이 프로토콜은 캡사이신이 적재된 α-락트알부민 나노미셀을 포함하는 용해성 마이크로니들 패치의 제작을 설명합니다. 이 방법은 소수성 바이오액티브를 지방 조직에 표적으로 경피 전달하는 재현 가능하고 최소 침습적인 접근법을 제공하여 효율적인 국소 지방 감소를 촉진하고 비만 관리 분야에서의 응용 가능성을 확장할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
경피 캡사이신 전달 및 지방 조직 감소를 위한 α-락트알부민 나노미셀이 적재된 용해성 마이크로니들 패치 제작
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 캡사이신을 지방 조직에 표적으로 경피 전달하기 위해 α락트알부민 나노미셀을 포함한 용해성 마이크로니들(MN) 패치의 제작 및 적용을 개략적으로 설명합니다. 이 과정은 α락트알부민의 부분 효소 가수분해로 시작되며, 이로 인해 양친성 펩타이드가 자기 조립되어 소수성 화합물인 캡사이신을 캡슐화하는 나노미셀로 형성됩니다. 캡사이신 가재된 나노미셀은 히알루론산(HA) 및 폴리비닐 알코올(PVA) 매트릭스와 혼합되어 폴리디메틸실록산(PDMS) 몰드에 주조한 후 원심분리하여 10개 × 10개 MN 배열을 생성합니다. 진공 건조 후 MN은 피부 침투에 충분한 기계적 강도를 보이며 약 30분 이내에 용해됩니다. 대표적인 결과로는 MN의 균일한 형태를 확인하는 주사 전자현미경, 피부 침투 및 약물 방출을 검증하는 공초점 현미경, 그리고 지방량 감소, 대사 활동 증가, 지방 갈변 유도를 보여주는 고지방식이(HFD) 생체 내 실험이 있습니다. 이 프로토콜은 소수성 바이오액티브를 경피 전달을 재현 가능하고 최소 침습적으로 전달하는 방법을 제공하며, 비만 관리에 유망한 치료적 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜은 재현성에 최적화되어 있으며 다른 소수성 바이오액티브에 적응하기에 적합합니다.
서론
비만은 선진국과 개발도상국 모두에서 유병률이 꾸준히 증가하는 가장 시급한 글로벌 보건 문제 중 하나가 되었습니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 2016년 기준으로 6억 5천만 명 이상의 성인이 비만으로 분류되었고, 2022년에는 ≥18세 성인의 약 43%가 과체중이었고, 16%가 비만과 함께 생활하고 있었습니다. 비만은 대사 증후군, 심혈관 질환, 제2형 당뇨병, 여러 암과 밀접한 관련이 있어 상당한 사회경제적 및 의료 부담을 가합니다 2,3. 식이 제한, 운동, 약물치료, 비만 수술 등 현재의 치료 전략은 부분적이고 종종 일시적인 이점만을 제공합니다. 이러한 접근법은 환자 순응도가 낮고, 장기적 효능이 제한적이며, 침습성이 높고, 바람직하지 않은 부작용으로 인해 자주 고통받습니다 4,5. 따라서 비만 관리를 위한 안전하고 효과적이며 환자 기준에 맞는 국소적 치료법이 시급히 필요합니다.
천연 생체 활성 화합물은 다표적 작용과 일반적으로 우수한 안전성 프로필 덕분에 비만 방지 약물로서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 예를 들어, 플라보노이드 당당체인 루틴은 지방생성 전사인자를 억제하고 미토콘드리아 생합성을 촉진함으로써 지방생성 및 대사 조절 효과를 보입니다. 고추의 자극적인 성분인 캡사이신은 에너지 소비를 증가시키고, 백색 지방 조직의 갈색 변을 유도하며, 일시적 수용체 전위 바닐로이드 1(TRPV1) 신호 활성화를 통해 지질 축적을 억제하는 것으로 보고되었습니다 7,8. 그러나 이들 화합물의 임상 번역은 낮은 수용성, 낮은 구강 생체이용률, 빠른 대사, 그리고 캡사이신의 경우 섭취 시 위장 자극 때문에 방해받고 있습니다.
나노기술 기반 약물 전달 시스템은 이러한 한계에 대한 유망한 해결책을 제공합니다. 지포솜, 고분자 나노입자, 단백질 기반 나노캐리어는 약물 용해도, 안정성, 세포 흡수를 현저히 향상시킬 수 있습니다. 특히, 식품에서 유래한 우유 단백질인 α락트알부민은 부분적으로 가수분해되어 양친성 펩타이드로 전환되어 자기 조립하여 캡사이신11과 같은 소수성 분자를 캡슐화할 수 있는 나노미셀로 형성됩니다. 이 α-락트알부민 나노구조는 식품 및 제약 매트릭스에서 다양한 소수성 생체활성의 용해도, 안정성 및 생체이용률을 향상시키는 것으로 나타났습니다12,13. 그럼에도 불구하고 나노캐리어의 전신 투여는 여전히 조직 비표적 분포와 잠재적인 전신 독성을 초래할 수 있습니다14.
마이크로니들(MN) 기술은 경피 약물 전달을 위한 최소 침습적이고 환자 친화적인 플랫폼으로 등장했습니다. 히알루론산(HA)과 폴리비닐 알코올(PVA)과 같은 생체 적합성 고분자에서 제조된 용해성 MN은 각질층을 통증 없이 침투하고 삽입 후 용해되어 표적 조직에 정밀한 국소 약물 침착을 가능하게 합니다15,16. 나노캐리어와 MNs를 결합하면 피하 지방 조직에서 약물 축적이 증가하고 전신 노출과 부작용을 줄입니다17. 특히, HA 및 PVA 기반 MN 패치를 용해하는 것이 백신 및 생체의약품의 경피 전달에 임상 적용으로 진전되고 있으며, 이는 스케일18에서 유리한 안전성, 환자 수용률, 제조 가능성을 입증하고 있습니다.
이러한 진전을 바탕으로, 본 연구는 캡사이신을 캡슐화하는 α-락트알부민 나노미셀이 적재된 용해성 MN 패치의 제조를 기술합니다. 이 프로토콜에서는 α락트알부민을 6 mg/mL로 용해하고 효소 가수분해하여 캡사이신 가로다 나노미셀로 자가 조립하는 양친성 펩타이드를 생성합니다. 나노미셀은 HA/PVA 매트릭스(각각 5% w/v 비율)에 통합되어 폴리디메틸실록산(PDMS) 몰드에 주조되어 바늘 높이 600 μm의 10개 × 10개 MN 배열을 형성하며, 표준 마이크로 성형 공정과 호환되며 더 큰 인간 크기의 패치로 쉽게 확장할 수 있습니다. 이 통합 설계는 캡사이신의 용해도와 안정성을 높이고, 지방 조직 내에서 pH 반응성 방출을 제공하며, 지방 조직의 갈변 촉진, 지방 생성 억제, 전신 대사 지표 개선을 통해 생 체 내 국소 항비만 효과를 향상시킬 것으로 기대됩니다. 식품 등급의 α락트알부민과 임상적으로 첨단 용해하는 MN 재료를 활용함으로써, 이 플랫폼은 자가 투여 및 국소 비만 치료에 적합한 인간 규모 패치에 적용할 수 있는 번역 관련 최소 침습 전략을 제공합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 동물 실험은 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며, 베이징 실험동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 실험실/연구자에 할당된 승인 번호는 AW03019102-3입니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 캡사이신 12를 캡슐화하는 α-락트알부민 나노미셀 제조
- α-락트알부민을 6 mg/mL 농도로 탈이온수에 용해하고 pH를 7.4로 조절합니다. 자석 교반기로 8-28 × g으로 용액을 저어 α락트알부민이 완전히 녹을 때까지(보통 20-30분) 저어줍니다.
- 효소와 기질 비율 1:100(w/w)으로 바실루스 리케니포미스 프로테아제(BLP)를 첨가합니다.
- 혼합물을 50°C에서 30분간 배양하여 양친성 펩타이드를 생성합니다.
- 반응을 종료하기 위해 용액을 95°C로 5분간 가열한 후 실온으로 냉각한 후 0.22 μm 막을 통과합니다.
- 캡사이신을 에탄올에 1 mg/mL 농도로 용해. 캡사이신 용액을 부드럽게 저으며 펩타이드 용액에 떨어뜨리듯 넣습니다.
- 나노미셀이 자기 조립되도록 2시간 동안 계속 저어주세요.
- 혼합물(MWCO 3.5 kDa)을 탈이온수에 12시간 동안 투석하여 자유 캡사이신을 제거하고, 4시간마다 물을 교체합니다.
- 준비된 α락트알부민 나노미셀을 동결건조(라이오필라이즈)합니다.
- TEM, DLS, 제타 퍼텐셜 분석을 통해 나노미셀을 특성화합니다.
2. 용해성 마이크로니들 패치 제작 11
- 폴리머 용액은 HA(5% w/v)와 PVA(5% w/v)를 60°C의 탈이온수에 녹인 후 용액이 투명해질 때까지 저어줍니다.
- 폴리머 용액을 실온까지 냉각한 후 캡사이신 가재 나노미셀(M(Cap))과 4:1 비율로 혼합합니다.
- 진공 펌프에 연결된 건조기(약 −80 kPa)에서 혼합물을 10분간 탈기하여 기포를 제거한 후 PDMS 몰드에 주조합니다.
- 혼합물 200 μL를 PDMS 몰드(10 × 10 바늘 배열, 높이 600 μm)에 적재합니다.
- 마이크로니들 공동이 완전히 채워지도록 1800 × g 의 원심분리기를 RT로 10분간 원심분리하세요.
- 충전 작업을 한 번 반복한 후, 2.5단계와 동일한 조건에서 두 번째 원심분리를 한 뒤, 실온에서 진공(약 −80 kPa)에서 12시간 동안 몰드를 건조합니다.
- 조심스럽게 미세니들 패치를 몰드에서 떼어내세요.
- SEM을 이용한 미세바늘 형태학을 살펴보세요.
3. 마이크로바늘의 기계적 시험 19
- 마이크로니들 패치를 질감 분석기 스테이지 위에 올려놓고 바늘이 위를 향하게 합니다.
- 프로브를 이용해 20 μm/s 속도로 패치를 압축하여 0.7 mm 변위에 도달할 때까지 진행합니다.
- 파열력을 기록하고 바늘당 ≥0.15N인지 확인하여 피부 침투 능력을 보장합니다.
4. 시험관 삽입 및 용해 시험 11
- 쥐의 복부 피부를 면도하고 피부를 절제하여 체외 검사를 하세요.
- 절제된 피부를 아가로스 젤 지지대 위에 올려놓습니다.
- 마이크로니들 패치를 피부에 단단히 눌러 30초간 하세요.
- 패치와 피부 사이에 30분간 접촉을 유지하세요.
- 바늘 녹는 모습을 관찰하세요.
- 피부에 H&E 염색을 적용하고 삽입 부위를 CLSM으로 시각화하세요.
5. 시험관 방출 연구 11
- 마이크로니들 패치를 PBS 버퍼(pH 6.5 또는 7.4)에 37 °C에 담그십시오.
- 정해진 간격으로 버퍼 샘플을 추출하고 즉시 같은 양의 신선한 버퍼를 보충합니다.
- HPLC를 사용하여 채취된 샘플의 캡사이신 농도를 측정합니다.
- HPLC를 사용하여 다양한 pH 조건에서의 방출 프로필을 비교하세요.
6. HFD 유도 비만 마우스에서의 생체 내 적용 11
- C57BL/6N 마우스를 8주 동안 고지방 식단(HFD, 지방에서 60% kcal)을 먹여 비만을 유도합니다.
- 쥐를 무작위로 다섯 그룹으로 나눕힌다: 정상 대조군, HFD 대조군, 빈 미셀 마이크로바늘 패치(MP-M), 캡사이신 가재 나노미셀 주입(InJ-M(Cap)), 그리고 캡사이신 가재 나노미셀 마이크로바늘 패치(MP-M(Cap)) 그룹.
- 각 쥐의 서혜부 부위를 제필하세요.
- 제모된 부위에 2일마다 마이크로니들 패치를 한 번씩 붙이고, 28일 동안 패치를 30분 동안 고정하세요.
- 치료 기간 동안 체중과 음식 섭취량을 2일마다 기록하세요.
- 치료 종료 시 MRI로 전신 지방과 저지방 조직 구성을 분석하세요.
- 제조사의 지침에 따라 대사 케이지에서 신체 활동, 산소 소비량, CO₂ 생성, 호흡 지수(RQ)를 평가하세요.
- iWAT, sBAT, 주요 장기를 수집하고, H&E로 조직을 고정, 삽입, 절제, 염색하고, 광학 현미경으로 조직학적 변화를 평가합니다.
- 표준 절차를 사용하여 TRPV1, PPARγ, C/EBPα, UCP1, Cyt C에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
나노미셀의 형태학 및 특성 분석
투과전자현미경(TEM)은 α락트알부민 나노미셀이 균일하게 분산된 구형 입자이며 크기가 좁은 분포를 가진 것임을 보여주었다(그림 1). 캡사이신 캡슐화 후 평균 입자 직경이 ~22nm에서 ~30nm로 증가하여 미셀러 코어에 약물 적재가 성공적으로 이루어졌음을 나타냈다. 일관되게 제타 전위는 −16.8 mV에서 −20.3 mV로 약간 이동하여 효율적인 캡슐화와 표면 특성 변화를 더욱 입증했습니다.
3T3-L1 지방세포에서의 세포 흡수 및 항지생성 효과
Cy3 표지된 미셀을 이용한 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)은 2시간 이내에 나노미셀이 3T3-L1 전지방세포로 빠르고 효율적으로 흡수되는 것을 확인했습니다(그림 2A
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 연구는 캡사이신(M(Cap)을 캡슐화하는 α-락트알부민 나노미셀이 적재된 용해성 마이크로니들(MN) 패치가 국소적이고 최소 침습적인 항비만 효과를 낼 수 있음을 보여줍니다. α-락트알부민 나노미셀은 소수성 캡사이신을 효율적으로 캡슐화하고, 수용성 분산성을 개선하며, 세포 흡수를 강화하여 3T3-L1 지방세포에서 지방생성 억제와 미토콘드리아 생합성을 더 두드러지게 만들었습니다. 이 결과는 단백질 기반 나노캐리어가 지친성 영양보급제의 생체이용률과 세포 침투성을 개선한다는 이전 연구와 일치한다11.
용해성 MN은 견고한 경피 전달을 제공했습니다. HA/PVA 기반 바늘은 균일한 피라미드 형태와 피부 침투에 충분한 기계적 강도를 보였으며, 약 30분 이내에 용해되어 환자 친화적인 적용을 위한 핵심 요건을 충족했습니다. pH 반응성 방출 프로파일은 pH ~6.5에서 캡사이신 방출이 ...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
공개 사항은 없습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 중국 국가자연과학기금 청년 과학자기금(번호 32202024), 산둥성 자연과학기금 청년 과학자 기금(번호)의 지원을 받았습니다. ZR2024QC103), 산둥성 핵심 연구개발 계획(2025CXGC010803, 2022CXPT022), 산둥성 가금류 산업 기술 시스템(SDAIT-11-10), 그리고 중국 옌타이시 교육국이 지원하는 대학-산업 협력 프로그램(애완동물용 차세대 백신 플랫폼 개발)이 포함됩니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3T3-L1 전지방세포 | ATCC | CL-173 | 지방생성 연구를 위한 세포주 |
| 바실루스 리케니포미스 프로테아제(BLP) | 시그마-올드리치 | P5380 | &알파 락트알부민의 효소 가수분해 |
| 캡사이신 (≥ 98%) | 시그마-올드리치 | M2028 | 캡슐화할 활성 화합물 |
| 원심분리기 (≥ 4000 rpm) | 에펜도르프 | 5810R | 몰드를 채우기 위해 |
| 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) | 자이스 | LSM 900 | 미셀의 분포와 침투를 시각화하기 위해 |
| Cy3 형광 염료 | GE 헬스케어 | PA23001 | 나노미셀 표지 작성을 위해 |
| Cy5 또는 Cy7 형광 염료 | 판보 바이오케미컬, 베이징, 중국 | 해당 없음 | 생물분배 영상을 위한 |
| 둘벡코 수정된 독수리' s 미디엄 (DMEM) | 깁코 (써모피셔 사이언티픽) | 11965-092 | 세포 배양을 위해 |
| 에탄올(≥ 99.7%) | 시노팜 화학 시약 | 100092683 | 캡사이신용 용매 |
| 태아 소 혈청(FBS) | 깁코 (써모피셔 사이언티픽) | 16000-044 | 세포 배양을 위해 |
| 고지방 식단(60% kcal 지방, D12492) | 미국 리서치 다이어트 | D12492 | 쥐의 비만 유도 |
| 히알루론산 (HA, Mw 100 & ndash; 300 kDa) | 알라딘 생화학 기술 주식회사, 중국. | H108124 | 마이크로니들 제작용 폴리머 |
| 이소플루란 | RWD, 중국 | R510-22-10 | 마취 |
| 대사 케이지 시스템 | 판랩, 미국 | 해당 없음 | 활동량, 산소 섭취량 및 RQ 평가 |
| 밀리-Q 탈이온수 | 밀리포어 | 해당 없음 | 용매 |
| MRI 시스템 | 중국 뉴마그(NiuMag) | 메소QMR23-060H-I | 지방/마른 체성분을 측정하기 위해 |
| PDMS 마이크로니들 몰드(10 & times 10, 600 & mu; 키 m) | 블루에이커 기술 또는 맞춤 | 해당 없음 | 마이크로니들 제조 |
| 페니실린&대시; 스트렙토마이신 | 깁코 (써모피셔 사이언티픽) | 15140-122 | 세포 배양을 위해 |
| 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4) | 써모피셔 사이언티브 | 10010023 | 시험관 내 및 생체 내 연구를 위한 완충 |
| 폴리비닐 알코올 (PVA, Mw 30 – 70 kDa) | 알라딘 생화학 기술 주식회사, 중국. | P109389 | 마이크로니들 제작용 폴리머 |
| 주사 전자현미경(SEM) | FEI 테크나이 | G2 F30 | 마이크로니들 형태를 특성화하기 위해 |
| 텍스처 분석기 | 보신텍, 상하이, 중국 | 고마워. XTC-20 | 마이크로바늘 강도를 시험하기 위해 |
| 트라이판 블루 용액 (0.4%) | 써모피셔 사이언티브 | 15250061 | 마이크로바늘 삽입 부위를 시각화하기 위해 |
| UV– 가시 분광광도계 | 퍼킨엘머 | 람다 35 | 약물 방출 분석법을 위해 |
| 진공 오븐/건조기 | 써모피셔 사이언티브 | 해당 없음 | 마이크로바늘을 건조시키기 위해 |
| 서부 블로팅 장치 | 바이오-래드 | 미니 프로티안 테트라 | 단백질 분석 |
| &알파;-락트알알민 (≥ 95%) | 시그마-올드리치 | L6010 | 나노미셀 형성을 위한 단백질 공급원 |
참고문헌
- Obesity and overweight. WHO Fact Sheets. , World Health Organization. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight (2025).
- Bray, G. A., Kim, K. K., Wilding, J. P. H. Federation, W. O. Obesity: A chronic relapsing progressive disease process. A position statement of the World Obesity Federation. Obes Rev. 18 (7), 715-723 (2017).
- Hruby, A., Hu, F. B. The epidemiology of obesity: A big picture. Pharmacoeconomics. 33 (7), 673-689 (2015).
- Dietrich, M. O., Horvath, T. L. Limitations in anti-obesity drug development: The critical role of hunger-promoting neurons. Nat Rev Drug Discov. 11 (9), 675-691 (2012).
- Garvey, W. T., et al. American Association of Clinical Endocrinologists and American College of Endocrinology comprehensive clinical practice guidelines for medical care of patients with obesity. Endocr Pract. 22, 1-203 (2016).
- Li, Z., Liang, S., Sun, H., Bao, C., Li, Y. Antilipogenesis effect of rutin-loaded liposomes using a microneedle delivery system. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (47), 54294-54303 (2023).
- Hsu, C. L., Yen, G. C. Effects of flavonoids and phenolic acids on the inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. J Agric Food Chem. 55 (21), 8404-8410 (2007).
- Zhang, L. L., et al. Activation of transient receptor potential vanilloid type-1 channel prevents adipogenesis and obesity. Circ Res. 100 (7), 1063-1070 (2007).
- Zheng, J., Zheng, S., Feng, Q., Zhang, Q., Xiao, X. Dietary capsaicin and its anti-obesity potency: from mechanism to clinical implications. Biosci Rep. 37 (3), BSR20170286(2017).
- Negahdari, R., et al. Therapeutic benefits of rutin and its nanoformulations. Phytother Res. 35 (4), 1719-1738 (2021).
- Bao, C., et al. Microneedle patch delivery of capsaicin-containing α-lactalbumin nanomicelles to adipocytes achieves potent anti-obesity effects. Adv Funct Mater. 31 (20), 2011130(2021).
- Hu, Y., et al. The construction of enzymolyzed α-lactalbumin-based micellar nanoassemblies for encapsulating various kinds of hydrophobic bioactive compounds. Food Funct. 10 (12), 8263-8272 (2019).
- Wang, Q., et al. The stability and bioavailability of curcumin-loaded α-lactalbumin nanocarriers formulated in functional dairy drink. Food Hydrocoll. 131, 107807(2022).
- Luo, T., et al. Adipose tissue-targeted drug delivery for treating obesity: Current opportunities and challenges. Drug Deliv. 32 (1), 2547751(2025).
- Patel, D., Patel, N., Parmar, M., Kaur, N. Transdermal drug delivery system: An overview. Int J Toxicol Pharmacol Res. 1, 61-80 (2011).
- Singh, P., et al. Single-administration self-boosting microneedle patch for the treatment of obesity. Adv Ther. 7 (9), 2400028(2024).
- Than, A., et al. Transdermal delivery of anti-obesity compounds to subcutaneous adipose tissue with polymeric microneedle patches. Small Methods. 1 (11), 1700269(2017).
- Nguyen, H. X., Nguyen, C. N. Microneedle-mediated transdermal delivery of biopharmaceuticals. Pharmaceutics. 15 (1), 277(2023).
- Chu, L. Y., Choi, S. O., Prausnitz, M. R. Fabrication of dissolving polymer microneedles for controlled drug encapsulation and delivery: Bubble and pedestal microneedle designs. J Pharm Sci. 99 (10), 4228-4238 (2010).
- Richmond, W., Wogan, M., Isbell, J., Gordon, W. P. Interstrain differences of in vitro metabolic stability and impact on early drug discovery. J Pharm Sci. 99 (11), 4463-4468 (2010).
- Amini-Nik, S., Yousuf, Y., Jeschke, M. G. Scar management in burn injuries using drug delivery and molecular signaling: Current treatments and future directions. Adv Drug Deliv Rev. 123, 135-154 (2018).
- Prausnitz, M. R., Langer, R. Transdermal drug delivery. Nat Biotechnol. 26 (11), 1261-1268 (2008).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
