한 단일 세포 워크플로우를 제시하여 고기능 CAR-T 세포를 식별하고 분리하여 추가 연구를 수행합니다.

Abstract

채택 T세포 치료는 자가 T세포가 종양 표적 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형하여 체 외 확장 및 재주입 전에 사용하는 새로운 치료 패러다임입니다. 진행성 혈액 악성 환자에서 항종양 효능이 눈에 띄게 입증되었음에도 불구하고, 장기적인 반응은 상당 부분의 사례에서 나타나지 않습니다. 임상 결과 변동성에는 여러 특이한 요인이 작용할 수 있지만, 주입 전 CAR-T 세포 산물의 다기능 T 세포 비율이 암 관해 지속 기간과 강한 상관관계가 있다는 증거가 점점 증가하고 있습니다. 안타깝게도 현재 CAR-T 세포 제품의 표준 평가는 대량 개체군 측정이나 말단 분석에 의존하여, 기능이 높은 하위 집단을 분리하고 연구하는 데 제한적입니다. 여기서는 옵토플루이딕스 플랫폼을 활용해 개별 CAR-T 세포의 사이토카인 분비 프로필과 CD137 발현을 통한 활성화를 평가하는 워크플로우를 시연하며, 이는 선택적으로 세포독성 활성 평가와 결합할 수 있습니다. 가장 높은 다중 모달 기능을 보이는 세포를 분리하여 추가 분석을 통해 차세대 CAR-T 세포 치료 설계에 활용할 수 있습니다.

Introduction

키메라 항원 수용체(CAR) 발현 T 세포는 진행성 혈액 악성 종양 환자에서 놀라운 항종양 효능을 보였습니다 ^1,2. 그러나 치료 환자의 상당 부분이 결국 재발하여 더 높은 기능적 지속성을 가진 CAR-T 세포 제품 개발의 필요성을 부각시킵니다 3,4,5,6. 임상 결과의 변동성에는 여러 특이한 요인이 작용할 수 있지만, 주입 전 CAR-T 세포 산물의 다기능 T 세포 비율이 암 관해 지속성과 강한 상관관계가 있다는 증거가 점점 증가하고 있습니다. 따라서 더 높은 다기능성을 가진 CAR-T 세포를 농축하거나 공학적으로 만드는 전략은 장기 임상 반응을 매개할 잠재력이 향상된 치료용 제품을 만들어낼 수 있습니다 ^6,7,8. 안타깝게도 현재 CAR-T 세포 기능을 특성화하는 방법은 주로 대량 집단 측정이나 말단 분석에 의존하고 있습니다. 이들은 다기능 특성이 높은 특정 하위 집단을 분리하고 연구하는 능력을 제한합니다. 예를 들어, 사이토카인 분비는 일반적으로 대용량 상청액이나 세포 내 염색을 통해 평가됩니다. 후자는 단일 세포 수준⁹에서의 정보를 대가로 세포 고정을 요구합니다. 마찬가지로, 세포독성 잠재력은 T세포/표적세포 공동 배양 후 표적 세포 생존력 상실을 정량화하여 대량 CAR-T 세포군에 대해 가장 흔히 평가됩니다¹⁰. 생존 가능한 CAR-T 세포의 사이토카인 분비, 활성화 및 세포분해 활성을 단일 세포 해상도로 평가할 수 있는 능력은 보다 견고한 항종양 효능을 가진 치료제 개발을 촉진할 수 있습니다.

여기서는 광유체 단일 셀 플랫폼을 통해 다중 모드 기능을 위해 개별 CAR-T 세포를 동시에 프로파일링하는 방법을 제시합니다(그림 1). 이 시스템은 광전기 위치 측정(OEP)을 이용해 사이토카인 포획 비즈와 개별 세포를 공간적으로 분리된 펜으로 이동시키며, 단일 CAR-T 세포의 기능 평가를 가능하게 합니다(그림 2A). 이 프로토콜에서는 비바이러스성 유전자 전달을 통해 CAR-T 세포를 생성하고, 항원발현 및 항원음성 표적 세포와의 공동 배양 중 개별 CAR-T 세포의 사이토카인 분비 및 CD137을 통한 활성화를 평가하는 워크플로우를 시연합니다(그림 3 및 그림 4)¹¹. 수정된 세포 생성물 간 사이토카인 및 활성화 프로필을 구분할 수 있는 잠재력은 표준 CAR-T 세포와 c-Jun 과발현 세포를 비교함으로써 확인할 수 있습니다^. 단일 표적 세포에 대한 세포독성 활성은 광유체 플랫폼에서 카스파제 또는 형광 기반 판독을 사용해 평가할 수도 있습니다(그림 2B). 하지만 상호작용 속도론을 결정하기 위해서는 타임랩스 분석이 필요하며, 이는 각 CAR 구성체와 실험에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 마찬가지로, 만성 자극을 모방하는 반복적 살해 분석은 대체 워크플로우가 필요합니다. 따라서 이 글에서는 세포독성 평가를 수행하는 기본 절차를 설명하되, 그 구체적인 적용 사례에 대해서는 논의하지 않습니다.

선택한 평가 및 목표 특성에 따라, 다중 모드 기능을 가장 많이 보이는 라이브 CAR-T 셀을 장비에서 분리하여 추가 연구를 위해 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮길 수 있습니다(그림 2C).

Protocol

참고: 완충 및 배지 준비는 표 1에 제공되어 있습니다.

1. 백혈구 환원 시스템 원추세포로부터 CD8 T세포 분리

참고: 모든 단계를 조직 배양 생물안전 캐비닛에서 멸균 무균 기법으로 수행하십시오. 희석, 세척, 재현탁을 위한 모든 배지는 시술 내내 4 °C로 유지해야 합니다.

1. 각각 15mL의 세포 분리 배지(밀도 1.077 g/mL)를 두 개의 50 mL 원뿔 튜브(분리 튜브)에 추가합니다.
2. 백혈구 환원 시스템(LRS) 원뿔형 원뿔을 덮지 않은 50 mL 원뿔 튜브 위에 올려놓습니다. 멸균된 가위를 사용해 LRS 콘 아래로 뻗은 플라스틱 튜브를 잘라냈습니다. LRS 콘을 50mL 원뿔형 열린 튜브 위에 올려놓고 위에 있는 플라스틱 튜브를 잘라내세요. 50mL 원뿔 튜브에 약 8-10 mL의 혈액을 채취하세요.
3. 50mL 원뿔형 튜브를 50mL로 채우고, 배지 및 완충제 목록에 명시된 대로 PBS + EDTA를 채우고, 희석된 혈액을 피펫으로 혼합합니다. 희석된 혈액을 두 개의 분리관 사이에 균등하게 나눠 주세요.
4. 실온(RT)에서 750 x g 의 희석된 혈액으로 분리관을 원심분리하여 15분간 원심분리하며, 9개는 가속, 2개는 감속에 사용한다.
5. 10 mL 혈청학적 피펫을 사용해 각 분리관에서 버피 코트를 조심스럽게 수집하여 신선한 50 mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.
6. 각 50mL 원뿔 튜브를 PBS + EDTA로 40mL로 채우고 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 단일 셀 현탁액을 300 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다. 상정액을 흡인하세요.
7. 세포 페를릿을 재현탁하여 PBS + EDTA 40mL에 혼합합니다. 단일 셀 현탁액을 300 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다. 상정액을 흡인하세요.
8. 세포 펠릿을 PBS + EDTA 비율로 재현탁하고, 트리판 블루 염색을 통해 말초혈 단핵세포(PBMC) 현탁액의 생존 가능한 세포 밀도를 측정합니다.
   참고: 트리판 블루는 DNA를 염색하는 생세포 불투과 염료입니다. 따라서 살아있는 PBMC와 핵이 없는 세포(즉, 적혈구)는 모두 염색되지 않은 상태로 남게 됩니다. 생존 가능한 PBMC 밀도를 결정할 때 소세포(예: 적혈구)는 제외하는 것이 중요합니다.
9. 원하는 수의 PBMC를 신선한 50mL 원뿔형 튜브로 옮겨 CD8⁺ T 세포의 자기 농축을 수행합니다. 자기 농축에 필요한 PBMC의 시작 수로 원하는 CD8⁺ T 세포 수의 10배를 추정합니다. 시술 중에는 시약을 차갑게 유지하세요.
10. PBMC 셀 현탁액을 300 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다. 상정액을 흡인하세요. 세포 펠릿을 1 x 10⁷ 셀마다 40 μL MACS 버퍼(배지 및 버퍼 목록에 명시된 대로 준비됨)에 재현탁합니다.
11. 1 x 10^{7 세포당} 10 μL ^CD8+ T 세포 비오틴-Ab 칵테일을 추가합니다. 피펫팅으로 혼합한 후 4 °C에서 5분간 인큐베이팅합니다.
12. 1 x 10^7셀당 30 μL MACS 버퍼를 추가하세요. 1 x 10⁷ 세포당 20 μL ^CD8+ T 세포 마이크로비드를 추가합니다. 피펫팅으로 혼합한 후 4 °C에서 10분간 배양합니다.
13. 미리 냉각된 LS 컬럼을 자석에 올려놓으세요. 액체 흐름을 모으기 위해 15mL 원뿔형 튜브를 아래에 넣으세요. 각 LS 컬럼을 3mL의 MACS 버퍼로 평형을 맞춥니다.
14. 수집관과 동일한 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 세포 현탁액을 평형 레이저 컬럼에 적용합니다. 1mL MACS 버퍼로 컬럼을 3번 세척합니다. 각 1mL 세척이 LS 컬럼을 완전히 통과한 후 다음 세척을 적용하세요.
15. 수집한 세포를 조심스럽게 재현탁하고, 트리판 블루 염색을 통해 농축된 CD8⁺ T 세포 현탁액의 생존 가능한 세포 밀도를 측정합니다.

2. 비드 기반 CD8⁺ T 세포 활성화

1. T 세포:구슬 비율이 1:1로 나오기 위해 필요한 인간 CD3/CD28 구슬 수를 계산하세요. 활성화 비드 스톡에는 25 μL당 1 x 10⁶ 개의 비드가 포함되어 있습니다.
2. 활성화 비즈를 최소 30초 이상 부드럽게 소용돌이로 돌리고, 계산된 비드 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 비즈를 세척할 만큼 같은 양의 미디엄을 넣고 최소 5초 동안 소용돌이를 돌리세요.
3. 15mL 원뿔 튜브를 해당 자석에 1분간 넣어 튜브 측면의 구슬을 모으세요. 흡인하고 상정액을 버리세요.
4. 최종 T 세포 농도인 1 x 10⁶ T 세포/mL에 필요한 배지 부피를 계산합니다. 15mL 원뿔 튜브를 자석에서 분리하고 계산된 배양액에 재현탁합니다. 최종 농도인 50 U/mL에 재조합 인간 IL-2를 첨가합니다.
5. 완전히 보충된 배지를 T 세포가 포함된 튜브로 옮기고 재현탁합니다. 세포 현탁액을 적절한 세포 배양 형식(예: 48웰 플레이트에 1mL, 24웰 플레이트에 2mL)으로 씨앗을 넣고 40시간 배양합니다.

3. 핵분화를 통한 비바이러스성 유전자 전달에 의한 CAR-T 세포 생성

참고: 배지(37 °C), 시약(RT), 원심분리기(RT)의 사전 가열은 높은 유전자 전달 효율을 위해 매우 중요합니다.

1. 각 핵 형성 조건에 대해 1mL의 세포 배양지를 담은 48웰 플레이트를 준비하고 표지합니다. 배지를 최소 30분간 배양하여 따뜻하고_CO2 조절된 배지를 제공하며 생리적 pH를 제공합니다.
2. 뉴클레오펙터를 켜고 16웰 스트립 내에서 뉴클로펙터를 선택할 위치를 선택하세요. 적절한 프로그램을 선택하세요(예: 고효율을 위한 FI-115 또는 더 높은 생존 가능성을 위한 EO-115).
3. 인큐베이터에서 T 세포가 들어 있는 배양판을 꺼내 현미경으로 세포의 시각적 상태를 확인하여 활성화가 성공했는지 첫인상을 얻으세요. 성공적으로 활성화된 T 세포는 고르게 군집되고 세포 형태가 커진 모습을 보여야 합니다. 중간 색상이 신선한 매체에서 약간 주황빛으로 변하는 것은 활성화가 더 활발한 대사 상태를 가져왔음을 나타내며, 이는 좋은 신호로 간주됩니다. 현재 초기 활성화 마커 CD25와 CD69에 대한 유동 세포 분석 방식으로 활성화를 검증할 수 있습니다.
4. 활성화된 T 세포를 재현탁하고, 채취하며, 카운트를 세어보세요. 각 조건당 1.2에서 2 x 10 6^{개의 T 세포} 를 고려하여 필요한 T 세포 수를 계산합니다. 계산된 부피를 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 옮겨 200 x g 에서 원심분리기에서 10분간 RT 상태에서 투여합니다.
5. 상원액을 흡인하여 버리고, 따뜻한 PBS 10mL로 T 세포를 세척하세요. 원심분리기 200 x g 에서 RT 10분간 사용. 원심분리 시간을 이용해 일반적으로 1 μg/μL DNA 농도로 구성된 CAR 인코딩 플라스미드를 해동합니다. 개별 DNAse 프리 1.5 mL 마이크로 원심분리관에서 뉴클로페펙션 조건별로 개별 DNAse 없는 마이크로 원심분리관에서 전이제인코딩(SB100x) 플라스미드(1.0 μg) 또는 미니서클(0.5 μg)과 CAR를 코딩하는 플라스미드(1.0 μg) 또는 미니서클(0.6 μg)을 조립합니다.
6. P3 뉴클로펙터 용액을 충분한 양에 첨가하여 준비하세요(조건에 따라 뉴클로펙터 용액 16.4 μL + 보충제 3.6 μL 포함).
7. 원심분리기에서 T 세포가 들어 있는 15mL 원뿔관을 꺼내 상청액을 빼낸 후 200 x g에서 1분간 원심분리기를 하여 바닥에 잔류 액체를 수집합니다. 200 μL 피펫을 사용해 세포 펠릿에 닿지 않으면서 최대한 많은 완충제를 조심스럽게 제거하세요.
8. 즉시 각 조건별로 20 μL P3 버퍼에 T 세포 펠릿을 재현탁시키세요(재료 목록에 명시됨). P3 버퍼 내 세포 현탁액 20 μL를 해당 구조물을 포함한 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮기고, 공기를 도입하지 않고 부드럽게 혼합한 후 세포 현탁액을 16웰 뉴클로펙션 스트립으로 옮깁니다. 우물 바닥의 공기를 부드럽게 두드려 제거하세요.
9. 16웰 스트립을 4차원 뉴클로펙터 시스템에 넣고 뉴클로펙션 절차를 시작하세요. 핵 방출에 성공한 후, 선택한 모든 우물에 대해 화면에 녹색 십자가가 표시되어야 합니다.
10. 즉시 준비된 48웰 플레이트에서 미리 가열된 배지 100 μL을 추가한 후 16웰 스트립을 인큐베이터에서 10분간 배양합니다.
11. 조심스럽게 2회에서 3회로 재현탁하고, 세포 현탁액을 준비된 48웰 플레이트로 옮긴 후 인큐베이터에 다시 넣으세요.
12. 4-5시간 후, 각 웰에서 500 μL을 조심스럽게 제거하고, 500 μL 신선하고 예열된 배양지를 500 μL 500 μL 추가하여 50 U/mL 재조합 인간 IL-2를 조심스럽게 추가합니다.
13. 격일로 정기적으로 배지를 교체하여 세포를 확장시키고, 세포 밀도를 0.5에서 2 x 10⁶ T 세포/mL 사이로 유지하세요.
14. 6일째에는 CD3/CD28 활성화 비즈를 제거하세요. T 세포를 부드럽게 10번 재현탁한 후 15mL 원뿔형 튜브로 세포 현탁액을 옮겨 적출합니다. 15mL 원뿔 튜브를 해당 자석에 1분간 넣으세요.
15. 세포 현탁액을 흡인하여 신선한 배양판으로 옮긴 후, IL-2가 보충된 신선 배양지를 50 U/mL까지 투여합니다. 자석 안에 남아 있는 15mL 원뿔형 튜브의 측벽에는 비즈가 보여야 합니다.
16. 7일째에는 해당 CAR 또는 대리 마커 발현의 유동세포 분석을 통해 유전자 전달 효율을 분석한 후, 8일째에는 형질전환유전자 양성 CAR T 세포의 자기장 분류로 진행합니다( 보조 그림 1의 게이팅 전략).

4. 형질전환유전자 양성 T 세포의 자기 농축

참고: 모든 단계를 조직 배양 생물안전 캐비닛에서 멸균 무균 기법으로 수행하십시오. 희석, 세척, 재현탁을 위한 모든 배지는 시술 내내 4 °C로 유지해야 합니다.

1. T 세포를 부드럽게 재현탁하여 15mL 원뿔형 튜브로 옮겨 채취합니다. T 셀을 세고, 자기로 농축할 셀 수를 뽑아 300 x g에서 10분간 원심분리합니다.
2. 흡입 후 상원액을 제거한 후 10mL의 MACS 완충액에 재현탁하여 세척합니다. 300 x g에서 10분간 원심분리기. 흡인하고 상청액을 버리세요.
3. 대리모 마커(예: tEGFR)에 대해 필요한 비오티닐화 항체의 양을 계산하세요. 일반적으로 항체는 1 x 10⁶ 세포당 1 μL로 용량을 조절해야 합니다.
4. T 세포를 1 x 10^{7 세포 밀도} 로 재현탁시키고, 계산된 양의 비오티닐화 항체를 추가합니다. 4°C에서 20분간 배양하세요.
5. 10mL MACS 버퍼를 추가하고 300 x g에서 10분간 원심분리기를 사용해 세척합니다. 흡인하고 상청액을 버리세요.
6. T 세포를 80 μL MACS 버퍼당 1 x 10^{7 세포에} 재현탁합니다. 1 x 10⁷ 세포당 20 μL 용량의 항바이오틴 미생물구슬을 추가합니다. 잘 섞어 4°C에서 15분간 배양하세요.
7. 10mL MACS 버퍼를 추가하고 300 x g에서 10분간 원심분리기를 사용해 세척합니다. 흡인하고 상청액을 버리세요. 세포를 500 μL MACS 버퍼에 재현탁합니다.
8. 미리 냉각된 LS 컬럼을 자석에 올려놓으세요. 액체 흐름을 모으기 위해 15mL 원뿔형 튜브를 아래에 넣으세요.
9. 각 LS 컬럼을 3mL의 MACS 버퍼로 평형을 맞춥니다. 수집관과 동일한 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 세포 현탁액을 평형 레이저 컬럼에 적용합니다.
10. 1mL MACS 버퍼로 컬럼을 3번 세척합니다. 각 1mL 세척이 LS 컬럼을 완전히 통과한 후 다음 세척을 적용하세요.
11. 형질전환 양성 세포를 수집하려면, 자석에서 LS 컬럼을 꺼내 신선한 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. MACS 완충액 5mL를 추가하고 액체를 부드럽게 컬럼 밖으로 밀어냅니다.
12. 분리된 세포를 세고 300 x g에서 10분간 원심분리기를 사용하세요. 형질전환유전자 양성 세포를 적절한 양의 배지에 재현탁시키고 IL-2를 보충한 상태에서 기능적 및/또는 표현형 평가를 수행할 때까지 인큐베이션합니다. 워크플로우 시작 전에 CAR 또는 대체 전도(subrogate transduction marker) 염색을 통해 순도 검사를 수행하세요(보충 그림 2).

5. 시스템 준비

1. 기기를 켜고 Cell Analysis Suite(CAS) 소프트웨어를 엽니다. 폐기물 수거 용기가 비어 있는지 확인하세요. 가습기 컬럼에 물이 있는지 확인하세요.
2. 워크플로우 패널로 이동하세요. 시스템 설치 시 미리 로드된 Full Clean 워크플로우를 열어주세요.
   참고: 기기에서 실험을 시작한 후 72시간 이내에 Full Clean 워크플로우를 실행하는 것이 권장됩니다.
3. 모든 검사를 수행하고 시작을 클릭해 진행하세요. 요청이 있으면 각 시약 베이 슬롯에 있는 원뿔형 튜브와 시약 병을 BLI 세척액이 포함된 새 용기로 교체하세요. 진행하려면 '실행 아이콘'을 클릭하세요.
4. 요청이 있으면 각 시약 구역의 원뿔형 튜브와 시약 병을 멸균된 새 용기로 교체하세요. 진행하려면 '실행 아이콘'을 클릭하세요.
5. 사전 점검 워크플로우(시스템 설치 시 미리 로드됨)를 열어보세요. 모든 검사를 수행하고 시작을 클릭해 진행하세요.
6. 50mL 원뿔형 튜브에 2mL의 습윤액을 준비합니다. 별도의 50mL 원뿔형 튜브를 준비하고, 1x DPBS 39.6mL와 습윤 첨가제 400 μL를 넣습니다.
7. 안내가 나오면 플러시 칩을 옵토플루이딕스 칩으로 교체하세요. 진행하려면 '실행 아이콘'을 클릭하세요. 네스트를 닫기 전에 광유체 칩과 둥지 페룰 표면을 70% 에탄올로 조심스럽게 청소하세요.
8. 요청이 있을 때, 각 시약실 슬롯에 있는 원뿔형 튜브와 시약 병을 적절한 용액이 포함된 신선한 용기로 교체하세요.

6. 분석법 워크플로우 생성

1. 워크플로우 패널로 이동하세요. 새 워크플로우 만들기(+)를 선택한 후, Opto T 세포 프로파일링을 선택한 후 드롭다운 메뉴에서 MCA 및 세포독성 분석 법을 선택하세요.
2. ' Multiplex Cytokine Bead Load '를 더블 클릭하여 비드 로드 목록을 확장하세요. 사이토카인 표적을 3개 미만으로 분석할 경우, X 버튼을 클릭하여 비드 로드 목록에서 사이토카인 비드를 삭제하세요.
3. 각 필드에 적절한 구슬 유형, 사이토카인 타겟, 가져오기 위치로 업데이트하세요.
   참고: CAS 소프트웨어는 비드 로딩 항목 배열과 상관없이 밝기가 점점 낮아지는 순서대로 각 사이토카인 캡처 비드를 자동으로 로드합니다.
4. Priorityd APC Load w/ Control을 더블 클릭하면 목표 셀 부하 목록을 확장할 수 있습니다. 대조군 표적 세포 1개 이상의 검사와 표적 세포 샘플 군주 1개 이상의 검사를 할 경우, 추가 세포 적재 단계를 추가합니다.
5. 각 필드에 원하는 대상 세포 라인 이름, 펜의 원하는 시야각(FOV), 그리고 APC 선택 기준(대상 펜 선택(TPS) 템플릿 파일을 지정하여 업데이트합니다.
6. T 셀 부하 구성을 선택하고 다중 셀 라인을 선택하세요. 우선순위 T 셀 부하를 더블 클릭하면 T-셀 부하 목록을 확장할 수 있습니다.
7. 각 필드에 원하는 T-세포 라인 이름, 원하는 투입 시야(FOV), 그리고 T-셀 선택 기준(TPS 템플릿 파일을 지정함으로써)을 업데이트하세요.
8. 세포독성 분석법을 더블 클릭하면 세포독성 분석법 설정을 확장할 수 있습니다. 워크플로우별 영상 설정 필드를 원하는 분석 기간(h)으로 업데이트하세요.
9. Phenotype and Cytokine Assay 더블 클릭으로 사이토카인 분비 분석의 염색 프로토콜을 확장하세요.
10. 1차 및 2차 얼룩에 맞는 적절한 가져오기 위치를 On Chip Staining 필드에 업데이트하세요.
11. 언로드 목록을 확장하려면 T 셀 언로드를 더블 클릭하세요. #칩당 Exports (빈칸 포함) 필드를 원하는 수량으로 업데이트하세요. 새로 생성된 워크플로우를 저장하고 열어보세요.

7. 사이토카인 포획 비드 로드

1. 각 비즈 바이알마다 소닉테이트나 소용돌이를 통해 캡처 비즈를 완전히 재현지시킵니다. 셀 카운터를 통해 구슬 농도를 측정합니다.
2. 30 μL 비드 희석 버퍼에서 비드 밀도를 4.5 x 10⁶ 비즈/mL(타입 A 비즈) 또는 4 x 10⁶ 비즈/mL(타입 B 비즈)로 조절합니다.
3. 비드 현탁액은 샘플 적재 구역에 적재하라는 지시가 있을 때까지 4°C에서 보관합니다. 모든 검사를 수행하고 시작을 클릭해 진행하세요.
4. 요청이 있으면 사이토카인 비드 현탁액을 20 μL 피펫과 혼합하여 적절한 수입 위치에 부합합니다. 진행하려면 '실행 아이콘'을 클릭하세요.
5. 요청이 있을 때는 여러 시야각을 육안으로 점검하여 캡처 비즈가 유체 채널에 적절한 밀도로 고르게 분포되었는지 확인한다. 만약 하중 분포 및/또는 밀도가 최적이 아니라면, 플러시(Flush)를 선택하고 가져오기(Import )를 선택하여 비드 하중을 다시 시도하세요. 하중 분포와 밀도가 적절하면, 진행 을 선택하여 펜 닝 비드를 시작하세요.
6. 각 사이토카인 포획 구슬에 대해 7.3단계를 반복합니다.

8. 표적 셀 부하

1. 각 표적 세포주의 생세포 밀도를 트리판 블루 염색을 통해 측정합니다.
   참고: 이 워크플로우는 목표 세포가 활성 배양에서 공급된다고 가정합니다. 냉동 보존 세포를 사용할 경우, 해동 후 최소 한 번은 배양되었고 생존 가능 비율이 90% 이상이어야 합니다.
2. 1.7 mL 마이크로퓨지 튜브에 1 x 10 6^{개의 표적} 세포를 채취합니다. 원심분리기를 300 x g 에서 5분간 RT 상태로 투여하세요. 상원액을 흡인하세요.
3. 각 표적 세포 펠릿을 100 μL 부속 V 염색액에 재현탁합니다. 빛을 차단한 RT 환경에서 30분간 부양하세요.
4. 1x Annexin V 결합 버퍼 400 μL 추가하고 피펫팅으로 재현탁합니다. 원심분리기를 300 x g 에서 5분간 RT 상태로 투여하세요. 상원액을 흡인하세요.
5. 각 표적 세포 펠릿을 250 μL 로딩 매체 +_CaCl2에 재현탁합니다. 표적 셀 현탁액은 샘플 적재 베이에 적재하라는 지시가 있을 때까지 4 °C에 보관합니다.
6. 요청이 있으면 200 μL 피펫으로 표적 셀을 재현탁하고 적절한 가져오기 위치에 표적 셀 현탁액을 적재합니다. 진행하려면 '실행 아이콘'을 클릭하세요.
7. 지시가 주어지면 여러 시야각을 시각적으로 점검하여 목표 셀이 유체 채널에 적절한 밀도로 고르게 분포되어 있는지 확인하세요. 부하 분포 및/또는 밀도가 최적이 아니라면, 플러시와 가져오기 를 선택해 타겟 셀 부하를 다시 시도하세요. 하중 분포와 밀도가 적절하다면 TPS 게이팅을 시작하기 위해 진행 을 선택하세요.
8. 프롬프트가 뜨면 수동 조작으로 이동한 후 TPS를 클릭한 후 요청한 TPS 템플릿을 불러오세요.
9. TPS 게이트를 정의하기 위해 이미징할 광학 필터와 FOV를 지정한 후, 캡처 전용 을 클릭하여 이미지 획득을 시작하세요.
10. 게이팅 구성 편집기를 열고 Annexin 체크박스를 클릭한 후 X 매개변수에 대해 Annexin V 염색에 적합한 채널을 선택하세요. 드롭다운 메뉴에서 Log(델타 중간 밝기)를 선택하세요. Y 파라미터로 OEP를 선택하세요. 드롭다운 메뉴에서 최근이웃(Nearest Neighbor)을 선택하세요.
11. 결과 게이트의 모서리를 드래그하여 Annexin V^hi 와 Nearest Nev^저용량 셀을 제외한 후, 파일 이름을 바꾸지 않고 TPS 템플릿을 저장하세요.
12. 워크플로우로 돌아가서 계속해서 작성 진행을 하세요. 각 표적 세포주에 대해 8.7-8.11단계를 반복합니다.

9. T 셀 부하

1. 트리판 블루 염색을 통해 각 T세포 군주의 생세포 밀도를 측정합니다.
   참고: 이 작업 흐름은 T 세포가 활성 배양에서 공급된다고 가정합니다. 냉동 보존 세포를 사용할 경우, 해동 후 하룻밤 동안 배양되고 최소 90% 이상의 생존 가능 여부를 확인하세요.
2. 1.7mL 마이크로퓨지 튜브에 10개의^6T 세포 1개를 채취합니다. 원심분리기를 300 x g 에서 5분간 RT 상태로 투여하세요. 상원액을 흡인하세요.
3. 각 표적 세포 펠릿을 100 μL 부속 V 염색액에 재현탁합니다. 빛을 차단한 RT 환경에서 30분간 부양하세요.
4. 1x Annexin V 결합 버퍼 400 μL 추가하고 피펫팅으로 재현탁합니다. 원심분리기를 300 x g 에서 5분간 RT 상태로 투여하세요. 상원액을 흡인하세요.
5. 각 T세포 펠릿을 250 μL 로딩 매체 +_CaCl2에 재현탁합니다. T-셀 현탁액은 샘플 적재 베이에 적재하라는 지시가 있을 때까지 4 °C에 보관합니다.
6. 요청이 있으면 200 μL 피펫으로 표적 셀을 재현탁하고 T-셀 현탁액을 적절한 수입 위치에 적재합니다. 진행하려면 '실행 아이콘'을 클릭하세요.
7. 요청이 있을 때는 여러 시야를 육안으로 점검하여 T 세포가 유체 채널에 적절한 밀도로 고르게 분포되었는지 확인하라. 부하 분포 및/또는 밀도가 최적이 아니라면, 플러시(Flush)와 가져오기(Import )를 선택해 T-셀 부하를 다시 시도하세요. 하중 분포와 밀도가 적절하다면 TPS 게이팅을 시작하기 위해 진행 을 선택하세요.
8. 프롬프트가 뜨면 수동 조작으로 이동한 후 TPS를 클릭한 후 요청한 TPS 템플릿을 불러오세요.
9. TPS 게이트를 정의하기 위해 이미징할 광학 필터와 FOV를 지정한 후, 캡처 전용 을 클릭하여 이미지 획득을 시작하세요.
10. 게이팅 구성 편집기를 열고 Annexin 체크박스를 클릭한 후 X 매개변수에 대해 Annexin V 염색에 적합한 채널을 선택하세요. 드롭다운 메뉴에서 Log(델타 중간 밝기)를 선택하세요. Y 파라미터로 OEP를 선택하세요. 드롭다운 메뉴에서 최근이웃(Nearest Neighbor)을 선택하세요.
11. 결과 게이트의 모서리를 드래그하여 Annexin V^hi 와 Nearest Nev^저용량 셀을 제외한 후, 파일 이름을 바꾸지 않고 TPS 템플릿을 저장하세요.
12. 워크플로우로 돌아가서 계속해서 작성 진행을 하세요. 각 T세포 군주별로 9.7-9.11단계를 반복합니다.

10. 세포독성 분석

1. 50mL 원뿔형 튜브에 관류 배지를 준비하는데, 100 μL 미리 해동된 NucView 530 카스파제-3 시약을 20mL T세포 매지(기본 농도 1 mM, 최종 농도 5 μM)에 첨가합니다.
2. 요청이 주어지면 시약실 슬롯에 있는 적절한 원뿔형 튜브를 염류 매체가 포함된 준비된 원뿔형 튜브로 교체합니다. 진행하려면 '실행 아이콘'을 클릭하세요.
   참고: 20mL의 관류 매체는 단일 옵토플루이딕스 칩을 24시간 동안 관류할 수 있습니다. 세포독성 검사가 24시간 이상 지속될 경우 추가 관류 배지를 준비하세요.
3. 원한다면, 14시간이 지났을 때 TPS 영상 남은 부분을 클릭해 남은 세포독성 분석 영상 단계를 종료하고 워크플로우를 진행할 수 있습니다.

11. 표현형 및 사이토카인 분석법

1. 1.7mL 마이크로퓨지 튜브에서 76 μL 다중성 인간 CD8/NK 패널 검출 항체와 4 μL 항CD137_BV421을 혼합하여 1차 염색 용액을 준비합니다.
2. 피펫팅으로 혼합하여 4 °C에서 저장하다가 로드 지시를 받으세요. 지시가 지시되면 1차 염색 용액과 20 μL 피펫을 혼합하여 적절한 수입 위치에 주입합니다. 진행하려면 '실행 아이콘'을 클릭하세요.
3. 1.7mL 마이크로퓨지 튜브에서 1x DPBS 72 μL와 다중화 키트 SA-PE 8 μL 혼합하여 2차 염색 용액을 준비합니다.
   참고: 2차 염색 용액은 1차 염색이 완료되면 즉시 주입 준비가 되도록 미리 준비해야 합니다.
4. 피펫팅으로 혼합하여 4 °C에서 저장하다가 로드 지시를 받으세요. 지시가 지시되면 2차 염색 용액을 20 μL 피펫과 혼합하여 적절한 수입 위치에 주입하세요. 진행하려면 '실행 아이콘'을 클릭하세요.

12. 분석 분석

1. 데스크톱으로 이동해 Assay Analyzer 소프트웨어를 열어보세요. Assay Analyzer를 선택하고 워크플로우를 선택한 후 분석할 워크플로우 유형을 선택하세요.
2. 하역할 관심 있는 펜을 정의할 때 원하는 기준을 사용하세요. 원하는 기준에 따라 언로드 리스트를 생성한 후 CAS 소프트웨어로 돌아가 선택한 작업 흐름 계속을 선택하세요.
3. Assay Analyzer로 내보내기 리스트 생성 체크박스가 체크되어 있는지 확인하세요: [옵토플루이딕스 칩 ID]

13. 하차

1. 각 웰당 50 μL T-셀 배지를 넣은 96웰 원형 바닥판을 준비합니다. 셀 언로드를 진행하려면 계속을 클릭하세요.
2. 지시가 나오면 칩 로딩 베이를 열고 네스트 뚜껑을 열어 옵토플루이딕스 칩을 제거하세요. 칩을 무균 페트리 접시에 넣고, 옵토플루이딕스 칩의 윗부분을 >1° 들어 올려 세포가 펜에서 굴러나오는 것을 방지합니다. 다음 세척 단계에서 멸균 조직 배양 인큐베이터에 보관하세요.
3. 빈 둥지에 멸균 플러시 칩을 넣고, 둥지 뚜껑을 닫은 뒤 칩 베이를 닫으세요. 완료 버튼을 누르고 계속하세요.
4. 지시가 나오면 칩 로딩 베이를 열고 네스트 뚜껑을 열고 플러시 칩을 제거하세요. 광유체 칩을 빈 둥지에 넣고, 둥지 뚜껑을 닫은 뒤 칩 베이를 닫으세요. 진행하려면 달리기 아이콘을 클릭하세요.
5. 메시지가 뜨면 '열기 '를 선택하면 웰 플레이트 적재/하역할 메뉴가 표시됩니다. 이전 플레이트를 제거하려면 '언로드 '를 클릭하세요. 웰 플레이트 ID와 웰 플레이트 유형을 업데이트한 후 Load를 선택한 후 Done을 선택하세요.
6. 셀 언로드를 진행하려면 계속을 클릭하세요. 원하는 펜을 모두 꺼내면 수동 조작 모드로 이동해 칩 베이를 열어 관심 있는 셀이 들어 있는 플레이트를 꺼내세요.

Results

기술된 프로토콜을 사용하여 개별 모조핵 발현, CAR 및 c-Jun 과발현 CAR T 세포를 항원 음성 또는 항원 양성 Figure 3 K562 종양 세포로 도전시키거나, 자극하지 않은 상태로 두었습니다(T세포만). 표적 세포는 재현 가능한 결과를 얻기 위해 항원의 균질성 발현을 평가했습니다(보완 그림 3). 단일 나노펜에서 분리된 덕분에 우리는 이 세포들의 사이토카인 발현 프로필을 시험 조건에 따라 단일 생성자, 이중 생성자, 세 번째 생성자로 특성화할 수 있었습니다(그림 3). 이 결과는 엘리사(ELISA)를 사이토카인 검출 확립 방법으로 검증하였습니다(보충 그림 4).

예상대로, 모의 핵 반응 T 세포 대부분은 측정된 세 가지 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL-2) 모두 음성으로 남았습니다. 표준 CAR T 세포에서는 이중, 삼중, 단일 양성 IFN-γ 사이토카인 생성자와 TNF-α 및 IL-2 분비 세포의 소량이 항원 도전 시 검출되었으나, 항원 음성 종양 세포에 노출되었을 때는 다세포 사이토카인 분비를 유도하지 않았습니다. 흥미롭게도, c-Jun의 과발현은 표적 접촉 시 이중 및 삼중 사이토카인 생성자와 단일 사이토카인 분비 세포의 비율을 증가시켜 표준 CAR T 세포에 비해 사이토카인 음성 세포의 전체 비율을 감소시켰다. 이 결과는 이 전사 인자⁶의 강제 발현에 의한 CAR T 세포의 표현형 조절을 기술한 이전 연구들과 일치합니다. 특히, T 세포 단독 그룹에서 항원 음성 종양 세포군보다 IFN-γ 양성 세포의 비율이 더 높았는데, 이는 해당 조건에서 분석된 세포 수가 적기 때문일 수 있습니다.

T세포 활성화를 더 깊이 조사하기 위해, 위에서 설명한 대로 처리된 개별 모의 핵 분리, CAR 및 c-Jun 과발현 CAR T 세포에서 CD137의 발현을 평가하였습니다(그림 4 및 보충표 1). 항원 발현 K562 표적 세포로 CAR T 세포를 도전 검사하면, 모의 핵 세포에 비해 CD137 발현이 증가하였습니다. 더불어, 표준 CAR 산물에 비해 c-Jun 과발현 CAR T 세포에서 CD137 양성 세포 비율이 약간 더 높은 경향을 관찰하였습니다.

결론적으로, 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 CAR T 세포의 사이토카인 분비 및 활성화를 평가할 수 있게 하여, 단일 및 다세포 사이토카인 생산자를 식별하고 이전에 전체 수준⁶에서 설명된 표현형 경향을 재현할 수 있게 했습니다.

그림 1: 광유체식 플랫폼을 통한 다중 모달 프로파일링의 회로도 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

그림 2: 다양한 광유체 플랫폼 특징의 대표적인 이미지. (A) OEP을 통해 개별 펜에 단일 입자 시퀀스를 가져오는 것. 이미지 왼쪽 부분의 펜들은 이전 시퀀스에서 로드된 상태입니다. (B) 시간이 지남에 따라 세 개의 개별 펜에서 살균 사건을 관찰하여 GFP 발현 항원 발현 종양 세포를 보여줌. (C) OEP를 통해 한 펜에서 개별 셀을 내보내는 것. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 단일 세포 수준에서의 사이토카인 분비 프로필의 대표적 분석. 개별 모조핵 T 세포 또는 CAR-T 세포는 항원 음성 또는 항원 양성 K562 종양 세포가 존재하거나 없는 상태에서 NTF-α, IL-2, IFN-γ의 사이토카인 포획 비드를 포함한 나노펜 내에서 배양되었습니다. 원형 차트는 24시간 동안 공동 배양(평가 평가) 후 표시된 사이토카인 분비 프로필을 가진 개별 개별적으로 작성된 CAR-T 세포의 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 단일 세포 수준에서의 CD137 발현 대표적 분석. 개별 모조핵 반응 T 세포(CAR-T 세포)는 배양 후 24시간 후 광플루이딕스 칩에서 CD137 표면 발현을 위해 염색하였으며, 항원 음성 또는 항원 양성 K562 종양 세포의 존재 여부와 관계없이 진행되었습니다. 바이올린 플롯은 모의 핵 분리된 T 세포와 CAR-T 세포에서 24시간 배양 후 CD137 발현의 형광 강도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

T 세포 배양 성분 (0.22μM 진공 필터 유닛을 사용한 멸균 여과)	부피(최종 농도)
RPMI-1640 (글루타맥스 1개, 25mM HEPES)	500 mL
페니실린/스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
β-머캅토에탄올 (50mM)	0.5 mL (45μM)
인간 혈청 (열로 비활성화됨)	50 mL (9%)
글루타맥스 보충제 (100배)	5mL (0.9x)
종양 세포 배양 구성 요소	부피(최종 농도)
RPMI-1640 (글루타맥스 1개, 25mM HEPES)	500 mL
페니실린/스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
태아 송아지 혈청 (열에 의해 비활성화됨)	50 mL (9%)
MACS 버퍼 컴포넌트	부피(최종 농도)
DPBS (Mg2+-프리, Ca2+-프리)	500 mL
태아 송아지 혈청 (열에 의해 비활성화됨)	2.5 mL (0.5%)
EDTA (0.5 M)	2 mL (2 mM)
PBS/EDTA 버퍼 구성 요소	부피(최종 농도)
DPBS	500 mL
EDTA (0.5 M)	2 mL (2 mM)
로딩 미디어 구성 요소	부피(최종 농도)
T 세포 배지	18 mL
로딩 시약	2 mL
매체+CaCl2 구성 요소 로딩	부피(최종 농도)
로딩 미디어	499 μL
CaCl2	1.25 μL
관류 배지+카스파제 기판	부피(최종 농도)
T 세포 배지	20 mL
NucView 530 카스파제-3 기질 (DMSO 내 1 mM)	100 μL
비드 희석 완충 성분	부피(최종 농도)
DPBS	800 μL
BSA (2% 무대비)	100 μL (0.2% w/v)
트윈-20 (10% 무관심)	10 μL (0.1% w/v)

표 1: 배지 및 완충기 준비.

보조 그림 1. 자기 농축 전 유전자 전달 효율을 평가하는 모범적인 게이팅 전략. 대표적인 윤곽 및 히스토그램 플롯은 유전자 전달 후 CAR 발현(tEGFR 양성) CAR T 세포를 식별하는 게이팅 전략을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2. 분류 후 순도 관리. 예시적인 윤곽 플롯은 자기 분류 후 CAR 발현(tEGFR 양성) CAR T 세포의 비율을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 3. 표적 종양 세포에서의 항원 발현. 대표적인 히스토그램 플롯은 WT K562 종양 세포를 묘사하거나, 유세포분석을 통해 동형형 또는 ROR1 표적 항체로 염색한 ROR1을 발현하도록 설계한 것입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 4. 표준 ELISA를 이용한 사이토카인 검출. 상청액 내 IL-2 및 IFN-γ 농도는 K562^ROR1 종양 세포와 24시간 공동 배양한 후 E:T 비율 4:1로, CAR 대 CAR+cJ T 세포에 대해 ELISA로 측정됨. 통계적 유의성은 쌍 없는 t-검정으로 산출되었으며, *P≤ 0.05, **P≤ 0.01, ***P≤ 0.001, ****P≤ 0.0001. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 1: 분석 대상 세포. 표는 조건별로 분석된 개별 셀의 수를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

입증된 워크플로우는 항원 양성 및 항원 음성 표적 세포와의 공동 배양 중 개별 CAR-T 세포의 사이토카인 분비 및 활성화 프로필을 평가할 수 있게 하며, 이는 선택적으로 세포 용해 활성 평가와 병행할 수 있습니다. 단일 세포 해상도로 다중 모달 기능 데이터를 포착하는 능력은 CAR T세포 성능을 전례 없는 정밀도로 분석할 수 있는 방법을 제공하지만, 측정값의 정량화는 각 펜에 동일한 수의 사이토카인 포획 비드, 표적 세포, CAR-T 세포를 적재하는 OEP 기술의 정확도에 크게 의존합니다. 따라서 각 시약이나 셀 샘플의 적재 밀도와 TPS 기준이 각 펜에서 단일 비드 및/또는 단일 셀 적재를 가능하게 최적화되도록 하는 것이 매우 중요합니다. 유체 채널 내 비드 또는 셀 현탁액의 농도를 조정하면 적절한 펜 로딩이 가능하지만, 플랫폼의 플러시(Flush)와 가져오기(Import) 옵션은 로딩 과정을 재시도하는 추가 전략 역할을 합니다.

광유체 칩 설계의 장점 중 하나는 펜 레이아웃을 22개의 뚜렷한 FOV로 분리한다는 점입니다. 광유체 칩 내에서 서로 다른 CAR 구성체로 설계된 T 셀을 서로 다른 FOV에 적중함으로써, c-Jun 과발현을 강제하는 대체 구성체가 표준 CAR 구성체에 비해 다중 모드 기능을 가진 CAR-T 세포 생성을 향상시킬 수 있는지 평가할 수 있었습니다(그림 3 및 그림 4). 이와 같이 옵토플루이딕스 플랫폼은 CAR-T 세포 유도 암 관해의 내구성을 높일 잠재력을 가진 후보 CAR 구조물을 신속히 식별할 수 있는 수단을 제공합니다. 특히, 단일 세포 수준에서 표적 세포와 이펙터 세포 간 상호작용 분석은 종양 세포에서 표적 항원 발현의 이질성과 CAR-T 세포 집단의 순도와 같은 핵심 매개변수의 중요한 제어를 요구합니다(보충 그림 2 및 보충 그림 3).

IL-2, TNF-α, IFN-γ 분비에 집중했지만, 상업적으로 이용 가능한 다중화 사이토카인 캡처 패널로 검출할 수 있는 다양한 용해성 분석물 덕분에 워크플로우를 상당히 맞춤화할 수 있습니다. 최근 발전은 이 분야가 고차원 유세포분석(HFS)으로도 발전하고 있음을 보여주며, 다양한 면역세포 유형에 대한 기능적 프로파일링과 시너지 효과를 창출할 새로운 가능성을 열어줍니다^12,13. 예를 들어, 향후 응용 분야에서는 다기능성 CAR 발현 조절 T 세포(Tregs)를 식별하는 스크리닝 캠페인이 포함될 수 있습니다. 이들은 TGF-β와 IL-10과 같은 여러 항염증 사이토카인을 분비합니다. 따라서 옵토플루이딕스 시스템의 적응성은 세포 면역치료가 비악성 질환 치료의 새로운 영역으로 확장됨에 있어 중요한 통찰을 제공할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4차원 핵 교활자	론자
항비오틴 마이크로비즈	밀텐이 바이오텍	130-090-485
CD3/CD28 다이나비즈	써모피셔	11131D
CD8+ T 세포 분리 키트	밀텐이 바이오텍	130-096-495
CELLSTAR 15ml 원뿔 튜브 (PP)	그레이너 바이오-원	188271-N
셀스타 50ml 원뿔관 (PP)	그레이너 바이오-원	227261
코닝 75cm ² 플러그 씰 캡이 있는 U자형 경사진 목 세포 배양용 플라스크	코닝	430720U
Costar 24-웰 클리어 TC 처리된 다중 웰 플레이트, 개별 포장, 멸균	코닝	3526
Costar 48-웰 클리어 TC 처리된 다중 웰 플레이트, 개별 랩, 멸균	코닝	3548
DPBS, 칼슘, 마그네슘 없음	써모피셔	14190169
다이나매그-15 자석	써모피셔	12301D
EGFR (에르비턱스, 세툭시맙)	일라이 릴리	NDC 66733-948-23	사내 인공작용(비오틴)
EGFR 항체 (C225 (세투시맙)) [Alexa Fluor 647]	노부스 바이오로지컬스	NBP2-75903AF647
태아 소 혈청, 가치	써모피셔	A5256801
글루타맥스 보충제 (100배)	써모피셔	35050038
인간 IL-2 IS, 프리미엄 등급	밀텐이 바이오텍	130-097-748
인간 혈청	독일 로테스 크로이츠(DRK) / 독일 적십자사 (GRC)	해당 없음
MACS 셀 분리 컬럼, LS	밀텐이 바이오텍	130-042-401
MACS 멀티스탠드	밀텐이 바이오텍	130-042-303
P3 1차 세포 4D-뉴클레오펙터 X 키트	론자	V4XP-3032
팬콜 인간, 밀도: 1.077 g/ml	팬바이오텍	P04-60500
PE 부속서 V 세포자멸 탐지 키트 I	BD 생명과학	559763
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/ml)	써모피셔	15140122
피어스 세포 표면 비오티닐화 및 분리 키트	써모피셔	A44390
쿼드로맥스 스타팅 키트 (LS)	밀텐이 바이오텍	130-091-051
RPMI 1640 미디엄, 글루타맥스 보충제, HEPES	써모피셔	72400054
혈청학적 피펫 2, 5, 10, 25, 50ml	그레이너 바이오-원	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
트리판 블루 스테인 (0.4%)	써모피셔	15250-061
울트라퓨어 0,5  M EDTA, pH 8,0	써모피셔	15575020
&β;-머캅토에탄올 (50mM)	써모피셔	31350010
비콘 시약
96웰 판 라운드 바텀	코닝	3799
비콘 플라스틱 플러시 칩		500-00030
BLI 세정액, 나트륨 하이포클로이트, 0.825%	브루커	520-08000
소 혈청 알부민 (BSA)	시그마-올드리치	A4161
브릴리언트 바이올렛 421 항인간 CD137 (4-1BB) 항체	바이오레전드	309820
염화칼슘 (CaCl2)	시그마-올드리치	C5670
LEGENDplex 인간 IFN-및 감마; 캡처 비즈 B3, 13X	바이오레전드	740545
LEGENDplex 인간 IL-2 캡처 비드 A5, 13X	바이오레전드	740934
LEGENDplex 인간 Th 패널 검출 항체 V02	바이오레전드	741041
LEGENDplex 인간 TNF-&알파; 캡처 비드 B7, 13X	바이오레전드	740711
레전드플렉스 SA-PE	바이오레전드	740452
NucView 530 Caspase-3 기판, DMSO 내 1 mM	H&wooml; 이젤	B-10406
옵토셀렉트 칩 3500	브루커	500-12001
아지드 나트륨	시그마-올드리치	S2002
웬 20	시그마-올드리치	P1379
비건 수출 완충	브루커	520-00040
VWR 미디어 병, 스퀘어, PETG, 125ml	VWR	216-2265
VWR 미디어 병, 스퀘어, PETG, 500ml	VWR	216-2267
젖음 첨가	브루커	520-08016
습윤 용액	브루커	520-00009