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방법 논문

최적화된 포화 세척 수집 방법을 이용한 애기장대 잎의 식물 세포외 소포 분리 및 정제

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69715

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2026년 3월 24일

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 잎에서 세포외 소포(EV)를 분리하여 분자 및 기능 분석을 지원하는 최적화된 방법을 설명합니다.

초록

세포외 소포(EV)는 다양한 생물과 세포 유형에서 분비되는 막에 묶인 나노입자로, 점점 더 세포 간 및 계 간 소통의 중요한 매개체로 인식되고 있습니다. 포유류 시스템에서 전기공학 생물학이 잘 확립되어 있지만, 식물 EV 연구는 비교적 최근에 시작되며 빠르게 확장되고 있습니다. 이는 식물 EV가 면역과 식물-미생물 상호작용에 관련된 작은 RNA, mRNA, 단백질 및 기타 화물을 전달할 수 있다는 증거에 의해 촉진되고 있습니다. 그러나 고순도 식물 EV를 분리하는 것은 단단한 세포벽, 풍부한 2차 대사산물, 그리고 세포질 체액 수집 중 세포질 오염 위험 때문에 기술적으로 여전히 어렵습니다. 이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 잎 조직에서 식물 EV를 분리하고 정제하는 효율적인 워크플로우를 제시합니다. 세포 손상과 세포질 누출을 최소화하기 위해 부드러운 주사기 침윤 단계를 사용하며, 잎자루/혈관 조직 없는 개별 잎을 사용하면 혈관 관련 및 세포 내 내용물로 인한 오염을 줄이는 데 도움이 됩니다. EV는 처음에 차동 원심분리로 농축되며, 자당 밀도 구배 분획 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 추가 정제할 수 있습니다. 이 프로토콜은 나노입자 추적 분석과 투과 전자현미경을 통해 평가하여, 세포 손상과 세포질 누출을 최소화하여 구조적 완전성을 보존하고 세포 오염을 줄인 EV를 제공합니다. 이 EV 샘플들은 RNA 프로파일링, 단백질체학, 식물-미생물 상호작용 연구를 위한 기능적 분석법 등 후속 응용 분야에 적합합니다. 전반적으로 이 방법은 고품질 공장 전기차를 얻기 위한 재현 가능하고 적응 가능한 접근법을 제공합니다.

서론

세포외 소포(EV)는 박테리아부터 인간에 이르기까지 다양한 생물체가 분비하는 지질 이중층 결합 막 입자입니다 1,2. 동물 시스템에서는 EV가 생합성 경로와 크기3에 따라 외국체, 미세소포, 세포자멸체로 분류되는 경우가 많습니다. 엑소좀(~30-150 nm)은 다소포체(MVB)가 원형질막과 융합하여 내광소포4가 방출되고, 미세소포(~100-1000 nm)는 형질막에서 직접 발아됩니다. 외국체와 미세소포 외에도, 포유류 세포는 세포자멸 세포를 생성하며, 이는 프로그램된 세포 사멸 과정에서 방출됩니다6. 이 소포들은 면역 조절, 종양 진행, 치료 전달에 관여하여 집중적인 생의학 연구 대상이 되었습니다 7,8. 식물에서는 EV 분류가 동물보다 덜 명확합니다. 애기장대 탈리아나 연구에서는 단백질 마커, 크기, 추정되는 생합성 경로의 차이를 바탕으로 여러 식물 EV 아형을 확인했습니다. 여기에는 다소포체에서 유래한 엑소좀 유사 소포로 간주되는 테트라스패닌(TET) 양성 EV, 신택신 단백질 Penetration 1(PEN1) 양성 EV11, 엑소시스트 양성 소기관(EXPO) 유래 EV12,13, 그리고 자가포식 관련 EV14와 꽃가루15 등 기타 EV 집단이 포함됩니다.

점점 더 많은 증거가 식물이 병원체에 대한 방어 전략의 일환으로 전기차를 분비한다는 것을 시사합니다. 식물 EV는 작은 RNA, mRNA 및 기타 조절 분자를 포함한 다양한 분자 화물을 전달하여 곰팡이 및 난균류 병원체의 병원성을 억제합니다 10,16,17,18,19. 이 발견들은 EV가 'RNA 전쟁'의 매개체임을 강조하며, 식물이 병원체 유전자 발현을 직접 억제할 수 있게 하여 작물 보호에 중대한 영향을 미치는 메커니즘을 보여준다20. 면역 외에도, 식물 EV는 세포벽 재형성, 스트레스 반응, 발달 신호 전달에도 기여할 수 있다21. 표준화된 분리 및 특성화 프로토콜이널리 확립된 동물 EV 연구와 달리, 식물 EV 분야는 아직 초기 단계에 있습니다. 이로 인해 연구 간 재현성과 비교 가능성이 제한되어, 이러한 소포를 분리하고 연구할 견고하고 표준화된 방법론이 시급히 필요합니다.

식물 EV를 분리하는 것은 동물 시스템에서는 경험하지 못한 독특한 기술적 도전 과제를 제시합니다. 손상된 식물 조직에는 풍부한 2차 대사산물, 세포벽 파편, 그리고 EV와 함께 정제될 수 있는 소기관 조각이 포함되어 있어 후속특성 분석을 복잡하게 만듭니다. 더불어, 식물 EV 격리 및 정제의 출발 물질로 흔히 사용되는 아포플라스틱 세척액(AWF)은 종종 소포와 오염물질의 불균일 혼합물을 생성합니다24. 차동 원심분리는 여전히 널리 사용되는 기초 접근법이지만, 구별되는 EV 하위 집단을 완전히 분리하거나 공분리된 고분자 복합체에서 EV를 분리할 수는 없다25,26. 최근 리뷰와 방법론 연구들은 식물의 EV 격리 및 특성 분석에 중요한 지침과 모범 사례를 제공했습니다 27,28,29,30,31. 그럼에도 불구하고 이러한 접근법의 실용적 구현과 통합은 여전히 어렵으며, EV의 순도와 재현성을 높이기 위해서는 밀도 구배 원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 추가 정제 단계가 종종 필요합니다.

여기서는 다단계 정제 전략을 사용하여 Arabidopsis apoplastic 세척액에서 EV를 분리하는 간소화된 프로토콜을 제시합니다. 진공 펌프를 이용한 전체 식물 침투에 의존하는 일반적으로 사용되는 식물 EV 분리 방식과달리, 이 프로토콜은 혈관 및 혈관 조직의 포함을 방지하여 혈관 구조 오염을 증가시킬 수 있습니다. 대신 분리된 잎날과 부드러운 주사기 기반 침투 방법을 사용하여 세포 조직 파괴를 최소화하면서 아포플라스트 수집을 개선합니다. 신중한 잎 취급, 방향 조정, 원심분리 조건은 세포 내 성분 오염을 더욱 줄여 EV 격리를 위한 더 깨끗한 출발 물질을 제공합니다. 차동 원심분리 후에는 자당 밀도 구배 분획 또는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 더 높은 소포 순도와 해상도를 달성할 수 있습니다. 결과적으로 만들어진 EV 제제는 RNA 시퀀싱, 단백질체 프로파일링, 병원체 상호작용 및 EV 흡수 연구와 같은 기능적 분석법 등 후속 응용에 적합하여 식물 EV 연구에서 재현성과 해석 가능성을 높입니다.

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프로토콜

참고: EV의 무결성을 유지하기 위해 4°C의 냉장 원심분리기 내에서 원심분리 과정을 수행하세요. 멸균 튜브를 사용해야 합니다. 모든 샘플 취급 단계는 신속하고 효율적으로 수행되어야 하며, 이상적으로는 여러 사람이 병행하여 조직 손상을 최소화하고 전기차 품질을 저해할 수 있는 오염을 방지해야 합니다.

1. 잎 준비 및 침투

  1. 20 mM MES 하이드레이트, 2 mM CaCl2, 0.1 M NaCl, pH 6으로 구성된 1L 소포 분리 완충제(VIB)를 준비합니다.
  2. 잎 가장자리의 잎 가장자리는 잎 밑부분을 잘라 잎자루를 제거해 수확하세요.
    참고: 충분한 EV 수확을 위해 각 처리형 또는 유전자형당 최소 100그루의 4주 된 식물을 권장합니다. 애기장대는 8시간 빛/16시간 어둠 주기 동안 재배되었습니다. 잎 백백이나 시들어 보이는 스트레스 징후가 보이는 잎은 사용하지 마세요.
  3. 잎을 역삼투압(RO) 물로 세 번 씻어내세요. 종이 타월 위에 올려놓고 부드럽게 두드려 말리세요.
  4. 약 50mL의 잎을 120mL 주사기에 주입하세요. 주사기를 가볍게 두드려 잎을 가라앉히세요.
  5. 잎이 완전히 담글 때까지 약 60mL의 VIB를 주사기에 넣으세요. 플런저를 부드럽게 눌러 갇힌 공기를 배출하세요. 주사기 끝에 접힌 파라필름 조각을 네 번 눌러 누설을 방지하세요.
    참고: 주사기 기반 진공 침투를 수행할 때는 진공 적용 전에 주사기와 플런저가 단단히 조립되었는지 반드시 확인하세요. 점진적으로 힘을 가하고 주사기를 단단히 잡아 갑작스러운 플런저 움직임이나 제어 상실을 방지하세요.
  6. 플런저를 천천히 바깥쪽으로 당겨 진공을 만들어 잎을 침투시킵니다. 플런저를 5초 동안 펴진 상태로 유지한 후 천천히 놓으세요. 이 침투 과정을 2-3번 반복하여 잎이 더 어둡고 반투명해 보일 때까지 반복하여 성공적인 침투를 나타냅니다.
  7. 참고: 플런저를 당기려면 진공 저항 때문에 중간 정도의 힘이 필요합니다. 플런저를 천천히 빼내는 동안 주사기는 단단히 잡아야 조절된 침투를 유지할 수 있습니다.
  8. 잎이 침투되면 플런저를 빼세요. 남은 완충제를 싱크대에 부어주세요.
  9. 수확된 잎이 모두 침투될 때까지 1.4-1.7단계를 반복합니다(그림 1A).

2. 세포 세척액(AWF) 수집

  1. 약 12인치 길이의 스카치 테이프 스트립을 잘라서 접지면을 위로 올려놓으세요. 테이프 한쪽 끝은 넓은 끝 바로 아래에 빈 1mL 주사기로 감아 고정하세요. 약 50-70개의 침투한 잎을 끈적한 표면을 겹겹이 쌓아 조심스럽게 배치하고, 각 칼날 밑부분이 주사기 하단을 향하게 하고 끝부분은 위쪽을 향하게 하여 채취할 수 있도록 배치하세요(그림 1B).
    참고: 한 테이프 조각에 여러 잎을 겹쳐 붙이면 손상을 방지하는 데 도움이 됩니다. 모든 잎을 칼날이 한쪽 끝을 향하도록 정렬하고 수집관 하단을 향하도록 하여 원심분리 중 효율적인 세포증액 회수를 가능하게 합니다.
  2. 테이프로 묶인 잎을 주사기에 단단히 감고, 두 줄의 스카치 테이프로 묶음 윗부분을 고정하세요. 포장된 주사기를 잎 끝과 주사기 베이스가 튜브 바닥을 향하도록 50mL 튜브에 삽입하세요. 잎을 단단히 테이핑해야 하며, 느슨하게 감으면 잎이 손상되고 파손된 세포가 방출되어 아포플라스트 세척액을 오염시킬 수 있습니다(그림 1B).
  3. 원심분리기: 침투된 잎을 담은 주사기를 900 × g 에서 4°C에서 10분간 고정 각도 로터가 장착된 냉장 원심분리기를 사용해 투여합니다. 세포증 세척액을 새 15mL 원뿔 튜브에 담아 얼음 보관하세요. 모든 잎이 AWF를 수거할 때까지 2.1-2.3단계를 반복합니다.
    참고: AWF는 투명해야 하며, 초록색이나 연한 녹색이 아닙니다. 녹색 AWF는 엽록체/엽록소의 존재를 나타내며, 세포 오염을 나타낼 수도 있습니다. 잎 손상을 최소화하려면 고정 각도 로터를 사용하세요.

3. 차동 원심분리를 통한 AWF로부터 애기장대 EV 분리

  1. 스윙버킷 로터가 장착된 냉장 원심분리기를 사용해 4 °C에서 20 분간 수집 한 세포질 세척액을 원심분리합니다. 표준 가속 및 감속 설정이 가능합니다. 원심분리 후에는 0.45 μm 나일론 셀 필터를 사용해 상액에서 큰 세포 이물질을 제거합니다. 펠릿을 버려. 여과된 상원액을 새로운 원심분리관으로 옮깁니다(그림 2).
  2. 고정 각도 로터가 장착된 냉장 원심분리기를 사용해 4°C에서 10,000 × g 에서 30분간 가속 및 감속 설정을 갖춘 원심분리기를 원심분리합니다. 펠릿은 버리고 상청액은 초원심분리를 위해 보관하세요. 이 단계는 큰 세포 잔해와 큰 소포를 추가로 제거합니다(그림 2).
  3. 상청액을 17mL 초원심분리관에 옮기고, 스윙버킷 로터가 장착된 초원심분리기를 사용해 1시간 동안 4°C에서 1×시간 동안 초원심분리기를 사용합니다. 원심분리 후 상원액을 버리고 약 16mL의 VIB 버퍼에 펠릿을 재현탁하여 세척합니다. 초원심분리 라운드를 반복하여 EV를 수집합니다(그림 2).
    참고: 100,000 x g 에서의 원심분리는 엑소좀과 같은 작은 소포의 침전을 위해 수행됩니다. 이후 세척 단계에서는 비-EV 단백질을 버퍼 내에 재현탁시켜 제거합니다. 초원심분리관은 원심분리 전에 제조사 규격에 따라 질량에 따라 신중하게 균형을 맞춰야 합니다. 사용 전에 튜브와 로터의 결함을 점검하고, 로터가 제대로 고정되었는지 확인한 후 운행을 시작하세요.
  4. 상정액을 버리고 펠릿을 VIB에 다시 현탁하세요. 피펫 팁을 사용해 튜브 바닥을 부드럽게 긁어 EV 펠릿의 완전한 회수를 돕습니다(그림 2).
    참고: EV 펠릿은 종종 반투명하여 재현탁 후 시각적으로 감지되지 않을 수 있습니다. 튜브 바닥을 부드럽게 긁어내면 EV 재현각 과정이 용이해집니다. 부유 부피를 조절하여 원하는 EV 농도를 달성하세요. 부유 부피가 작을수록 일반적으로 EV 준비물이 더 집중됩니다. 일반적으로 50 μL에서 EV를 재현탁하면 단백질 농도는 약 1-1.5 μg/μL이며, 입자 농도는 10 9-1010 입자/mL에 근접합니다.
  5. 재현수된 전기는 즉시 사용할 때 4°C, 액체 질소에서 급시 냉동 없이 장기 보관할 때는 -80°C에 보관하세요.
    참고: 장기 저장은 전기차의 무결성을 저하시킬 수 있습니다. 가능하면 새로 준비한 전기차를 사용하세요.

4. 자당 밀도 구배 분획의 EV 정제를 위한 사용

참고: 초심분리만으로는 여러 종류의 소포가 함께 침전됩니다. 더 정밀한 해상도를 달성하기 위해 부력 밀도와 부력 특성에 따라 소포를 분리하는 밀도 구배 분획을 사용할 수 있습니다. 이 접근법에서는 자당 구배를 사용하여 정의된 EV 하위 집단을 풍부하게 만듭니다. 또는 아이오딕사놀 구배를 사용할 수도 있습니다.

  1. 전기차의 상부 부하 자당 구배 분리
    1. 10%에서 90% 자당 경배 농도를 가진 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%로 구성됩니다. VIB를 사용한 비율은 52%, 58%, 64%, 70%, 90%입니다. 70%와 90% 스톡을 녹이기 위해 60°C 물욕을 사용하세요.
    2. 17mL 초원심분리관에 각 자당 용액 1mL를 층층이 쌓아 불연속 구배를 준비합니다. 가장 농도가 높은 용액부터 시작해 순차적으로 가장 농도가 낮은 용액으로 진행합니다. 그라데이션을 조립할 때 10% 자당 층은 제외하세요.
      참고: 인접한 층 간의 혼합을 최소화하기 위해 튜브 내부 벽을 따라 각 밀도층을 조심스럽게 분배하세요. 연속적이고 제어된 흐름을 제공하고 구배 안정성을 높이기 위해 느린 분배 속도로 설정된 자동 피펫이 권장됩니다. 일반 수동 피펫을 사용할 경우, 디스펜싱은 천천히 그리고 꾸준하게 진행해야 하며, 피펫 팁은 이전 층의 경계면 바로 위에 위치시키고, 공기 방울 형성을 방지하는 데 주의해야 합니다.
    3. 재현탁된 EV 펠릿(~100 μg EV 단백질)과 10% 자당 용액 1mL를 혼합합니다. 그 다음, 이 혼합물을 불연속층의 마지막 층으로 층층 쌓습니다. 총 부피는 ~12.1 mL가 될 것입니다.
    4. 100,000g 원심분리기, 4°C에서 16시간 동안 사용.
      참고: 장시간 초원심분리 운행의 경우, 튜브, 캡, 로터가 장시간 고속 운전에 적합한지 확인하고, 제조사가 권장하는 균형 맞추기 절차를 준수하는지 확인하세요.
    5. 샘플당 위에서 피펫팅하여 2mL 분획 6개를 채취합니다. 각 분획을 새로운 17mL 초원심분리관에 옮깁니다.
    6. 수집한 분획을 ~16 mL VIB 버퍼에 재현탁하고 원심분리기를 100,000g 온도에서 4 °C에서 1시간 동안 보관합니다.
    7. 상원액을 버린 후 각 펠릿을 50 μL VIB에 재현탁합니다.
      참고: EV 펠릿은 보이지 않습니다. 피펫 팁으로 튜브 바닥을 살짝 긁어 재현탁하세요. 필요에 따라 완충 부피를 조절하세요(예: 농도가 높은 경우 10 μL).
  2. EV의 하단 부하 자당 구배 분리
    1. VIB 완충제를 사용하여 다음 농도의 10%-90% 자당 경배 스톡을 준비합니다: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%, 46%, 52%, 58%, 64%, 70%, 90%입니다. 70%와 90% 스톡을 녹이기 위해 60°C 물욕을 사용하세요.
    2. 재현탁된 EV 펠릿(~100 μg EV 단백질)을 90% 자당 용액 1mL와 혼합합니다. 그 다음, 이 혼합물을 불연속층의 첫 번째 층으로 층을 쌓습니다.
    3. 남은 불연속적인 자당 구배를 준비하기 위해 EV-90% 자당 혼합물 위에 각 자당 용액 1mL씩을 순차적으로 층층 쌓아 올립니다. 70% 자당에서 시작해 점차 낮은 농도(64%, 58%, 52%, 46%, 40%, 40%, 34%, 28%, 22%, 16%, 10%)로 차례로 발산합니다. 튜브 벽을 따라 각 층을 피펫으로 조심스럽게 분배하여 인접한 층 간 혼합을 최소화하세요. 총 부피는 ~12.1 mL가 될 것입니다.
    4. 100,000g 원심분리기, 4° C에서 72시간 동안 사용.
      참고: 장시간 초원심분리 운행의 경우, 튜브, 캡, 로터가 장시간 고속 운전에 적합한지 확인하고, 제조사가 권장하는 균형 맞추기 절차를 준수하는지 확인하세요.
    5. 샘플당 위에서 피펫팅하여 2mL 분획 6개를 채취합니다. 각 분획을 새로운 17mL 초원심분리관에 옮깁니다.
    6. 수집된 분획을 ~16mL VIB 완충제에 재현탁하고, 원심분리기에서 100,000g, 4°C에서 1시간 동안 재현탁합니다.
    7. 상원액을 버린 후 각 펠릿을 50 μL VIB 버퍼에 재현탁합니다.
      참고: EV 펠릿은 보이지 않습니다. 피펫 팁으로 튜브 바닥을 살짝 긁어 재현탁하세요. 필요에 따라 완충 부피를 조절하세요(예: 농도가 높은 경우 10 μL).

5. EV 정제를 위한 크기 배제 크로마토그래피(35nm 컬럼) 사용

  1. 버퍼 준비 및 컬럼 평형
    1. VIB와 모든 추가 버퍼를 신선하게 준비하세요. 사용 전에 모든 완충제를 0.22 μm 두께의 멤브레인을 통해 걸러내고, 진공 상태에서 기구를 제거하여 기포 형성과 기공 막힘을 방지하세요.
      참고: 완기하지 않거나 여과되지 않은 버퍼 사용은 수지 베드에 공기 방울이나 입자를 유입시켜 흐름이 방해되고 EV 분리 효율이 저하될 수 있습니다. 기포가 열에서 관찰되면 유동을 중단하고 열을 다시 평형화해야 합니다.
    2. 컬럼과 버퍼가 실온(18-24 °C)에 평형을 맞출 때까지 기다린 후 컬럼 캡을 제거하세요.
      참고: 캡을 제거하기 전에 컬럼과 버퍼는 상온에 완전히 평형화되어야 합니다. 냉랭 컬럼에 상온 버퍼를 적용하면 수지 내 기포가 형성되어 용출 프로파일이 왜곡되고 재현성이 저하될 수 있습니다.
    3. 기둥을 세운 후 기둥의 상단 캡을 조심스럽게 제거하세요.
    4. 바닥 캡을 제거하고 버퍼가 컬럼에서 완전히 배출되도록 하세요.
      참고: 균형 맞추기 전에 저장 버퍼가 컬럼에서 완전히 배수되었는지 반드시 확인하세요.
    5. 탈기된 0.22 μm VIB 버퍼 3부피(25.5 mL)로 플러싱하여 컬럼을 평형으로 만듭니다.
  2. EV 적재 및 샘플 채취
    1. 각 SEC 정제마다 총 EV 단백질 100 μg을 사용하세요. SEC 컬럼에 적재하기 전에 VIB를 사용해 EV 샘플을 최종 부피 500 μL로 조정합니다.
    2. 500 μL EV 서스펜션을 컬럼 상단의 로딩 프릿에 직접 적용하세요.
    3. 샘플이 완전히 수지 베드에 들어가도록 한 후 VIB 버퍼를 추가하세요. 정확한 크기 기반 용출을 보장하기 위해 분리 과정 내내 연속적인 컬럼 흐름을 유지하세요.
      참고: 컬럼 흐름은 분리 내내 연속적으로 유지되어야 합니다. 컬럼이 건조하게 유지되거나 흐름을 장기간 정지하면 크기 기반 분리가 방해되어 분획 중첩과 EV 농축 감소가 발생할 수 있습니다.
    4. EV 샘플(500 μL)이 레진 베드에 완전히 들어간 후에는 2mL의 VIB를 추가하고 완전히 용출되도록 합니다. 이 융출액은 열의 죽은 부피에 해당하므로 폐기해야 합니다. 이후 EV 분획은 400 μL VIB를 순차적으로 첨가하고 용출물을 수집하여 1.5 mL 마이크로 원심분리관에서 1-6 분획을 얻었습니다.
      참고: 데드 볼륨에는 전기차(EV)가 포함되어서는 안 됩니다. 35nm 컬럼을 이용한 검증을 기반으로 EV는 일반적으로 1-3 분별로 회수됩니다. 필요 시 죽은 부피는 나노입자 추적 분석(NTA) 또는 EV 마커의 면역 블롯팅을 통해 EV 부재를 확인할 수 있습니다.
  3. 기둥 청소 및 저장
    1. 분획 수집 직후, 수지를 소독하기 위해 0.5 M NaOH 한 컬럼 부피(8.5 mL)로 컬럼을 세척합니다. 그 후 17mL의 VIB로 컬럼을 세척하여 중성 pH를 회복합니다. 그 후 컬럼은 다음 샘플을 적재할 준비가 완료됩니다.
      참고: 완충제만으로 컬럼을 세척하는 것은 잔류 단백질이나 소포를 제거하기에 충분하지 않습니다. NaOH 세척 단계는 특히 하류 핵산이나 RNA 분석에서 샘플 간 이월을 방지하기 위해 필수적입니다.
    2. 장기 보관의 경우, 세척 후 탈이온수 두 기둥으로 컬럼을 세척한 후, 저장을 위해 20% 에탄올 두 기둥을 세척합니다. 기둥을 다시 덮고 세워서 보관하세요.
      참고: 에탄올 저장 전에 탈이온수로 컬럼을 헹구면 수지 베드 내 염분 결정화를 방지하여 컬럼 성능을 유지합니다.

6. EV 검증, 정량화 및 크기/형태 평가

  1. 나노입자 추적 분석 (NTA)
    1. EV 크기 분포와 입자 농도를 NTA로 측정하세요.
    2. EV 샘플을 멸균 0.2 μm 여과 VIB에 1:100 비율로 희석하여 입자 농도를 최적 검출 범위(약 10⁷-10⁹ 입자/mL) 내에 도달시킵니다.
    3. 희석된 샘플을 조심스럽게 섞어 기포 형성을 방지한 후 532nm 레이저와 고감도 sCMOS 카메라가 장착된 기기에 넣으세요.
    4. NS Xplorer 소프트웨어를 사용하여 10 nm(최대 1,000 nm)의 검출 임계값을 가진 데이터 수집 및 분석을 수행하며, 동적 관측 부피 기반 집중 알고리즘을 적용합니다.
  2. EV 마커의 웨스턴 블롯 분석
    1. 웨스턴 블롯 분석을 위해서는 50 μL VIB에서 자당 구배 분리 후 얻은 EV 분획을 세척 및 재현탁합니다. 각 분획에서 10 μL 알리코트를 SDS 로딩 버퍼와 혼합하여 변성한 후 12% 트리스글리신 겔에 분해한 후 EV 마커 TET8 항체로 면역블롯을 합니다.
    2. SEC 유래 EV 분획의 경우, 먼저 각 분획당 400 μL을 100 kDa 분자량 컷오프 원심 필터를 사용해 50 μL로 농축합니다. 그 후 위에서 설명한 대로 농축된 샘플 10μL를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.
  3. 투과 전자현미경(TEM)
    1. VIB에 5μL의 EV를 현탁하여 글로우 방전 탄소 300메시 그리드에 침착합니다. 그 후 여과지로 남은 샘플을 제거하세요.
    2. 그 후 3μL 전자현미경 스테인으로 그리드를 음성으로 염색하고, 필터 페이퍼로 제거한 뒤 300 kV TEM으로 영상 촬영 전에 자연 건조시킵니다.

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결과

최적화된 AWF 수집 프로토콜이 조직 손상과 세포질 오염을 줄인다는 평가를 위해, 우리 방법(방법 1)으로 얻은 AWF를 전체 식물 진공 펌프 침투를 기반으로 한 대안 방법(방법 2)과 직접 비교하였다. 침윤 후 세포 손상은 Trypan Blue 염색으로 평가되었으며, 방법 1을 사용한 잎에서 염색이 현저히 감소하여 세포 파열 수준이 낮아졌음을 나타냈습니다(그림 3A). 수집된 AWF의 세포질 오염을 추가로 평가하기 위해 엽록소 함량과 엽록체 표지 단백질인 RBCL을 조사하였습니다. 방법 1을 사용한 AWF는 대체 방법으로 얻은 AWF에 비해 엽록소 수치가 현저히 낮고 RBCL 신호가 감소했습니다(그림 3B,C). 이 결과들을 종합하면, 최적화된 AWF 수집 프로토콜이 세포 손상과 세포질 누...

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토론

식물 EV는 특히 균 병원체와의 군 간 소통을 매개하는 데 있어 식물 면역의 핵심 역할을 하고 있습니다32. 점점 더 많은 증거가 식물이 아포플라스트에 EV를 분비하며, 이들은 Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, 오마이세테 병원체인 Phytophthora capsici 10,18,33과 같은 침입 병원체의 병원성을 억제할 수 있는 작은 RNA(sRNA), mRNA, 단백질을 전달하는 기능을 보여줍니다 . 그러나 식물 조직의 구조적 복잡성과 세포벽 파편 및 단백질 집합체와 같은 풍부한 오염물질의 존재로 인해 고순도 식물 EV의 재현 가능한 분리는 여전히 기술적으로 도전

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공개 사항

저자들은 이해 상충이 없다고 밝혔습니다.

감사의 글

B.D.는 텍사스 A&M 대학교의 박사 과정 펠로우십(Pathways to the Doctorate Fellowship)의 지원을 받고 있습니다. B.H.는 텍사스 A&M 대학교와 미국 농무부의 시작 자금으로 지원받고 있으며, 프로젝트 번호: TEX08074 7009138.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.45 & 마이크로; M 나일론 필터VWR76479-032
1ml 필요 없는 주사기BD 생명과학309659
100 kDa 초원심 필터아미콘UFC 910008
100ml 필요 없는 주사기BD 생명과학551721050
15ml 원뿔관VWR89039-664
50ml 원뿔형 튜브VWR89039-656
<엠>애로장대 탈리아나 (Col-0)실험실에서 유지 관리하는 라인해당되지 않음
탄소-폼바 300메시 격자테드 펠라01753-F
투명 테이프스카치 매직 테이프S-9783
파라필름피셔 사이언티브13-374-12
PBS 버퍼자체 제작해당되지 않음
qEV 원본 컬럼 Gen2 35nm아이존 사이언스ICO-35
냉장 원심분리기에펜도르프5810R
냉장 원심분리기 고정 각도 로터에펜도르프F-34-6-38
냉장 원심분리기 스윙버킷 로터에펜도르프A-4-62
자당VWR470302-810
초원심분리기벡먼 쿨터XPN-100
초원심분리기 튜브벡먼 쿨터337986
우라니리스 스테인전자현미경 과학250218-01

참고문헌

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