생물학적 추출 필드 키트와 현장 qPCR 유닛을 이용한 현장 내 미생물 DNA 분석

Summary

신뢰할 수 있고 정확한 현장 배치 가능한 DNA 분석은 많은 산업에서 매우 중요합니다. 본 논문은 현장에서 환경 미생물 분석을 위한 두 가지 방법을 제시합니다: 1) 생물학적 추출 필드 키트를 이용한 환경 샘플에서 미생물 DNA를 분리하는 방법, 2) 현장 qPCR 유닛을 통한 DNA 분석.

Abstract

정량적 PCR(qPCR)이 산업 전반에 걸쳐 더 널리 채택됨에 따라, 원격 환경에서 물류 장애 없이 DNA를 추출하고 분석할 수 있는 능력이 필수적이 되고 있습니다. 명확한 예로는 열차 탈선이나 석유 유출로 영향을 받는 원격지에서 오염물질 분해 박테리아를 정량화하는 간단한 도구가 필요하며, 이를 통해 위험과 환경 영향을 시기적절하게 평가할 수 있습니다. 이를 신뢰성 있게 달성하기 위해서는 공정이 휴대가 간편하고 가볍고, 비과학자에게도 사용자 친화적이며, 오염에 강하고, 엄격한 품질 관리를 유지하면서도 빠른 결과를 낼 수 있어야 합니다. 핵산 추출과 qPCR 분석을 실험실 외부에서 수행할 수 있는 옵션이 수년간 존재해 왔지만, 최근에야 기술의 발전으로 신뢰할 수 있고 정확한 성능을 갖춘 현장 배치 가능한 시스템 개발이 가능해졌습니다. 본 연구에서는 실제 환경 조건에서 휴대용 qPCR 기기와 결합된 현장 DNA 추출 키트의 사용을 시연합니다. 약 30°C의 야외 환경 온도에서 실시된 현장 시험에서는 통제된 실험실 환경과 유사한 DNA 수율과 증폭 효율이 입증되었습니다. 특히, 현장에서 얻은 결과는 동등한 민감도와 재현성을 보여주어, 휴대용 워크플로우가 기존 실험실 인프라 없이도 고품질 데이터를 제공할 수 있음을 확인시켜 주었습니다. 이 발견들은 qPCR의 범위를 원격지와 자원 제한된 환경으로 확장하면서도 의사결정에 필요한 정확성과 신뢰성을 유지하는 분산형 분자 분석 가능성을 강조합니다.

Introduction

qPCR과 같은 분자 생물학적 분석을 고려할 때, 샘플 관리에는 여러 가지 한계가 있습니다. 명확한 예로는 열차 탈선이나 석유 유출로 영향을 받은 원격 현장에서 오염물질 분해 박테리아를 정량화하는 간단하고 신뢰할 수 있는 도구에 대한 수요가 있으며, 이는 환경 위험과 영향 ^1,2,3,4,5의 시기적절한 평가를 지원합니다. 주요 한계는 샘플을 아무리 차갑게 보관해도 미생물 군집이 시간이 지나면서 변할 수 있다는 점입니다 ^6,7. 샘플이 수집된 원래 환경을 정확히 반영하기 위해, 해당 샘플에서 DNA를 추출하는 것이 권장^됩니다. 해상 석유 플랫폼에서 미생물 샘플을 채취하는 엔지니어나 열대우림 깊숙한 곳에 있는 과학자에게는 이 일정은 현실적으로 불가능합니다. 이러한 외딴 장소에서 같은 날 내에 물이나 토양 샘플을 선하 회사에 전달한 뒤, 냉장 상태를 유지하면서 실험실로 하룻밤 보내 DNA를 추출한 후 분석하는 것은 불가능합니다.

DNA가 추출되면 시계가 멈추고, 샘플의 전체 유전 정보가 적절한^{저장 기법}으로 무기한 보존됩니다. 이로 인해 추출된 DNA는 대부분의 화학, 금속, 생물학적 샘플과 비교해 매우 독특합니다. 대부분의 샘플은 유통기한이 한정되어 있기 때문입니다. 보관된 DNA는 수년 또는 수십 년 후에 검색되어 새로운 플랫폼에서 새로운 표적을 분석할 수 있습니다. 따라서 추출된 DNA가 지연된 이동으로 변형된 DNA가 아니라 진정한 원래의 미생물 군집을 대표하는 것이 매우 중요합니다.

또한, 샘플을 추출하고 분석해야 하는 실험실의 요구는 샘플링 프로그램의 유연성과 일관성을 크게 제한합니다. 물류 비용만으로도^{일부 프로젝트에서는} 부담이 될 수 있습니다. 샘플을 분석하여 관심 있는 유전적 표적을 몇 시간 또는 몇 분 이내에 정량화할 수 있는 능력은 전 세계 환경 프로젝트에 많은 기회를 열어줍니다.

Protocol

참고: 다음 프로토콜은 바이오 추출 키트(생물학적 추출 필드 키트)와 FieldQuant qPCR(현장 기반 qPCR)을 사용하여 수행되었습니다.

1. 지하수에서의 바이오매스 샘플링과 캡슐화된 필터와 생물학적 추출 필드 키트를 이용한 DNA 분리 프로토콜

1. 1단계의 모든 단계에서 장갑과 안전안경을 착용하세요.
2. 연동 펌프와 튜빙을 준비하고, 환경보호청(EPA) 지하수 샘플링 지침¹¹에 따라 표준 부피 정화를 사용하여 우물을 정화하세요.
3. 제공된 원심분리관에서 캡슐화된 필터, 어댑터, 클램프, 캡을 제거하세요(그림 1).
4. 튜브(내경 1/4-5/16 [I.D.])를 제공된 클램프에 통과시키고, 호스를 잠금 루어 어댑터에 고정하도록 클램프를 조인다(그림 2).
5. 필터 흡입구를 이전 단계에서 설치된 루어-락 어댑터에 연결하세요.
6. 필터를 수용 용기 안에 넣어 정확히 여과된 물의 양을 측정할 수 있도록 하세요.
7. 저유량(분당 <0.5 L)으로 최대 1L의 물을 여과하세요. 여과되는 물의 양은 물의 탁도에 따라 달라집니다.
   1. 필터가 1L 필터를 걸러지기 전에 막히면 멈추고 다음 단계로 넘어가세요.
      참고: DNA 분석은 민감하며, 시스템의 생체량에 따라 최소 10mL로도 수행할 수 있습니다.
8. 필터를 통과한 부피를 밀리리터(mL) 단위로 수동으로 기록하세요. 정수된 물은 버리세요.
9. 양쪽 끝에 필터를 덮으세요. 얇은 쪽은 빨간색 캡으로 닫고, 두꺼운 쪽은 흰색 루어-락 플러그로 닫아야 합니다.
10. 필터를 제공된 플라스틱 튜브에 다시 넣으세요.
11. 라벨을 원심분리관에 붙이고, 필터를 통과한 물의 양, 위치, 샘플링 날짜, 요청된 분석 내용을 기록하세요. 추출할 때까지 1-4 °C에서 보관하세요.
    참고: 필터는 샘플링 후 24시간 이내에 추출해야 합니다.
12. 포함된 알코올 준비 물티슈를 사용해 추출 단계에 사용할 수 있는 평평한 표면(예: 나무 판자, 트럭 테일게이트 등)을 청소하세요.
13. DNA를 추출하기 위해 생물학적 추출 필드 키트의 모든 구성 요소를 평평하고 깨끗한 표면에 펼쳐 놓으세요(그림 3).
    1. 필터 양쪽 끝을 뚜껑을 열고 캡을 따로 두어 나중에 사용하세요. 키트에 포함된 3mL 주사기 중 하나를 찾아서 열어보세요. 3mL 주사기에 공기를 끌어들인 후 잠금 루어 연결부를 통해 필터에 연결하세요.
    2. 주사기에서 공기를 밀어내어 필터 밖의 남은 물을 밀어내세요. 주사기를 분리하고 공기를 더 들이마신 후 반복하세요.
    3. 필터에서 최대한 많은 물이 배출되도록 여러 번 반복하세요. 빨간색 콘센트 캡을 다시 확인해 보세요.
14. 닫힌 Solution A 주사기를 여러 번 뒤집어 잘 섞었는지 확인하세요. 루어 잠금 주사기 캡을 제거하세요.
15. 용액 A 주사기를 루어 잠금 팁을 통해 캡슐화된 0.2 μm 필터 입구에 연결하고, 플런저를 눌러 천천히 용액 A를 모두 첨가합니다. 너무 빠르게 밀면 역압이 생길 수 있으니, 플런저를 천천히 내리세요. 필터 막힘 때문에 용액 A가 첨가되지 않는다면, 필터의 빨간 출구 캡을 제거하고 다시 시도해 보세요. 필터를 다시 정리해 보세요.
16. 닫힌 필터를 5분간 힘껏 흔듭니다.
    참고: 피로를 방지하기 위해 이 단계까지 여러 샘플을 준비할 수 있으며, 모두 동시에 손으로 흔들 수 있습니다. 가능하다면, 손 악수 대신 충전식 소용돌이 믹서를 사용해 이 단계를 수행할 수 있습니다.
17. 닫힌 용액 B 주사기를 여러 번 뒤집어 잘 섞었는지 확인하세요. 주사기에서 루어 잠금 캡을 분리하세요.
18. 캡슐화된 필터 입구 캡을 제거하세요. 루어 락킹 팁을 통해 용액 B 주사기를 캡슐화된 필터 입구에 연결하고, 플런저를 눌러서 천천히 용액 B를 모두 추가하세요. 너무 빠르게 밀면 역압이 생길 수 있으니, 플런저를 천천히 내리세요. 필터 입구 캡을 다시 덮어보세요.
19. 닫힌 필터를 5분간 힘껏 흔듭니다.
    참고: 피로를 방지하기 위해 이 단계까지 여러 샘플을 준비하고 동시에 손으로 흔들 수 있습니다. 가능하다면, 손 악수 대신 충전식 소용돌이 믹서를 사용해 이 단계를 수행할 수 있습니다.
20. 흡입구 캡을 제거하세요.
21. 필터를 뒤집은 상태에서 캡슐화된 필터 유닛에 부착된 3mL 주사기를 사용해 1mL의 공기를 필터에 주입한 후, 플런저를 당겨 가능한 한 많은 용해액(액체)을 제거합니다.
    참고: 용해액이 특히 점성이 높은 경우, 필터에서 용액을 제거하기 위해 플런저를 여러 번 밀고 당겨야 할 수 있습니다.
22. 용해액을 5mL 비드 튜브에 넣으세요. 튜브를 덮고 상단에 파라필름으로 밀봉하세요.
23. 튜브를 5분간 힘차게 흔듭니다. 튜브를 세워 놓고 동작을 계속하세요.
    참고: 피로를 방지하기 위해 이 단계까지 여러 샘플을 준비할 수 있으며, 모두 동시에 손으로 흔들 수 있습니다. 가능하다면, 손 악수 대신 충전식 소용돌이 믹서를 사용해 이 단계를 수행할 수 있습니다.
24. 호일 상단 오염을 피하면서 샘플 준비 카트리지를 평평한 표면 위에 놓으세요.
25. 1mL 주사기를 포장에서 꺼내고, 루어 잠금 가능한 컬럼을 주사기 끝에 나사로 고정하세요. 컬럼의 뾰족한 끝을 사용해 샘플 준비 카트리지 첫 부분에 두 개의 구멍을 뚫습니다.
    주의: 카트리지의 일부 부분에는 혼돈성 염 및/또는 에탄올이 포함되어 있습니다. 장갑과 안전안경을 착용하세요.
26. 플라스틱 부피 피펫을 사용해 비드 튜브에서 1mL의 용해액(액체만으로, 구슬을 최대한 많이 옮기지 않음)을 첫 번째 샘플 준비 카트리지 구간의 새로 뚫은 구멍으로 옮깁니다. 최상의 결과를 위해서는 피펫팅할 때 용해액을 약간 각도를 두고 천천히 넣으세요.
27. 주사기 칼럼을 다시 카트리지의 빨간 부분에 넣으세요. 액체를 완전히 주사기로 빨아들인 후 밀어내세요. 이 펌프 동작을 10번 반복하세요.
28. 다음 단계로 넘어가기 전에 주사기에서 모든 액체를 밀어내어 카트리지의 붉은 부분으로 다시 넣으세요. 액체가 한 구간에서 다른 구간으로 옮겨져서는 안 되며, 이는 샘플 DNA 분리 프로토콜의 남은 모든 단계에 적용됩니다.
29. 주사기 기둥의 뾰족한 끝을 붉은색-주황색 부분 위에 위치시키고, 호일 장벽에 구멍 두 개를 뚫으세요. 플런저를 사용해 주사기의 전체 용량을 빼내고, 액체를 주사기 안으로 완전히 끌어올린 뒤 다시 펌프로 빼내세요. 이 과정을 한 번 반복해서 총 2번 펌프를 통해 모든 액체를 밀어내세요. 다음 단계로 액체를 옮기지 마세요.
30. 주사기 기둥의 뾰족한 끝을 주황색 부분 위에 위치시키고 호일 장벽에 구멍을 두 개 뚫으세요. 플런저를 사용해 주사기의 전체 양의 액체를 주사기로 끌어당기고 다시 완전히 펌프로 빼내세요. 다음 단계로 액체를 옮기지 마세요.
31. 주사기 기둥의 뾰족한 끝을 노란색 부분 위에 위치시키고 호일 장벽을 두 번 뚫어. 플런저를 사용해 주사기의 전체 양의 액체를 주사기로 끌어당기고 다시 완전히 펌프로 빼내세요. 다음 단계로 액체를 옮기지 마세요.
32. 주사기 기둥의 뾰족한 끝을 파란색 공기 건조 부분 위에 위치시키고, 호일 장벽을 한 번만 뚫어 넣으세요. 플런저를 사용해 주사기의 공기를 모두 주사기로 끌어들인 후 빠르게 다시 펌프로 빼내세요. 이 펌핑 동작을 최소 20번 빠르게 반복하여 컬럼이 마른 것처럼 보일 때까지 반복하세요.
33. 주사기 기둥의 뾰족한 끝을 마지막 녹색 부분 위에 위치시키고 호일 장벽을 두 번 뚫습니다. 플런저를 사용해 주사기의 전체 양의 액체를 주사기로 끌어당기고 다시 완전히 펌프로 빼내세요. 이 과정을 총 5번 펌프로 반복합니다.
34. 1 mL 주사기와 샘플 준비 컬럼을 사용해 녹색 구간의 모든 용액을 잘 표지된 1 mL 마이크로튜브로 옮깁니다 - 이것이 현장에서 추출한 DNA 샘플입니다. 1-10°C(예: 냉장기에서 얼음/얼음찜질을 넣어 보관하거나, 냉장고 등)에서 최대 일주일 또는 사용 전까지 보관하세요.
    참고: 장기 보관의 경우 DNA 샘플은 -20 °C에서 무한정 보관할 수 있습니다.

2. 현장 qPCR 유닛을 이용한 현장 기반 qPCR 분석 프로토콜

참고: 현장 기반 qPCR 기기와 기기를 제어하는 휴대폰은 충전식 배터리에 의존합니다. 필드로 이동하기 전에 두 기기 모두 완전히 충전되었는지 확인하세요.

1. 최대 세 개의 현장에서 추출한 DNA 샘플을 트레이의 순수 샘플 슬롯에 배치합니다. 각 섹션마다 샘플이 하나 있는지 확인하세요: 슬롯 1, 2, 3에 샘플 하나, 슬롯 4, 5, 6에 샘플 하나, 슬롯 7, 8, 9에 샘플 하나씩 넣어야 합니다.
2. 각 샘플의 분석 스트립을 트레이의 해당 A, B, C 스트립 슬롯에 배치합니다. 스트립의 첫 번째 웰을 트레이의 첫 번째 슬롯과 맞춰 보세요.
3. 휴대폰 잠금을 해제하고 qPCR 상표 기기 이름을 딴 애플리케이션을 엽니다. 전화기와 현장 qPCR 장치는 통합된 단거리 무선으로 연결됩니다. 앱이 열리면 실행 시작 버튼을 누르세요.
   참고: 애플리케이션은 포함된 휴대폰에 미리 설치되어 있어 다른 곳에서 다운로드할 수 없습니다.
4. 다음 화면에서 'ID 생성 ' 버튼을 탭하세요.
5. 다음 화면에서는 각 샘플의 샘플 정보가 입력됩니다; Sample ID 아래를 탭하고 샘플 이름을 입력하세요.
   1. 샘플 단위를 채취하여 추출에 사용된 샘플 유형에 맞는 부피 단위(그램 [g], 밀리리터 [mL], 또는 면봉)를 선택합니다.
   2. 그 다음 샘플 양 아래에 탭하고 위 현장 추출에 사용된 샘플 부피(예: 여과된 밀리리터 수)를 입력합니다. 이 과정을 나머지 두 샘플에 대해 반복합니다.
   3. 모든 샘플 정보를 입력한 후 계속 버튼을 누릅니다.
      참고: 샘플 ID를 기본값으로 두고, 아무 단위를 선택해 샘플 양 줄에 1을 입력해 사용하지 않은 샘플을 진행하세요.
6. 다음 화면에서 폴더를 탭하세요. 다음 화면으로 이동해서 현재 폴더로 저장 을 탭하세요.
7. 다음 화면에서 런 이름을 입력하고 확인 버튼을 탭하세요.
8. 악기 왼쪽 상단에 위치한 전원 버튼을 누르고 누른 상태에서 전면의 모든 불빛이 켜질 때까지(~5초) 작동시킵니다. 그다음 앱에서 확인 을 눌러 계속 진행하세요.
9. 다음 화면에서 통합 단거리 무선으로 탭 연결하세요. 기기 상단에 있는 통합 단거리 무선 버튼(익숙한 상표 기호)을 눌러 파란 불빛이 깜빡이기 시작할 때까지 누르세요. 확인 을 탭하고 앱과 악기가 동기화될 때까지 기다리세요. 동기화가 완료되면 앱에서 기기 이름을 탭해 선택하고, 연결 버튼을 누르면 분석 스트립을 로딩할 수 있습니다.
   참고: 기기와 앱이 처음에 동기화되지 않았다면, 기기에 장착된 단거리 무선 조명이 계속 깜빡이고 다시 스캔을 탭하세요.
10. 분석 스트립의 캡을 제거하기 전에, 동전 식품 펠릿이 분석 스트립 웰 상단에 있지 않은지 확인하세요. 만약 그런 경우, 펠릿이 우물 안으로 더 아래로 떨어지도록 우물 바닥을 살짝 튕기세요.
11. 첫 샘플을 위해 고스트랩 튜브의 캡을 제거하세요. 분석 스트립의 첫 번째 웰에 멸균수 18μL를 추가하고, 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 펠릿을 녹입니다. 남은 두 개의 우물도 반복합니다.
12. 각 웰에 2μL의 샘플을 추가하고, 튜브에 고무 분석 스트립 캡을 삽입하여 캡 사이의 홈이 트레이 뒤쪽을 향하도록 하여 튜브를 밀봉합니다. 필요하다면 나머지 샘플에 대해 2.10-2.12 단계를 반복하세요. 모든 분석 스트립이 채워지고 스트립 캡으로 밀봉되면, 앱에서 확인 을 탭하세요.
13. 각 분석 스트립을 하나씩 제거하고 웰 바닥의 기포를 확인하세요. 웰 바닥에 기포가 있다면, 조각을 부드럽게 앞뒤로 흔들어 기포가 웰 상단 쪽으로 올라가도록 하세요. 모든 웰을 점검한 후 앱에서 확인 을 탭하고 스트립을 기기에 적재하세요.
14. 기기 뚜껑을 열고 분석 스트립을 트레이에 있는 순서와 방향대로 현장 qPCR 기기에 넣으세요. 웰의 경첩과 캡 사이의 홈이 기기 뒤쪽을 향하도록 합니다. 모든 스트립을 추가한 후에는 뚜껑을 살짝 눌러서 잠기고 확인 버튼을 누르세요.
15. 앱에서 실행 시작 버튼을 탭하세요.
    참고: 달리기는 시작되며, 미리 설정된 달리기 조건을 기준으로 완료하는 데 ~45분 정도 걸립니다. 이 조건들은 편집할 수 없습니다.
16. 달리기가 끝나면 결과를 이메일로 탭하세요. 휴대폰이 와이파이에 연결되면 분석 및 보고를 위해 결과가 전송됩니다; 그때까지 결과는 기기에 저장됩니다.
    1. 와이파이에 연결되면 사용자는 결과를 전송하기 위해 다시 전송 버튼을 눌러야 합니다.
17. 샘플 간 오염을 방지하기 위해 트레이를 세척하세요.
    참고: 출력은 각 우물의 사이클 임계값(Ct) 값을 포함하는 엑셀 파일 형태입니다. 이 결과는 실험실로 보내져 증폭 품질을 검사하고, 각 qPCR 표적에 특화된 검증된 표준 곡선과 원래 샘플의 부피 및 행렬을 바탕으로 Ct 값을 풍부도로 변환합니다. 이 결과는 전자 산출물과 PDF로 사용자에게 전송됩니다.

Results

대표적인 환경 샘플에서 DNA 추출은 생물학적 추출 필드 키트와^{이전에 설명한} 고도로 검증된 실험실 기반 방법을 모두 사용하여 수행되었습니다. 그림 4에 나타난 바와 같이, qPCR 결과와 검증된 실험실 기반 추출 방법을 비교하여 필드 키트를 이용한 DNA 분리가 성공적으로 완료되었음이 확인되었습니다. 이러한 일관성은 현장에서 환경 샘플의 DNA 무결성을 보존한 방법을 확인시켜 줍니다.

현장 qPCR 키트의 구성 요소는 그림 5에 나와 있습니다. 현장 qPCR 장치를 이용한 표준 Dehalococcoides(DHC) 배양 희석 분석을 실내(21 °C)와 실외(30 °C) 온도에서 수행하여 실제 현장 조건에서의 기기 견고성을 입증하였습니다. 그림 6에서 볼 수 있는 결과는 각 반복 10회에서 편차가 낮음을 보여줍니다. 전체 맥락을 설명하자면, DHC는 염소화 용매를 분해할 수 있는 유기체이며, 환경 복원 산업에서 qPCR을 통해 일반적으로 정량화됩니다^.

기기의 정밀도를 검증하기 위해 DHC는 10개의 현장 qPCR 기기를 중복 측정하여 세 가지 농도에서 분석하였습니다(그림 7). 낮은 개체 수치에서도 상대 표준편차는 모든 런에서 5% 미만으로 낮게 유지되었습니다. 표준편차와 비교할 때, 상대 표준편차는 로그 데이터에 중요한데, 이는 다음 식으로 결과를 정규화하기 때문입니다:

RSD는 상대 표준편차이고, σ는 데이터셋의 표준편차, μ는 데이터셋의 평균입니다.

이 논문에 포함된 두 방법은 복제 현장 추출과 qPCR 분석에서 재현 가능한 결과를 제공합니다. 현장 및 실험실 추출과 qPCR 분석의 일치는 실험실 인프라에 의존하지 않고도 신뢰할 수 있고 고품질의 데이터를 얻을 수 있음을 보여주며, 원격지이거나 자원이 제한된 환경에서도 미생물 분석을 수행할 수 있게 합니다.

그림 1: 캡슐화된 필터 키트 구성 요소. 캡슐화된 필터는 수질 샘플에서 바이오매스를 걸러내는 데 사용됩니다. 튜빙을 통해 연동 펌프에 연결하여 물이 필터를 통과합니다. 물의 총 부피를 기록한 후 물을 버리고 필터에 수집된 생체량은 DNA 추출 준비가 됩니다. 구성 요소: a. 필터와 부품을 사용 전후 고정하는 멸균 튜브, b. 유입구 캡, c. 호스 클램프, d. 루어 잠금 튜빙 연결 어댑터, E. 캡슐화된 필터, F. 고무 출구 캡. 이 이미지는 Microbial Insights, ^Inc.12의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 필터와 튜빙 연결부. 튜빙은 루어 락킹 튜빙 연결 어댑터 위에 밀려 들어가고, 호스 클램프로 고정됩니다. 튜빙의 다른 쪽 끝은 연동 펌프에 연결되어 있는데(이 연결과 펌프 작동은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다). 이 이미지는 Microbial Insights, ^Inc.12의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: DNA 분리 현장 키트 구성 요소. 모든 부품은 사용 전에 멸균됩니다. 구성 요소는 다음과 같습니다: (1) 캡슐화된 필터 키트(자세한 내용은 그림 1 참조), (2) 3 mL 주사기, (3) 용액 A가 미리 적재된 1 mL 주사기, (4) 용액 B가 미리 적재된 캡 주사기, (5) 3 mL 주사기, (6) 실리콘 비드 튜브, (7) 격리 컬럼이 장착된 1 mL 주사기, (8) 1 mL 일회용 이송 피펫, (9) DNA 분리 샘플 준비 카트리지, (10) 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브. 사진에는 없었습니다: 흔들 때 밀봉하는 파라필름 스퀘어와 추출 표면을 청소하는 알코올 준비용 물티슈입니다. 이 이미지는 Microbial Insights, ^Inc.12의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 실제 샘플을 사용한 현장 추출 비교. 실험실 방법(빨간 막대)과 생물학적 추출 현장 키트(파란 막대)를 사용한 두 대표 샘플에서 분리된 DNA의 qPCR 비교 결과입니다. 이들은 표준 qPCR 분석에서 기대되는 것과 달리 복제 분석이 이루어지지 않았습니다. 유전자 표적(x축)은 두 방법 모두에서 100배 이내의 풍부도(y축)를 보입니다. 각 특정 유전자 표적에 대한 정보는 이 논문의 범위를 벗어나 포함되어 있지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 현장 기반 qPCR 기기 및 부품. 구성 요소는 다음과 같습니다: A. 현장 기반 qPCR 기기, B. 샘플 준비 트레이, 동충 시약을 포함한 C. 분석스트립, 기기 실행에 사용되는 애플리케이션이 미리 로드된 D. 폰. 이 이미지는 Microbial Insights, ^Inc.12의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 현장 qPCR 견고성 시연. Dehalococcoides(DHC) 표준은 실외(30°C, 빨간 막대)와 실내(21°C, 파란색 막대) 온도 조건에서 10회 복제 분석되어 현장에서의 신뢰성을 입증했습니다. 복제 실행 횟수는 x축에, 계산된 DHC 풍부도는 y축에 표시됩니다. 내부(20 °C) 평균은 4.92 × 10² 세포/mL, SD = 1.14 × 10² 세포/mL(n = 10)로 계산되었고, 외부(30 °C) 평균은 5.89 × 10² 세포/mL, SD = 1.80 × 10² 세포/mL(n = 10)로 계산되었습니다. 20 °C와 30 °C에서 측정값은 유의미한 차이가 없었다(웰치 t-검정, p = 0.17). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: 현장 qPCR 정밀도 시연. 10개의 서로 다른 기기 간 정밀 성능이 세 가지 서로 다른 표준 농도로 복제되어 반복됩니다. 진짜 값과 복제 수(각 표준 농도에서 10개의 기기에 대해 n = 2)는 x축을 따라 표시되며, 현장 단위별로 색깔 막대가 표시됩니다. y축은 각 유행에 대한 계산된 풍부도를 나타냅니다. 각 표준 농도별 상대 표준편차의 백분율은 막대 위의 점선에 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

이 프로토콜의 중요한 특징은 실험실 인프라나 전기 없이도 현장 조건에서 미생물 DNA 추출과 qPCR 분석을 가능하게 한다는 점입니다^. 이 방법은 휴대성과 신뢰성의 균형을 맞추도록 최적화되어, 야외에서 주변 온도 범위¹² 하에서도 실험실 기반 워크플로우와 일치하는 재현 가능한 결과를 제공합니다. 권장 사용 범위는 4 °C에서 95 °C(39 °F에서 104 °F)이며, 현장 승무원의 표준 야외 온도(30 °C, 86 °F)에서의 비교는 신뢰할 만한 일관성을 보여줍니다(그림 6). 이러한 일관성은 현장 결과가 실험실 데이터셋과 함께 해석 가능하도록 보장하는 데 필수적입니다.

프로토콜 성공에는 여러 단계가 매우 중요합니다. 추출 과정 중에는 필터에서 액체를 완전히 제거하고 시약을 철저히 혼합하는 것이 효율적인 용해와 DNA 회수를 보장하는 데 중요합니다. 마찬가지로, 비드 이월을 최소화하면서 샘플 준비 카트리지에 용해액을 신중히 옮기는 것이 막힘이나 컬럼 고장을 방지하는 핵심입니다. 문제 해결 전략으로는 플런저 압력 감소를 늦추어 역압을 줄이고, 점성 용해액이 액체 이동을 방해할 경우 주사기 펌프를 반복하는 것이 포함됩니다. qPCR의 경우, 분석관 내 기포를 피하고 펠릿 재현탁을 완전히 하는 것이 정확한 증폭에 매우 중요합니다.

장점에도 불구하고 이 방법에는 한계가 있습니다. DNA 수율은 벤치 위 원심분리 기반 키트보다 낮을 수 있으며, 탁하거나 유기물이 풍부한 샘플은 컬럼 성능을 위협할 수 있습니다. 이 격리 키트는 실험실 경험이 전혀 없는 사용자도 누구나 간단하고 쉽게 사용할 수 있지만, 현장에서 경험이 부족한 사람과 비교할 때는 추가적인 오류 위험이 있습니다. 또한, 현장 qPCR 유닛은 빠른 결과를 제공하지만, 표준 열순환기와 비교해 동시에 반응 수가 제한되어 있습니다(현재 한 번에 9개의 유전자 표적 처리로 제한). 그러나 이러한 한계는 분석 속도와 현장에서 미생물 군집 프로필을 포착할 수 있는 능력으로 상쇄됩니다. qPCR 표적을 분석할 수 있는 본질적인 제한은 실험실 카탈로그 외에는 없습니다.

이 방법의 중요성은 분자 분석을 동원하여 유전, 농업 현장, 원격 생태계 등 환경에서 미생물 개체군을 실시간으로 모니터링할 수 있다는 점에 있습니다. 샘플링 지점에서 DNA 무결성을 유지하고 현장에서 결과를 생성함으로써 이 접근법은 물류 장벽을 줄이고 데이터 품질을 향상시키며 신속한 의사결정을 가능하게 합니다. 향후 응용 분야로는 공중보건 내 병원체 감시, 생물복원 진행 상황 모니터링, 또는 수자원 시스템 내 미생물 위험 평가가 포함될 수 있습니다. 약간의 수정만으로도 플랫폼은 추가 분자 표적과 신흥 qPCR 분석에 지속적으로 적응할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5/16" 실리콘 튜브	아마존 (www.amazon.com)	796753613221	대체 모델도 허용될 수 있습니다
쿨러	스테이플스 (www.staples.com)	24299978	대체 모델도 허용될 수 있습니다
DNA 분리 현장 키트	미생물 인사이트스(Microbial Insights, Inc.)	https://microbe.com/bio-extract/	독점
현장 qPCR 유닛과 액세서리	미생물 인사이트스(Microbial Insights, Inc.)	https://microbe.com/fieldquant/	독점
장갑	아마존 (www.amazon.com)	크기에 따라 다릅니다	대체 모델도 허용될 수 있습니다
지하수 여과 장치	미생물 인사이트스(Microbial Insights, Inc.)	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
얼음	지역 편의점	NA
카모어 DIP1500 연동 펌프 24 V 1500 mL/분 히그	아마존 (www.amazon.com)	701705886813	대체 모델도 허용될 수 있습니다
니들노즈 플라이어	아마존 (www.amazon.com)	762983170575	대체 모델도 허용될 수 있습니다
종이 타월	스테이플스 (www.staples.com)	2126874	대체 모델도 허용될 수 있습니다
안전 안경	아마존 (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	대체 모델도 허용될 수 있습니다
샤피 파인 팁 마커	아마존 (www.amazon.com)	71641300033	대체 모델도 허용될 수 있습니다