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방법 논문

쥐 모델에서 방사선 유발 피부 손상에 대한 Acorus calamus L. 추출물의 치료 효과

469 조회수

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DOI:

10.3791/69705

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2026년 1월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

이 논문에서

요약

방사선 유발 피부 손상은 암 환자에게 방사선 치료의 흔하고 심각한 합병증입니다. 효과적인 임상 치료법은 없습니다. 이 프로토콜은 방사선 유발 피부 손상에 대한 Acorus calamus L. 추출물의 치료 효과를 평가하며, 임상 예방 및 치료를 위한 신약 후보와 치료 전략을 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

방사선 유발 피부 손상은 암 치료에서 흔하고 쇠약해지는 합병증으로, 상처 치유 지연과 환자의 불편함을 증가시키는 경우가 많습니다. 예방이나 치료를 위한 몇 가지 치료제가 있습니다. 전통 중의학, 특히 아코러스 칼라무스 L.은 다양한 피부 질환 치료에 잠재력을 보여주었으나, 방사선 유발 피부 손상에서의 효능은 아직 충분히 탐구되지 않았습니다.

이 연구는 45 Gy 방사선에 노출된 스프래그-도울리 쥐 모델을 이용해 피부 손상을 유도했습니다. 쥐들은 45일간 10%, 20%, 40% Acorus calamus L. 추출물을 투여하였습니다. 상처 치유, 염증, 세포자멸사, 혈관신생을 상처 치유율, 조직병리학적 분석, 사이토카인 측정, TUNEL 염색, 면역조직화학을 통해 평가하였다. Acorus calamus L. 치료는 상처 치유를 가속화했으며, 중간 용량 그룹이 가장 높은 치유율을 보였으며(45일 기준 88.97%). 조직병리학적 분석 결과 염증 감소, 콜라겐 조직 개선, 새로운 혈관 형성이 확인되었습니다. 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 혈청 수치가 유의하게 감소했고, 주요 세포자멸 단백질(P53, Bax, Bcl-2)의 조절과 함께 세포자멸사가 감소했습니다. VEGF와 bFGF 발현이 상향 조절되어 혈관신생과 조직 수리가 촉진되었습니다. Acorus calamus L.는 염증을 줄이고, 세포자멸사를 억제하며, 혈관신생을 촉진함으로써 방사선 유발 피부 손상의 치유를 촉진합니다. 이러한 발견은 방사선 유발 피부 손상 관리에 있어 치료제로서의 잠재력을 시사하며, 임상 종양학에서 방사선 유발 피부 손상 관리에 유망한 대안을 제시합니다. 그 분자 메커니즘을 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

서론

방사선 유발 피부 손상은 핵사고와 종양 방사선 치료 모두에서 흔하고 어려운 합병증입니다. 방사선 치료 시 약 95%의 환자가 홍반, 편각화, 반복성 괴사성 궤양, 지속적인 통증, 악성 진행 위험 증가 등 어느 정도의 피부 손상을 겪게 됩니다. 이 병변들은 치료에 저항하는 경우가 많아 환자의 삶의 질을 크게 저하시키고 때로는 방사선 치료 중단이 필요해 방사선종양학에서 큰 임상적 도전 과제가 됩니다. 방사선에 의한 피부 손상의 근본 메커니즘은 복잡하며, 주로 피부 조직 내에서 자유 라디칼 생성이 세포 과정을 방해하고 치유 과정을 악화시키는 것과 관련이 있습니다 4,5. 이로 인해 세포자사멸사 관련 유전자의 발현이 장기화되고, 염증 반응이 조절되지 않으며, 신호 전달 경로가 변화하여 방사선 유발 상처의 지속적 특성에 기여합니다6.

현재 방사선 유발 피부 손상에 대해 보편적으로 인정받는 골드 스탠다드 치료법은 없습니다. 임상 관리는 항염증 또는 항산화 접근법을 강조합니다.7, 특히 국소 코르티코스테로이드가 염증 억제, 면역억제, 혈관 수축 효과를 통해 피부 반응을 줄이지만, 장기간 사용 시 피부가 얇아질 수 있습니다. FDA 승인 방사성 보호제인 아미포스틴은 심각한 부작용으로 인해 임상 사용이 제한적입니다9. 성장인자는 세포 증식, 혈관형성, 육아조직 형성을 촉진하여 상처 치유를 가속화하지만, 그 작용은 범위가 좁고 심부 조직 손상과 염증에 대한 조절이 제한적이며, 과다형성 위험도있습니다. 이에 따라 전통 중의학(TCM)은 전체론적 철학, 다양한 치료 효과를 가진 다양한 활성 성분, 그리고 우수한 안전성 프로필로 주목받고 있습니다. 이전 연구들은 감초 추출물, 알로에 다당류, 커큐민과 같은 천연 제품이 자유 라디칼을 제거하고, 염증 촉진 매개체(TNF-α, IL-6)를 억제하며, 섬유아세포 증식을 촉진함으로써 방사선에 의한 염증과 조직 손상을 완화한다는 것을 보여주었습니다. 그러나 대부분의 연구는 단일 활성 화합물이나 단일 표적에 초점을 맞추고 있어 다성분 시너지 작용 메커니즘에 대한 충분한 통찰을 제공하지 못합니다. 항염증, 항산화, 항박테리아, 상처 치유 특성으로 잘 알려진 식물인 아코루스 칼라무스 L.은 다양한 피부 질환에서 잠재력을 보여주었습니다.

아코루스 칼라무스 L.은 아라네과에 속하는 다년생 허브로, 테르펜, 페닐프로파노이드, 플라보노이드, 스테로이드, 알칼로이드 등 여러 생물활성 화합물을 포함하고 있습니다. 다성분 조성으로 인해 여러 표적에 동시에 작용할 수 있어 시너지 효과를 냅니다13. 연구에 따르면 이 효소는 NF-κB, MAPK와 같은 염증성 신호 전달 경로를 억제하고, TNF-α, IL-6와 같은 촉진염증 인자의 mRNA 발현을 용량 의존적으로 하향 조절하는 한편, SOD와 GSH-Px와 같은 항산화 효소의 활성을 증가시켜 항염증, 항산화, 항박테리아 효과를 발휘합니다14,15. 감염과 알레르기로 인한 피부 질환 치료에 효과가 입증되었음에도 불구하고, 방사선 유발 피부 손상에서 Acorus calamus L.의 역할은 아직 충분히 탐구되지 않았습니다. 최근 연구들은 방사선 유발 손상에 대한 보호 효과가 상처 치유를 촉진하고 염증을 감소시키는 것으로 입증되었습니다13. 그러나 방사선 유발 피부 손상에서 Acorus calamus L.의 구체적인 치료 기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다.

본 연구의 전반적인 목표는 방사선 유발 피부 손상의 동물 모델에서 Acorus calamus L. 추출물의 치료 효과를 평가하는 것입니다. 상처 치유, 염증 반응, 세포 특성을 평가하여 추출물의 작용 기전을 여러 관점에서 밝힙니다. 이 연구 결과는 암 방사선 치료로 인한 피부 병변의 임상 관리에 Acorus calamus L.을 사용하는 이론적 근거를 확립하는 것을 목표로 합니다. 또한, 연구는 추출물의 기능적 특성, 적합한 개입 시나리오, 핵심 효능 데이터를 제시하여 독자들이 이 자연 제품 기반 접근법이 연구 또는 임상적 필요에 부합하는지 판단할 수 있도록 돕습니다. 궁극적으로 이 연구는 종양 방사선 치료를 받는 환자의 삶의 질을 향상시키기 위한 효과적인 치료 방안을 모색합니다.

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프로토콜

본 연구에서 기술된 동물 실험은 북부 전구 사령부 종합병원 동물 의학 연구 윤리 위원회(윤리 승인 번호: 2018-03)의 승인을 받았습니다. SPF 등급 수컷 SD 쥐(6-8주, 체중 190-220g)가 연구를 위해 사용되었습니다. 사용된 시약과 장비의 세부 사항은 재료표에 나와 있습니다.

1. 실험동물 보관

  1. 6주에서 8주 사이, 체중 190에서 220g 사이의 SPF 수컷 SD 쥐 108마리를 선별합니다.
  2. 동물의 실내 온도는 22± 2°C, 상대습도는 50± 5%, 12시간의 밝고 어둠 주기를 유지하세요. 쥐들이 음식과 물을 제한 없이 자유롭게 접근할 수 있도록 허용하세요. 1주일간의 적응 기간이 지나면 후속 실험으로 넘어가세요.

2. 동물 그룹

  1. 쥐들을 무작위로 다섯 개의 뚜렷한 그룹으로 배정합니다: 정상군(정상, n = 18), 모델 그룹(모델, n = 18), 양성 약물군(양성, n = 18, 베타메타손 크림)16, 저용량 실험군(실험-L, n = 18), 중용량 실험군(실험-M, n = 18), 고용량 실험군(실험-H, n = 18). 정상 그룹을 제외한 모든 그룹이 방사선에 노출되었습니다.

3. 방사성 피부 손상의 동물 모델 구축

  1. 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액(40 mg/kg)을 복강 내 주사로 정밀하고 최소한의 불편함으로 마취를 투여합니다. 각막 반사가 없고 발가락 꼬집기에 반응하지 않는 것을 관찰하여 마취의 깊이를 확인하세요. 건조함을 막기 위해 연고를 발라주세요.
  2. 전기 면도기로 쥐의 등 털을 제거하세요. 그 후 요오드와 75% 알코올로 등 부위를 소독하세요.
  3. 각 쥐를 엎드린 자세로 눕히세요. 32P-β 방사선(표면 선량률: 0.9 Gy/min)을 양측 척추 부위(2cm × 2cm 면적)에 고정하고, 중앙선에서 1cm 외측 중심에 위치하여 광원이 표피에 틈 없이 닿도록 합니다. 방사선 시 이동을 방지하기 위해 멸균 의료용 테이프로 적용기를 고정하세요. 목표 피부 부위를 50분간 방사선으로 照射하여 총 흡수 선량을 45 Gy17로 얻으세요.
  4. 쥐가 방사선 치료를 받고 의식을 회복하면 개별 우리로 돌려보내며, 물과 음식을 자유 롭게 공급하고, 온도를 22± 2°C, 상대습도는 50± 5%, 12시간의 밝고 어두운 주기를 유지합니다.
    참고: 실험 과정은 생물학적 및 방사성 직업 보호 원칙을 엄격히 준수해야 합니다. 또한, 모든 운영 절차는 의료 및 방사성 폐기물의 적절하고 규정을 준수하는 처리 지침을 따라야 하며, 이는 관련된 모든 인력의 안전과 건강을 보장하기 위함입니다.

4. 아코루스 칼라무스 L. 추출물 제제 및 약물 투여

  1. Acorus calamus L.의 뿌리줄기를 무게로 재고, 철저한 세척을 한 뒤 자연 건조한 후 거친 가루(40 메쉬)로 갈아주세요. 50% 에탄올을 10-20개 용량 섞어 실온에서 24시간 균질화하세요
  2. 추출물을 30분간 가라앉힌 후, 상청액을 디캔트하고 거즈 4-8층을 통해 거즈를 제거하기 위해 예비 여과를 진행합니다. 그 후 여과지를 이용해 여과하고, 50-60°C의 회전 증발기에서 저압으로 증발시켜 용매를 회수하여 용매가 없는 고형 잔류물(AE, 수분 함량 < 5%)을 만듭니다.
  3. AE 연고 준비18
    참고: 중국 약전(2020년 일반장 0109)에 따라 10%(실험용 L, 수량), 20%(실험용 M, 수량), 40%(실험용 H, 무수)의 Acorus calamus L. 추출 연고를 조제하라.
    1. AE(예: 20% 연고에 20g)와 해당 제약 등급 석유(예: 20% 연고에 80g)를 정확히 계량하세요.
    2. 전체 페트롤라텀의 10%를 AE에 추가하고, 5분간 격하게 분쇄하여 균질한 반죽을 만듭니다(기하학적 희석법으로, AE가 지질친화성 염기에서 고르게 분산되도록 합니다).
    3. 남은 페트롤라툼을 60°C에서 녹이고 55°C까지 식힌 후 천천히 AE-페트롤라툼 페이스트에 넣습니다.
    4. 55°C에서 250rpm에서 30분간 자석으로 저어준 후, 실온까지 냉각하면서 연쇄 저어주면 매끄럽고 입자 없는 연고가 나옵니다.
    5. 블랭크 컨트롤 준비: 페트롤라텀을 60°C에서 녹인 후 250rpm에서 30분간 저어주고, 실온까지 냉각합니다(AE 연고 베이스와 동일).
    6. 모든 연고와 빈 석유는 밀봉된 멸균 용기에 4°C에서 보관하세요.
  4. 모든 그룹은 방사선 조사 후 45일 연속으로 하루 9시와 17시에 하루 두 차례 국소 투여를 받았으며(비방사선 그룹은 동일한 투여 일정을 동시적으로 받았습니다). 적용된 용량은 0.2 g/cm²로, 등쪽 피부 2cm × 2cm 부위에 고르게 분포되었습니다. 일반 그룹은 차량(페트롤라텀)을, 모델 그룹은 차량(페트롤라툼)을 받았습니다. 양성 대조군은 베타메타손 크림을 투여했습니다. 실험군인 L, M, H는 각각 10%, 20%, 40%(수/수)의 AE를 함유한 크림을 받았다. 각 도약 후에는 흡수를 돕기 위해 치료 부위를 10초간 부드럽게 마사지했고, 쥐는 핥지 않도록 5분간 억제했습니다.

5. 쥐 피부 조직과 혈액 채취

  1. 쥐를 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액(40 mg/kg, ip.)으로 마취합니다. 수술 기구를 소독하고 상처 부위의 피부를 절제하세요.
  2. 조직의 일부는 4% 파라포름알데히드(10 mL)로, 다른 일부는 글루타알데히드/오스뮴 테트록사이드(5 mL, 2.5%)에 고정하고, 나머지는 액체 질소에 보존하여 추가 분석을 수행합니다(재료 표 참조).
  3. 쥐의 복부 대동맥에서 혈액 샘플을 채취하세요. 3,000 × g 원심분리기, 4 °C에서 15분간 원심분리기; 상정액을 EP 튜브로 흡인하고; 분할 단위로 만들어 -80 °C에서 보관하세요.

6. 치유 평가

  1. 조사 후 7일, 15일, 30일, 45일에 상처를 관찰하고 고화질 카메라로 상처 표면 이미지를 촬영하세요. 이미지를 ImageJ에 불러와 상처 가장자리를 따라 상처 부위를 그립니다. 이미지 내 면적을 계산하세요. 측정 오차를 피하기 위해 각 작업이 일관성을 갖추도록 하세요. 상처 치유 시간과 치유 속도를 계산하세요.
    참고: 상처 치유율(%) = (초기 방사선 부위 - 미치유 상처 부위) / 초기 방사선 부적. 상처 치유 기준: 완전 치유는 상처 부위의 5% < 딱지가 있거나 상처 면적의 95% > 치유된 부위로 정의됩니다. 초기 방사선 면적: 방사선 동물이 안정된 상처(기준선)를 보인 시점에 측정된 상처 부적.

7. 전자현미경 검사

  1. 신속 조직 샘플링 및 고정
    1. 날카로운 칼날로 표피-진피층을 포함하는 1 mm³ 크기의 피부 조직 블록을 절단합니다.
    2. 즉시 표본을 사전 냉각된 2.5% 글루타알데히드 인산염 완충제(0.1 M, pH 7.4)에 4 °C에서 24시간 동안 담가 고정 시각 부탁합니다.
  2. 버퍼 세척
    1. 0.1M 인산염 완충제(pH 7.4)를 사용해 세 차례 세척을 수행하며, 각 세척마다 15분을 허용합니다.
  3. 고정 후
    1. 시료를 4°C의 1% 오스뮴 테트록사이드 용액으로 전환하여 1.5시간 동안 고정합니다.
  4. 경사 탈수
    1. 아세톤 농도는 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 점진적으로 통과하며, 각 단계마다 15분씩 할당합니다.
    2. 100% 아세톤으로 세 번 반복하며, 각 침지는 10분씩 지속됩니다.
  5. 에폭시 수지 임베딩
    1. 시료를 아세톤과 에폭시 수지의 2:1 혼합물에 2시간 담근 후, 순수 에폭시 수지에 하룻밤 담그세요.
    2. 시료를 60°C에서 48시간 동안 중합시켜 고체 블록을 만듭니다.
  6. 단선 절단과 염색
    1. 울트라미세톰을 사용해 70nm 초박 절편을 생성하세요.
    2. 우라늄 아세테이트로 15분간 염색한 후, 60°C에서 시트레이트 납으로 5분간 염색합니다.

8. 헤마톡실린-에오신(HE) 염색

  1. 파라핀 임베딩 수행
    1. 피부 샘플을 절제하고, 알코올 구배(예: 70%, 80%, 95% 에탄올을 각각 15분간 사용)를 사용해 탈수한 후, 100% 에탄올을 두 번 교환하여 각각 15분간 건조한 후 자일렌으로 옮겨 조직이 반투명 상태에 도달할 때까지 합니다.
    2. 파라핀에 담가서 잘 박히고, 그 후 굳어버리게 하세요.
  2. 왁싱과 수분 제거 실행
    1. 파라핀 절편을 자일렌 I/II에 각각 10분씩 담가.
    2. 자일렌을 100% 에탄올로 씻고, 95% 에탄올에 3분, 80% 에탄올에 3분, 70% 에탄올에 3분, 마지막으로 증류수로 헹구세요.
  3. 헤마톡실린 핵 염색 수행
    1. 해리스 헤마톡실린 용액에 실온에서 7분간 담가세요.
    2. 흐르는 물에 10분간 씻어서 파란색이 나타날 때까지 하세요.
  4. 구분 및 카운터 스테인을 구현합니다
    1. 에탄올에 1% 염산을 사용해 3초 동안 분별합니다(현미경으로 핵 투명도를 관찰).
    2. 0.5% 암모니아 용액으로 30초 동안 카운터 스텐트를 하세요.
  5. 에오신 카운터 스테인을 수행합니다
    1. 0.5% 에오신 용액(빙하 아세트산 포함)으로 90초간 염색합니다.
    2. 증류수로 5초간 빠르게 헹구면 얼룩이 남아나지 않아요.
  6. 탈수 및 정화 실행
    1. 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올 I/II(각각 1분씩)를 순차적으로 통과합니다.
    2. 자일렌 I/II로 각각 2분씩 클리어합니다.
  7. 밀봉 및 관찰 적용
    1. 중성 레진을 드롭 방향으로 바른 후 커버슬립으로 덮으세요.
    2. 현미경 검사 전에 60°C 오븐에서 30분간 건조하세요.

9. 마송의 트리크롬 염색

  1. HE 염색 전 단계와 비슷하게 정기적인 탈왁싱을 하세요.
  2. 핵 염색
    1. 헤마톡실린 용액에 10분간 담가두세요.
    2. 흐르는 물에 5분간 헹구면 파란색 빛이 다시 돌아오면 됩니다.
  3. 콜라겐 섬유 염색
    1. 알리자린 레드와 산성 푸신 혼합물에 5분간 담가보세요.
  4. 인산몰리브딘산 분화
    1. 1% 인산성 수용액에 1분간 옮깁니다.
  5. 근섬유의 변색
    1. 2.5% 아닐린 블루 용액에 5분간 직접 옮깁니다.
    2. 0.5% 빙하 아세트산 수용액으로 5초간 빠르게 헹구세요.
  6. 탈수와 마운팅
    1. 구배 에탄올 탈수를 실행하세요: 95% 에탄올 I, 100% 에탄올 II(각각 30초).
    2. 자일렌으로 클리어.
    3. 중성 수지를 사용해 60°C에서 건조한 후 현미경으로 관찰합니다.

10. IL-1β, IL-6, TNF-α 수치의 ELISA 검출

참고: IL-1β, IL-6, TNF-α은 염증의 존재와 강도를 평가하는 데 흔히 사용되는 중요한 염증 촉진 사이토카인입니다. 수치를 모니터링하는 것은 염증 과정을 파악하고 항염증 치료의 효과를 판단하는 데 매우 중요합니다.

  1. 혈청 샘플을 준비하세요
    1. 혈청 샘플을 채취하기 위해 5.3단계에 명시된 프로토콜을 따르세요.
  2. 희석 표준 및 샘플
    1. 샘플 희석제를 이용해 표준 값의 구배 희석을 만듭니다; 혈청 샘플을 1:4 비율로 희석합니다.
  3. 샘플을 추가하고 배양합니다
    1. 각 웰에 100 μL의 표준/시료를 주입합니다; 우물을 막으로 덮고; 37°C에서 90분간 배양; 그 후 액체를 버리고 웰을 닦아 말리세요.
  4. 항체-효소 반응 감지
    1. 각 웰에 IL-1β, IL-6, TNF-α에 특이적인 효소 표지 시약 100 μL을 투여합니다; 37°C에서 60분간 배양; 액체를 제거하고 닦아내며; 플레이트를 200 μL 세척 버퍼로 네 번 세척합니다.
    2. 각 웰에 100 μL 스트렙타비딘-HRP 작업 용액(1:100 희석)을 추가하고; 어두운 환경에서 37°C에서 30분간 배화; 플레이트를 200 μL 세척 버퍼로 네 번 세척합니다.
  5. 색을 현상하고 종료하세요
    1. 각 우물에 100 μL TMB 기판 용액을 주입합니다; 실온에서 어두운 상태에서 10분간 배양; 이후 각 웰에 50 μL의 스톱 용액을 추가합니다.
  6. 데이터 읽기
    1. 효소 결합 면역흡착 분석기를 사용해 450 nm(보정 파장 630 nm)에서 30분 이내에 흡광도를 측정합니다; 표준 곡선을 이용해 농도(PG/mL)를 계산합니다.

11. 튠 분석

  1. 절간 전처리
    1. 파라핀 부위는 증류수에 도달할 때까지 왁스를 제거하고 탈수하세요.
    2. 단백질분해효소 K 작동 용액을 20 μg/mL 농도로 주입하고, 37 °C에서 20분간 배큐합니다.
    3. 각 부위를 PBS로 세 번 세척하고, 각 세척 시간은 2분씩 지속됩니다.
  2. 라벨링 반응
    1. TdT 효소와 형광 표지된 dUTP를 포함한 TUNEL 반응 혼합물을 적용합니다.
    2. 37°C의 가습 챔버에서 어두운 상태에서 60분간 부화하세요.
  3. 신호 변환
    1. PBS로 세 번 세탁하고, 각 세척마다 5분을 허용하세요.
    2. HRP 표지된 항형광세인 항체를 1:500 희석으로 투여합니다.
    3. 37°C에서 30분간 배큐하세요.
  4. DAB 색합성 현상
    1. PBS 세척 후에는 DAB 염색 용액을 적용하고 현미경으로 1분에서 3분간 현상을 관찰합니다.
    2. 증류수를 사용해 반응을 멈추세요.
  5. 카운터 스테인과 마운팅
    1. 핵을 헤마톡실린으로 1분간 대염색합니다.
    2. 등급 에탄올로 탈수하고, 자일렌으로 투명한 후 중성 수지로 마운트하세요.
  6. 결과 해석
    1. 세포자멸 핵은 갈색빛이 도는 노란색으로 식별되며, 정상 핵은 파란색으로 보입니다.
    2. 슬라이드당 무작위로 다섯 개의 고출력 필드(400×)를 선택하여 세포자멸사 속도를 계산합니다.

12. 면역조직화학적 염색

  1. 왁싱 제거 및 항원 추출
    1. 파라핀 조각을 자일렌 I에 10분간 담가둔 후, 자일렌 II에 10분 더 담가세요. 그 후 100% 에탄올 I에서 5분, 100% 에탄올 II에서 5분, 95%, 80%, 70% 에탄올에서 각각 3분씩 각각 3분씩 가라디언트 에탄올 시리즈를 사용하여 탈수하고, 마지막으로 증류수로 2분간 세척합니다.
    2. 0.01M 시트레이트나트륨 완충제를 사용해 pH 6.0에서 고압 열수리를 수행하며, 3분 동안 121 °C 온도를 유지합니다.
  2. 내생성 간섭 차단
    1. 3% H2O2 용액을 실온에 10분간 투여하여 내인성 효소를 비활성화합니다.
    2. 5% BSA 차단액을 조직에 바르고 37°C의 가습 챔버에서 45분간 배양합니다; 과도한 차단액은 세척하지 않고 흡입하세요.
  3. 항체 배양
    1. 5% BSA 차단액을 분사하고 37°C에서 30분간 배큐합니다.
    2. 최적화된 농도(예: P53, Bax, Bcl-2, VEGF, bFGF)의 1차 항체 작동 용액을 첨가한 후 4°C의 가습 챔버에서 하룻밤 배양합니다; 0.1% Tween-20이 함유된 PBS-T 버퍼로 각각 5분씩 세 번 세척합니다.
    3. HRP 표지된 2차 항체를 1:200 희석하여 투여합니다; 37°C의 가습실에서 60분간 배양; PBS-T 버퍼로 세 번에 각각 5분씩 세척하세요. 그 다음 ABC 커벌게이트 용액을 추가하고 37°C에서 30분간 인큐베이팅한 후, PBS 버퍼를 사용한 세 번의 세척을 각각 5분씩 합니다.
  4. DAB 컬러 현상
    1. 0.02% H₂O₂를 포함한 DAB 현상 용액을 추가하고, 현미경으로 상온에서 1-4분간 현상을 관찰합니다.
    2. 즉시 증류수로 반응을 종료하세요.
  5. 카운터 스테인과 마운팅
    1. 샘플을 해리스의 헤마톡실린 용액에 1분간 담근 후 흐르는 물에 10분간 씻으면 푸른색 회복이 가능합니다.
    2. 다음 용액에 순차적으로 담그세요: 70% 에탄올을 30초, 80% 에탄올 30초, 95% 에탄올 30초, 100% 에탄올 I를 1분, 100% 에탄올 II를 1분간 담그세요.
    3. 완전한 정리와 고정을 위해 자일렌 I에 2분간 담근 후 자일렌 II로 옮기세요. 중성 레진 마운트를 매진 매체로 떨어뜨리고, 커버슬립으로 덮은 뒤 60°C 오븐에서 30분간 건조하세요.
  6. 결과 정량화
    1. 갈색은 긍정적인 반응을 나타내며; 양성 신호(갈색-노란색)는 음정 배경과 대조되어야 합니다.
    2. Image-Pro Plus 소프트웨어를 활용해 최소 5개 시야에서 양성 셀의 비율을 계산하세요.

13. 서부 블롯팅 검출

  1. 조직 용해 준비
    1. 액체 질소로 얼린 피부 조직을 -80°C에서 미리 냉각된 스테인리스 모르타르에 넣습니다; 증기를 줄이기 위해 액체 질소를 세 차례로 점진적으로 첨가합니다; 모든 입자가 더 이상 보이지 않을 때까지 수직으로 갈고; 생성된 분말을 용해 완충제가 포함된 EP 튜브로 옮깁니다.
    2. 프로테아제 억제제(1:100)와 인산효소 억제제(1:50)를 포함시키고; 30초 동안 빙판 위의 소용돌이; 초음파 교란을 수행하고; 흔들리는 인큐베이터에서 4°C에서 2시간 배양; 원심분리기 4°C, 14,000 g × 20분; 상정액을 조심스럽게 흡인하세요.
  2. 단백질 정량화 및 가공
    1. 5 μL의 상청액을 96웰 플레이트에 투여합니다; BCA 작동 용액 200 μL 추가; 어두운 환경에서 37°C에서 30분간 배화; 마이크로플레이트 리더기를 사용해 562 nm에서 흡광도를 측정하고; 표준 곡선에 따라 농도를 결정합니다.
    2. 5× 저축 단백질 로딩 버퍼를 단백질 용액과 4:1 비율로 결합합니다; 끓는 물에 15분간 넣어 변성시키고; -20 °C에서 보관하여 향후 사용을 위해 보관하세요.
  3. SDS-PAGE 전기영동
    1. 12% 아크릴아마이드 해상도 젤을 준비합니다; 젤을 빗 치아 아래 1cm 정도까지 부어줍니다; 공기 노출을 막기 위해 이소프로판올로 덮고; 고체 후 이소프로판올을 제거하고; 4% 농축 젤을 부으세요; 15웰 콤을 삽입하고; 상온에서 30분간 고체화를 허용하고; 로딩 웰에 5 μL 사전 염색된 단백질 마커를 추가하세요 1; 2번 우물에 20 μL 빈 용해액을 추가하고; 각 웰에 3에서 14까지 40 μg 단백질이 포함된 샘플 10 μL을 추가합니다.
    2. 80 V에서 전기영동을 시작; 브로모페놀 블루가 분리 겔로 이동하면 120 V로 전환; 10-15 °C의 온도를 유지하며 얼음과 물을 순환시키고; 브로모페놀 블루가 젤 바닥에서 0.5cm 떨어질 때까지 돌립니다.
  4. 습식 블롯 절차
    1. 20% 메탄올을 포함한 전이 버퍼를 준비합니다; 4°C로 미리 냉각합니다. PVDF 막을 메탄올에 1분간 담가하여 활성화시키고; NC 막을 완충 내로 평형으로 맞추세요. 전송 클램프를 다음 순서로 조립하세요: "음극판 - 스펀지 패드 - 필터 페이퍼 - 젤 - 멤브레인 - 필터 페이퍼 - 스펀지 패드 - 양극판"; 롤러로 기포를 철저히 제거하고; 목표 단백질 분자량에 따라 매개변수를 설정하세요: 50 kDa< 단백질의 경우 100 V의 일정 전압 전달을 60분간 사용; 50-100 kDa 단백질의 경우, 250 mA에서 90분 동안 일정한 전류 전달을 가합니다; 100 kDa> 단백질의 경우, 300 mA에서 120분 동안 일정한 전류 이동을 구현합니다; 4 °C 순환 수욕에 연결하세요.
  5. 면역 검출 절차
    1. 이식 후 PVDF 막을 메탄올에 1분간 담가; TBST로 세 번 각각 5분씩 세척; 막 표면에 3% H₂O₂/TBST를 덮어; 실온에서 어두운 상태로 15분간 배양; 액체를 흡입하고; 5% BSA/TBST 차단 솔루션 추가; 37°C 흔들리는 인큐베이터에서 1시간 동안 블록을 보관하고; 멤브레인을 TBST로 세 번, 각각 5분씩 세척하세요.
    2. 1차 항체 작용액(예: P53, Bax, Bcl-2, VEGF, bFGF)을 추가합니다; 진동하는 인큐베이터에서 4°C에서 하룻밤 배양; 멤브레인을 TBST로 4번, 각각 10분씩 세척합니다; HRP 표지된 2차 항체를 추가하고; 상온에서 흔들리는 인큐베이터에서 90분간 배큐; 멤브레인을 TBST + 0.5% SDS로 6번 각각 8분씩 세척하세요.
  6. 화학발광 영상
    1. ECL A와 B 용액을 같은 양으로 섞으세요; 멤브레인 표면을 균일하게 코팅하며; 어둠 속에서 60초 동안 반응을 일으켜 두고; 과잉 액체를 흡입하고; 강한 신호 단백질의 경우 1초에서 5초 사이의 단일 노출 시간을 설정하고; 약한 신호 단백질에 대해 5개의 구간(10/30/60/120/300초)으로 누적 노출을 수행; 화학발광 이미저를 사용해 이미지를 촬영합니다.
  7. 데이터 분석 워크플로우
    1. ImageJ 소프트웨어를 이용해 단백질을 정량화; 균일한 배경 뺄셈 임계값을 설정하고; 표적 단백질과 기준 단백질(β-액틴 또는 GAPDH)의 그레이스케일 비율을 계산합니다
    2. 분석을 위해 데이터를 GraphPad Prism으로 가져오세요.

14. 통계 분석

  1. 평균± 표준오차로 데이터를 제시합니다. 두 그룹 간 비교에는 독립적인 표본 t-검정을 사용하고, 여러 그룹 간 비교에는 일원 ANOVA를 활용합니다.
  2. SPSS 26.0과 GraphPad Prism 8.0.2를 사용하여 데이터를 분석하세요.
  3. P < 0.05를 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로 간주하라.

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결과

방사선 유발 피부 손상에 대한 Acorus calamus L.의 치료 효과
조사 후 15일 후, 모든 쥐 그룹에서 건조 벗겨짐, 국소적인 발적, 부기, 궤양, 딱지가 나타났습니다. 방사선 치료 후 30일째, 모델 그룹은 가장 심각한 피부 손상을 보였으며, 방사선 부위의 딱지와 궤양이 최고조에 달했습니다. 45일째 모델군은 딱지가 거의 벗겨지지 않았고, 상처에는 약간의 수축이 나타났습니다. 반면, Acorus calamus L. 및 양성 약물 치료 그룹은 피부 손상이 유의미하게 감소하고, 궤양이 가벼워지며, 상처 치유가 개선되고, 상피 덮개가 빨라졌습니다( 그림 1A 참조). 조사 후 45일 기준, 중용량 Acorus Calamus L. 그룹이 88.97%로 상처 치유율이 가장 높았고, 그 다음으로 고용량 Acorus calamus L. 그룹이 72.88%, 양성 대조군이 64.75%로 뒤를 이었습니다( ...

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토론

방사선 유발 피부 손상은 임상 암 방사선 치료에서 가장 흔하고 어려운 합병증 중 하나로 남아 있습니다. 가장 큰 기관이자 방사선의 첫 번째 표적인 피부는 방사선에 의해 생성되는 활성산소와 활성산소종에 의해 손상될 수 있으며, 이는 세포 분열, 이동, 분화 등 세포 기능을 저해하여 결국 상처 치유 지연과 조직 손상으로 이어질 수 있다20,21. 이러한 부상은 종종 홍반, 부종, 재발성 궤양, 괴사로 나타나며, 심한 경우 환자의 생명을 위협할 수 있습니다20,21. 방사선 유발 피부 손상에 대한 현재의 치료법은 특이성이 부족하여 효과적인 치료제를 찾는 것이 의학 연구의 주요 초점입니다. 전통 중국 약용 Acorus calamus L.은 항염증, 항산화, 항균 활성,...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 랴오닝성 과학기술계획 공동 계획(기술 대응 프로젝트)(2024JH2/102600273)과 북방극장병원 독립 연구 프로젝트(ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% 파라포름알데히드 고정 용액비오타임 바이오텍 주식회사(Beyotime), 중국어P0099
아코루스 칼라무스 L. 추출물사내에서 준비해당 없음;그리고 nbsp; 상세한 준비 절차는 프로토콜 4절에 설명되어 있습니다.
항백스 항체  그리고 nbsp;우한 서비스바이오 테크놀로지 유한회사 (우한, 후베이, 중국)GB11690
항-Bcl-2 항체우한 서비스바이오 테크놀로지 유한회사 (우한, 후베이, 중국)GB113375
항-bFGF 항체Proteintech Group, Inc.(중국 후베이 우한)11234-1-AP
항-P53 항체 우한 서비스바이오 테크놀로지 유한회사 (우한, 후베이, 중국)GB111740
항-VEGF 항체 우한 서비스바이오 테크놀로지 유한회사 (우한, 후베이, 중국)GB111971
BCA 단백질 분석 키트  우한 서비스바이오 테크놀로지 유한회사 (우한, 후베이, 중국)G2026-200T
베타메타손 크림그리고 nbsp; 유나이티드 제약주식회사(중국)해당 없음;농도: 0.1% w/w
국가 의약품 승인 번호: H19994057
에탄올상하이 알라딘 생화학 기술 유한회사.E111991Acorus calamus L. 추출물의 추출 용매로 사용되었습니다.
젤 및 블롯 이미징 시스템바이오-래드 연구소 주식회사 (허큘리스, 캘리포니아, 미국)케미닥 국회의원
헤마톡실린-이오신 염색 키트베이징 솔라비오 과학 및 테크놀로지 유한회사(중국 베이징)  그리고 nbsp;G1120
HRP 결합 염소 항토끼 IgG (H+L)우한 서비스바이오 테크놀로지 유한회사 (우한, 후베이, 중국)GB23303
역형광 현미경올림푸스 코퍼레이션 (도쿄, 일본)IX83  그리고 nbsp;
마손 s 트리크롬 스테인 키트베이징 솔라비오 과학 및 테크놀로지 유한회사(중국 베이징)  그리고 nbsp;G1340
마이크로플레이트 리더 (흡수, 형광, 발광 검출용)분자 장치 (샌호세, 캘리포니아, 미국)스펙트라맥스 iD3
페트롤라툼시노팜 화학 시약 유한회사(중국 상하이)해당 없음;그리고 nbsp; 의약품 등급의 화이트 페트롤라텀; 녹는점: 45-60 & deg; C;  국가 의약품 승인 번호: H31022350
쥐 IL-1&베타; 엘리사 키트  그리고 nbsp;비오타임 바이오텍 주식회사(Beyotime), 중국어PI303
쥐 IL-6 ELISA 키트   그리고 nbsp;비오타임 바이오텍 주식회사(Beyotime), 중국어PI328
쥐 TNF-&α; 엘리사 키트  그리고 nbsp;비오타임 바이오텍 주식회사(Beyotime), 중국어PT516
TUNEL 세포 세포자멸 탐지 키트 (DAB)비오타임 바이오텍 주식회사(Beyotime), 중국어C1091

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