톡소플라즈마 곤디이 타키조이트에 대한 시험관 내 생리활성 분자 스크리닝을 위한 항증식 플라크 분석법

요약

이 연구는 원생동물 톡소플라즈마 곤디이의 타키조이트 단계에 대해 새로운 생리활성 분자를 스크리닝하는 데 도움을 주는 간단한 플라크 분석 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다.

초록

톡소플라즈마증은 안구 병변과 신생아 기형과 흔히 관련된 기생충 감염입니다. 1950년대 초부터 이 질병의 1차 치료는 설파디아진, 피리메타민, 폴린산의 조합에 의존해 왔습니다. 그 기간 동안 몇 가지 대체 요법만이 도입되었습니다. 이는 톡소플라즈마 곤디에 대한 새로운 생리활성 분자 발견의 필요성을 강조합니다. 이 병원체가 필수 세포 내 기생충이기 때문에, 전통적인 약물 스크리닝은 형광 단백질이나 β-갈락토시다제 발현 기생충을 이용한 검사법과 같은 고가의 재료와 장비가 필요합니다. 또한 광학 현미경 정량화와 같은 방법은 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 플라크 분석법은 기생충의 용해 주기로 손상된 세포 단층의 영역과 파괴 면적의 수를 측정하여 세포 내 병원체 증식의 강도를 평가하는 방법입니다. 이 연구는 시험관 내에서 T. gondii의 세포 내 타키조이트에 대해 활성 분자를 스크리닝하기 위해 설계된 최적화된 플라크 분석 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 저렴한 재료와 간단한 실험실 환경을 활용하여 다양한 연구 그룹이 이 기생충에 대한 새로운 활성 분자를 식별하는 데 빠르고 재현 가능한 결과를 제공합니다.

서론

톡소플라즈마증은 전 세계적으로 이질적으로 분포하는 인수공통전염병으로, 전 세계 인구의 약 3분의 1에 영향을 미칩니다 ^1,2. 이 질병의 증상은 숙주 면역 정도와 기생충 복제와 관련이 있습니다 ^3,4. 타키조이트 단계의 복제가 특징인 급성기는 면역 능력이 있는 사람들에서 일반적으로 무증상입니다 ^5,6. 반면, 면역 저하 환자들은 일반 불쾌감, 발열, 뇌염 및 망막경엽염 ^6,7,8과 같은 비특이적 증상을 더 자주 보인다. 임상적 중요성에도 불구하고, 현재 사용 가능한 치료법은 만성기 Toxoplasma gondii bradyzoite 단계에 효과가 없으며 기생충학적 치료법을 이루지 못합니다. 현재 약물에 대한 부작용도 치료 순응도를 감소시킵니다^{9, 10, 11}. 따라서 톡소플라즈마증에 대한 새롭고 안전하며 효과적인 치료법을 찾아야 합니다.

신약 개발에는 오랜 기간, 수십억 달러의 투자, 그리고 여러 연구 단계가 필요합니다. 신약 개발 비용이 높기 때문에 제약 산업은 사전에 최적의 후보를 선정해야 합니다. 약물 선별을 위해서는 실리코 방법, 인공지능 사용, 그리고 가장 일반적인 생물학적 방법 등 여러 접근법이 사용될 수 있습니다.^{16, 17, 18, 19}. 시험관 내 생물학적 스크리닝은 분자 라이브러리(화학라이브러리)를 사용하여 생물학적 활성 20,21,22를 식별할 수 있도록 분자를 제공하는 것을 포함합니다. 이러한 화학도서관은 다양한 분자를 포함하고 있기 때문에 자원과 시간을 최적화할 필요가 있습니다. 따라서 플라크 분석은 T. gondii와 같은 다양한 병원체에 대해 새로운 생체 활성 분자를 빠르게 스크리닝하는 데 도움이 될 수 있습니다.

플라크 분석은 세포 내 병원체의 용해성 사이클을 이용해 세포 단층 내 병원체 농도를 정량화하는 시험관 내 방법으로, 시간에 따라 괴사성 플라크가 형성되도록 합니다²³. 플라크 분석 기법을 사용한 최초의 연구는 20세기 후반으로 거슬러 올라가며, 레나토 둘베코 팀이 서부 말 뇌척수염 바이러스에 감염된 닭 섬유아세포의 단층을 사용해 괴사성 플라크 수와 바이러스¹⁶ 농도 간의 비례성을 입증했습니다. 이 기법의 T . gondii 사용도 우퍼만과 협력자들에 의해 이전에 잘 설명되어 왔으며,²³.

플라크 분석법을 이용해 T. gondii가 다양한 분자 농도에 대한 억제 반응을 관찰한 최초의 연구 중 하나는 1976년 Roberts 등에 의해 수행^{되었습니다.} 플라크 분석법은 바이러스 ^16,24 적정에 널리 사용되지만, 이 방법은 21,22,25,26,27 분자의 항-T. gondii 활성을 평가하는 데 일부 연구 그룹에 의해 사용되었습니다. 고처리량으로 화합물 라이브러리를 검사할 수 있고 저렴한 재료와 간단한 실험실 장비를 사용할 수 있는 분석법을 찾기 위해, 플라크 검사법이 일상적인 실험실 약물 선별의 대안으로 탐색되었습니다. 이로 인해 단순 재료와 이미지 획득 시스템을 사용하여 서로 다른 분자의 활도를 동시에 평가할 수 있는 최적화된 프로토콜이 확립되어 빠르고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있게 되었습니다. 따라서 우리는 우리 연구실에서 검증된 상세 프로토콜을 설명하여, 다른 그룹들이 T. gondii의 타키조이트에 대해 새로운 생리활성 분자를 스크리닝하는 데 도움을 줍니다.

프로토콜

기생충 및 세포 배양물의 조작, 폐기물 처리 및 목적지는 국가위생감시청(ANVISA) RDC 222/2018호에 따라 브라질 법률에 따라 수행되었습니다. 모든 절차는 ICB-UFMG 산하 내부 생물안전 위원회(CIBio)의 감독을 받았습니다. 이 연구는 동물, 인간, 또는 유전자 변형 생물을 사용하지 않습니다. CNPq, CAPES, FAPEMIG의 보조금이 이 작업을 지원했습니다. ESMD(CNPq 308082/2023-0)와 RWAV (CNPq 305574/2021-3)는 CNPq 생산성 펠로우입니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 보충 RPMI-1640 매체 준비

참고: RPMI-1640 배지는 원래 인간 백혈병 세포를 현탁 및 단층 양쪽에서 배양하기 위해 개발되었습니다. 그러나 이후 연구들은 다양한 포유류 세포 배양에 적합함을 보여주었습니다.

1. RPMI-1640 250mL가 든 병에 200 mM L-글루타민 2.5mL(100x)를 추가합니다.
2. 배지에 항생제-항균제(100x) 2.5mL를 추가하세요.
3. 다음으로, RPMI-1640(2% 또는 10% FBS)과 함께 5.0 mL 또는 25 mL의 태아 소 혈청(FBS)을 병에 추가하세요.
4. 냉장고에 보관하세요(2-8 °C).

2. PBS 준비 (1회)

참고: pH 7.2, 25 °C에서 인산염 완충 생리식염수 1L을 준비하려면 아래 단계를 따르십시오.

1. 다음 양의 염분을 별도로 측정하세요: Na₂HPO₄ 1.4g, KH₂PO₄ 0.24g, NaCl 8.5g.
2. 가중염을 따로 1L 비커에 800mL 이온수 포함에 추가하세요. 용액을 저어 모든 염분이 완전히 녹아버릴 때까지 하세요.
3. pH 미터를 사용해 용액의 pH를 측정합니다. 7.2가 되어야 합니다. 필요하다면 6M 염산 또는 3M 수산화나트륨을 사용해 pH를 7.2로 낮추세요.
4. 유리 막대를 사용해 위 용액을 1L 부피 플라스크에 정량적으로 옮깁니다.
5. 탈이온화된 물을 부피 플라스크에 넣어 총 부피가 1L에 도달할 때까지 넣어 반월판이 올바른 위치에 있는지 확인합니다.
6. 용액을 부피 플라스크에 넣고 부드럽게 뒤집어 섞으세요.
7. 최종 PBS 용액을 더 작은 유리병(100-250 mL)에 나누세요.
8. 병을 121°C, 1.1 kg/cm² 에서 15분간 오토클레이브합니다.
9. PBS 용액은 냉장고에 보관하세요(2-8°C).
   참고 1: 모든 실험에는 37°C에서 PBS를 사용하세요.

3. 4% 포름알데히드 용액 제제

1. 1x PBS 35.68mL와 37% P.A. 포름알데히드 4.32mL를 혼합합니다.
2. 용액은 실온(25°C)에서 플라스틱 플라스크에 보관하세요.

4. 활성 분자의 스톡 용액 준비

참고: DMSO, DMF, 에탄올 또는 물에서 분자의 용해도를 확인하고, 가장 적합한 용매를 선택하세요. 기생충에 대한 희석성 독성 효과를 최소화하기 위해, 스톡 용액은 검사할 화합물의 최고 농도보다 최소 1000배 더 농축되어야 합니다. 예를 들어, 시험할 최고 농도가 1 μM이라면 기본 용액은 최소 1 mM이어야 합니다. 10 mM 스톡 용액을 준비하려면 아래 단계를 따라 하세요:

1. 분석용 저울로 0.0001 g의 정밀도로 시험할 화합물을 계량합니다.
2. 다음 공식을 사용하여 10 mM 용액을 얻기 위해 필요한 희석제의 부피를 산출합니다:
   V (mL) = (Y MM) x 100
   여기:
   Y: 화합물 질량(밀리그램 단위)
   MM: 화합물의 몰 질량
   V (mL): 용매의 부피
3. 가중량이 들어간 화합물이 들어있는 수신기에 희석제를 추가하세요.
4. 보텍스 믹서를 이용해 균질화하세요.
5. 용액을 작은 알리쿼트로 나누어 -20 °C의 냉동고에 보관하세요.
6. 사용 전에 알리코트 용액이 완전히 녹았다가 소용돌이 믹서를 사용해 다시 균질화할 때까지 기다려 주세요.
   참고: 다른 농도의 서브스톡 용액을 준비할 때는 다음 공식을 사용하세요
   V (μL) = x mM × y μL/10 mM
   새로운 용액을 준비하는 데 필요한 재고 용액의 부피 V (μL)
   x mM: 새로운 용액의 원하는 농도.
   y (μL): 새로운 용액의 원하는 부피.

5. 세포 배양

1. NHDF 셀은 37°C 수욕에서 바이알을 부드럽게 휘저으며 사용하세요.
   참고: NHDF 세포는 인간 포피 섬유아세포(HFF) 또는 안정적인 단일층을 형성하는 다른 세포주로 대체될 수 있습니다. 플라크 분석은 안정된 단일층을 형성하는 세포주, 즉 접촉으로 성장이 멈춘 세포주에만 적용됩니다. 종양 세포주처럼 증식 억제를 보이지 않는 세포주는 배양 내 영양분을 기생충과 경쟁하며 기생충이 형성한 플라크 영역을 보충하기 때문에 사용할 수 없습니다.
2. 즉시 해동된 세포를 10mL 보조된 RPMI-1640 배지(시텝 1)가 들어 있는 15 mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.
3. 셀을 200 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다. 회전 사이클이 완료되면 튜브 바닥에 세포 펠릿이 보여야 합니다.
4. 세포 펠릿을 보존하기 위해 상원액을 조심스럽게 버리세요.
5. 세포 펠릿을 10% FBS가 포함된 12mL 보조 RPMI-1640 배양지로 재현탁하고, 25cm² 배양 플라스크 3개 또는 75cm² 플라스크 1개를 씨앗 뿌립니다. 2-3일 후, 역위상 대비 현미경으로 배양 플라스크를 검사하여 세포 증식의 회복 여부를 확인한다(세포는 최소 40%-50% 합류율을 보여야 한다).
6. 세포가 완전한 단일층(100% 합류)에 도달하면 파스퇴르 피펫으로 플라스크에서 배지를 제거하세요. 배지와 피펫을 버리세요.
7. 플라스크에 1-2mL의 PBS를 1번 넣고 1분간 기다린 후 PBS를 제거하세요.
8. 플라스크에 0.05% 트립신-베르센 용액 1mL를 넣고, 5%_CO2, 습도, 37°C 온도에서 인큐베이터에 2분간 넣습니다.
9. 2분 후, 거꾸로 현미경으로 세포가 분리되었는지 관찰합니다.
10. 분리된 세포는 10mL 혈청학적 피펫과 자동 피펫 디스펜서를 사용해 24 mL 보조제 RPMI-1640 배지와 10% FBS를 사용해 재현탁합니다.
    참고: 각 25 또는 75 cm² 배양 플라스크에 합류 단일층이 있으며, 각각 5개 또는 15개의 다른 25 cm² 배양 병에서 복제할 수 있습니다.
11. 필요한 양액(24mL)을 추가한 후, 혈청학적 피펫으로 세포 현탁액을 균질화합니다.
12. 세포 현탁액 4mL를 배지에 담아 각^{25cm 플라} 스크 또는 12mL에서 75cm² 플라스크에 옮깁니다. 초기 플라스크에 4mL의 세포 현탁액을 남겨두는 것을 잊지 마세요.
13. 플라스크를_CO2 5%, 습도, 37°C 온도의 인큐베이터에 넣으세요.
14. 세포의 완전한 단일층(100% 합류)이 완성될 때까지 기다립니다.
    참고: 각 플라스크에는 날짜와 통과 번호를 적어 식별하세요.

6. 배양 플레이트 준비

1. 거꾸로 현미경을 사용해 배양 플라스크 내 세포 단층(100% 융합)의 완전성을 검사합니다.
2. 위에서 설명한 트립신화 절차(5.7-5.9단계)를 따르세요.
3. 5 mL 혈청학적 피펫을 사용해 분리된 세포를 4 mL RPMI 배지로 재현탁한 후 15 mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.
4. 200 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리기를 사용하세요.
5. 상액을 조심스럽게 버리세요.
6. 세포 펠릿을 신선한 RPMI-1640 배지 1mL로 재현탁합니다.
7. 보텍스 믹서를 이용해 균질화하세요.
8. 멸균 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용해 1.5mL 튜브에 490 μL 490 μL 포름알데히드 용액(1:50 희석)을 넣은 튜브에 10 μL을 전달합니다.
   참고: 희석 계수 = (총 부피(μL)) / (시료 부피(μL))
9. 노이바우어 챔버를 설치해.
10. 고정액을 기생충(항목 6.8에서 준비)으로 와류 믹서를 사용해 균질화합니다.
11. 고정된 기생충이 포함된 용액 10 μL를 노이바우어 챔버에 추가합니다.
12. 노이바우어 방의 네 사분면을 세어보세요. 각각 16개의 정사각형으로 이루어져 있습니다.
13. mL당 세포 수를 결정하세요:
    세포 수 (mL당 ) = [(n° 세포 per square)/4] x Fd x 10⁴
    여기:
    Fd (희석 계수) = 50
14. 12웰 또는 6웰 배양판의 각 웰에 각각 5× 10^{4 또는} 10 x^{5 세포를} 10% FBS를 첨가한 RPMI-1640 보조 배지에 재현탁합니다.
15. 5%_CO2, 습한 대기, 37 °C 온도의 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.
16. 세포 단층이 100% 합류할 때까지 기다립니다.

7. 시험관 내 타키조이트 배양

참고: 플라크 검사에는 T . gondii의 RH 균주를 권장합니다.

1. 파스퇴르 피펫을 사용해 25cm² 플라스크에 NHDF 세포가 완전 단일층(100% 합류)으로 들어있는 오래된 배지를 버립니다. 다음으로, 플라스크에 신선한 RPMI-1640 완전 배지 4mL를 넣습니다.
2. 이전 플라스크에서 새롭게 배출된 타키조이트가 포함된 상청액 5 μL을 용해된 감염 배양과 함께 이송합니다. 5 μL의 부피는 25 cm² 플라스크당 6-7일간의 용해 사이클을 가능하게 합니다.
3. 새로 감염된 플라스크를_CO2 5%, 습한 대기, 37°C 온도의 인큐베이터에 넣습니다.

8. 타키조이트 정량화

1. 새로 배출된 기생충이 포함된 배양 플라스크에서 배지를 파스퇴르 피펫으로 제거하여 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
2. 튜브를 실온에서 760 x g 로 2분간 원심분리합니다. 스핀 사이클이 끝나면 튜브 바닥에 보이는 펠릿이 보입니다.
3. 상액을 조심스럽게 버리세요.
4. 기생충 펠릿을 2% FBS를 포함한 1mL의 신선한 RPMI-1640 배지로 재현탁합니다.
5. 기생충 현탁액을 와류 믹서를 사용해 균질화하세요.
6. 10 μL 기생충 현탁액을 멸균 팁이 있는 피펫으로 490 μL 4% 포름알데히드 용액(1:50 희석)이 들어 있는 1.5 mL 튜브에 옮깁니다.
7. 6.10부터 6.12에 설명된 단계를 따르세요.
8. 1mL당 타키조이트의 수를 결정합니다.
   참고: 타키조이트 수 (mL당 기준) = [(제곱의 타키조이트 n°)/4] x Fd x 10⁴
   여기:
   Fd (희석 계수) = 50

9. 화학 도서관에서 추출한 활성 분자에 대한 플라크 분석 준비

참고: 이 검사는 1 μM 농도에서 T. gondii 증식을 50% 이상 줄이는 분자를 식별하는 것을 목표로 합니다. 이 분석법을 시작하기 전에 세포독성 검사(예: MTS 방법 또는 MTT 방법)를 수행하여 플라크 분석에 사용되는 화합물 농도가 숙주 세포에 독성이 없는지 확인해야 합니다.

1. 세포 배양이 12웰 또는 6웰 플레이트에서 100% 합류했는지 확인하세요.
2. 기존 배지를 버리고 각각 12웰 플레이트와 6웰 플레이트의 웰에 2% FBS를 넣은 신선한 RPMI-1640 배지를 1 또는 2mL 추가합니다.
3. 각 우물에 원하는 농도로 시험할 화합물을 추가하세요. 초기 스크리닝에서는 1 μM 농도가 권장됩니다.
   참고: 각 우물에 첨가할 부피를 계산할 때는 다음 공식을 사용하세요.
   V (μL) = (우물 내 최종 농도(μM) x 우물 내부 부피(μL)) / (재고 용액(μM))
4. 각 플레이트 웰에 12웰 플레이트의 경우 600개의 타키조이트 또는 6웰 플레이트의 경우 1,000개의 타키조이트를 추가합니다.
   참고: 기생충 증식의 변동은 배양지나 FBS 공급자의 차이, 또는 사용되는 세포주 차이로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서 각 실험실 조건에 맞는 최적의 기생충 수를 결정하기 위한 파일럿 실험을 수행하는 것이 권장됩니다. 필요하다면 이 실험에 사용하는 기생충의 양을 조절하세요.
5. 플레이트를 37°C에서 5%_CO2 와 습한 대기 상태로 7일간 교란 없이 아닌큐베이터에 넣습니다.
   주의: 7일간의 잠복기 기간 동안 접시를 옮기거나 만져서는 안 됩니다. 이런 일이 벌어지면 실험은 망가진다.

10. 크리스탈 바이올렛을 이용한 판 염색 및 이미지 획득

1. 7일 후에는 각 웰에서 배지를 제거하세요.
2. 각 웰을 상온에서 1x PBS로 조심스럽게 세척하세요.
3. PBS를 버리고 각 웰에 70% 도의 알코올 1mL를 조심스럽게 첨가합니다. 실온에 15분간 두었다가 버리세요.
4. 0.5% 크리스탈 바이올렛 수용액을 넣고 상온에서 30분간 방치시킵니다.
5. 크리스탈 바이올렛 용액을 제거하세요.
6. 각 우물을 한 번 조심스럽게 탈이온수로 세척하세요.
   주의: 세척 단계에서 배지나 PBS를 제거할 때는 피펫 끝으로 웰 바닥을 만지지 마세요. 이는 단층의 무결성을 손상시킬 수 있습니다. 세척 단계에서는 PBS나 알코올을 직접 세포에 뿌리지 마세요. 우물 가장자리를 따라 꼼꼼히 추가하세요.
7. 접시를 흡수성 종이에 뒤집어 놓고 과도한 물을 빼내고 실온에서 24시간 말리세요.
8. 고화질 플랫베드 스캐너^28,29 또는 Coomassie 블루 젤 옵션 21,22,30에 맞게 설정된 영상 기록 시스템을 사용하여 플레이트를 촬영하세요.

11. 가역성 분석

참고: T. gondii 타키조이트를 대상으로 한 가역성 분석의 주요 목적은 배양지에서 화합물을 제거한 후 처리된 기생충의 증식 능력이 완전히 사라졌는지 또는 감소하는지 확인하는 것입니다³¹.

1. 6단계에서 설명한 대로 NHDF셀로 6웰플레이트를 시딩합니다. 각 웰마다 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 보조제에 재현탁된 10개의^{5 세포 1} 개를 추가합니다.
   참고: 각 웰에서 세포 단층이 100% 합류하면 판이 플라크 분석에 적합하게 됩니다.
2. 배지를 버리고 각 웰에 2mL 신선한 배지에 재현탁^{된 10} x 4 타키조이트를 2% FBS에 넣습니다.
3. 타키조이트가 NHDF 세포와 1시간 동안 상호작용하도록 한 후, 최종 농도가 90% 억제 농도(IC₉₀)에 가까운 최종 농도로 선택된 화합물을 첨가합니다. 약물 희석제만 포함된 우물이 양성 대조군으로 사용됩니다.
4. 타키조이트를 37°C, 5%_CO2 , 습한 대기에서 인큐베이터에서 4일간 처리합니다.
5. 4일 처리 후 37°C에서 1x PBS로 플레이트를 세 번 세척하여 화합물이 완전히 제거되도록 합니다.
6. 각 웰에 화합물 없이 신선한 배지 2mL를 추가하고, 플레이트를 인큐베이터에서 추가로 7일간 보관합니다.
7. 판에 크리스탈 바이올렛 염료를 염색하고 10단계에서 설명한 대로 사진을 찍으세요.

12. ImageJ 소프트웨어를 이용한 이미지 분석

1. ImageJ 소프트웨어³²를 사용해 이미지를 엽니다.
2. 타 원 형 선택 도구를 사용하여 한 우물에 해당하는 영역을 선택하세요(그림 1A, B).
   참고: 선택 시 결함이 나타나는 우물 경계 영역은 무시하세요. 이들은 일반적으로 우물 가장자리에 존재합니다.
3. 새 이미지를 복사하고 생성하기: 선택한 영역을 Ctrl + C를 눌러 복사; Ctrl + N을 눌러 새 이미지 파일을 생성; 복사한 이미지를 Ctrl + V로 새 검은 창에 붙여넣으세요.
   참고: 새 이미지를 만들 때는 기본 설정을 사용하세요: 8비트, 검은색으로 채우기, 512 x 512 픽셀, 그리고 한 개의 슬라이스(그림 1C).
4. 다음 위치로 이동하세요: 이미지 > >임계값 조정 또는 Ctrl + Shift + T 버튼을 누르세요 (그림 1D).
5. 임계값 창에서 Huang 과 Red 옵션을 선택한 후 Auto (그림 1E)를 클릭하세요.
6. 분석(Analyze)을 클릭한 후 입자 분석(Analyze Particles)을 선택하세요(그림 1F). 기본 옵션은 나타나는 창에 그대로 두고 확인(OK)을 클릭하세요 (그림 1G).
7. 새로운 창문이 열릴 거야. %Area에 표시된 값을 복사하여 기생충 증식 또는 억제 비율을 계산합니다.
8. 이 단계를 판의 각 웰에 대해 반복하세요.
9. 확산 비율을 계산하려면 다음 공식을 사용하세요:
   확산 비율 = (잘 처리된 면적/면적 통제 우물) × 100
10. 억제 비율을 계산하려면 다음 공식을 사용하세요:
    억제 비율 = [1- (처리된 면적/대조 구역 비율)] × 100

그림 1: ImageJ 소프트웨어에서의 결과에 대한 단계별 분석. (A) "타원" 도구 선택. (B) 이미지 내 관심 영역 선정. (C) 추천 설정이 포함된 새 이미지 창(Ctrl + N). (D) 관심 영역을 새 이미지 창에 붙여넣은 후 "임계값 분석" 단계. (E) 임계값 창에서 황과 빨간색 옵션 선택이 가능해 모든 흰색 영역이 빨간색으로 채워집니다. (F) "입자 분석"에 사용된 단계의 순서. (G) 입자 분석에 사용되는 설정. (H) 전체 파괴 면적의 백분율 결과는 요약 창에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

13. 통계적 분석 sis

1. 확산 억제 비율을 계산한 후 Office 소프트웨어 내 엑셀 스프레드시트에 데이터를 정리하세요.
2. GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 열고, XY(새 표 및 그래프 아래)를 클릭하세요.
3. Y 섹션("X:오류 바" 아래)에는 데이터 반복 횟수(일반적으로 생물학적 복제 3회)를 입력합니다. 이 수치는 수행된 반복 횟수에 따라 달라질 수 있습니다.
4. 그래프 옆에서 '평균 전용' 을 선택하고, '이미 계산된 다른 곳에서 오차 값 입력 및 그래프'를 선택한 후 생성을 클릭하지 마세요.
5. 농도 데이터는 X축에, 증식 억제 비율 데이터는 A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5 열에 배치합니다.
6. = Analyze를 클릭하고 Transform을 클릭한 후 OK를 누르세요. 새로운 창문이 열릴 거야. 이 새 창에서 X = Log(X)를 사용해 X 값을 변환하는 것을 클릭한 다음, 결과의 새 그래프 만들기를 클릭한 후 확인 버튼을 누르세요.
7. = 분석(Analysis )을 클릭한 후 정규화(Normalize)를 클릭하세요. 새로운 창문이 열릴 거야. ' 0%는 어떻게 정의되는가?' 섹션에서 클릭하고 Y = 0.0을 설정하세요. ' 100% 정의는 어떻게 되나요?' 섹션에서 클릭하고 Y = 100을 설정하세요; Percentages 를 선택하고 결과의 새 그래프 만들기를 클릭하세요.
8. 기호를 클릭하세요: 위에 위치한 비선형 회귀가 있는 곡선을 맞추 기 = 분석. 용량-반응 - 억제를 클릭한 다음, 로그(억제제) 대 정규화 반응 - 가변 기울기를 클릭한 후 확인을 클릭하세요.
   참고: 다음 결과가 표시되는 창이 열립니다: IC₅₀ (억제 농도 50%), 95% 신뢰구간, 그리고 R2 값. 이 값들은 매우 중요하며 기사 내 결과 표에 포함되어야 합니다.
9. IC₂₅, IC₉₀, IC₉₅와 같은 다른 억제성 농도를 추정하려면 링크(https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm), Quick Calcs - GraphPad를 사용하세요; EC: 유효 농도. 각 약물에 대해 Prism 소프트웨어가 얻은 IC₅₀ 과 HillSlope를 보고하세요.

결과

치료 후 플라크 분석 평가를 위해서는 양성(타키조이트 감염 및 미처리 세포)과 음성(0.1% DMSO를 가진 미감염 세포) 모두가 중요합니다. 실험 종료 시 양성 대조 우물은 부착된 세포의 잔해가 있는 명확한 빈 공간을 보여야 합니다(그림 2). 반면, 네거티브 컨트롤 우물은 빈 공간이 없는 온전한 단일층을 보여야 합니다. 음의 대조군은 단층의 완전성과 세포의 생존 가능성을 실험 전반에 걸쳐 확인하는 데 매우 중요합니다. 양성 대조군은 검사된 화합물/약물에 의한 T. gondii 증식 억제 비율을 계산하는 기준 자료 역할을 합니다; 따라서 정확한 평가를 위해서는 명확한 플라크가 있는 온전한 세포 단층 잔해가 필요합니다. 대조군을 확인한 후 처리된 우물을 평가하세요.

그림 2는 예상된 결과를 보여줍니다. 음성 대조군은 잘 보존된 단일층을 보여주고, 양성 대조군...

토론

항확산 검사의 새로운 프로토콜 표준화는 미래 약물 식별에 관한 과학 연구를 진전시키는 근본적인 단계입니다. 여기서 제시된 프로토콜은 T. gondii 의 타키조이트에 대한 생체 활성 분자의 활성을 시험관 내에서 평가하는 대안적 접근법을 제시합니다.T. gondii는 필수적인 세포 내 기생충으로, 활공 운동으로 이동하기 때문에, 기생충이 용해된 세포에서 빠져나올 때 이전에 감염된 세포 근처에 위치한 세포를 침범하게 됩니다. 따라서 기생충이 증식함에 따라 명확한 파괴 영역(그림 2)이 형성되며, 이는 탈출한 기생충 수와 침입된 세포 수에 비례하여 T. gondii 증식을 측정할 수 있게 합니다.

플라크 분석은 다양한 농도의 여러 분자를 검사할 수 있게 하며, 현미경 정량 분석에 필요한 유사한 실험실 구조를...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신-EDTA	라이프 테크놀로지	25300-062
10 mL 혈청 피펫	올렌	K17-110
15mL 팔콘관 원심분리기	파넴	모델: 206
5mL 혈청학적 피펫	올렌	K17-115
6웰 배양판	사르스테트	833920
분석 균형	메틀러 톨레도	모델: AB204 일련번호: 1116473813
항생제-항균제(100X)	라이프 테크놀로지	15240-062
자동 피펫	카스비	K1-에이드
원심분리기	에펜도르프	모델 5415 R 일련번호: 0023591
CO2 인큐베이터	PHC 코퍼레이션	모델 번호: MCO-230AICUVL-PA 일련번호: 210360090
배양병 25 cm2	사르스테트	833910
디메틸설폭사이드(DMSO) P.A.	머크	1,02,95,21,000
에탄올 P.A	머크	1,00,98,31,000
태아 소 혈청 (FBS)	라이프 테크놀로지	12657-029
포름알데히드 37-38%	판레악	131328
그래프패드 프리즈앤 nbsp;	그래프패드 소프트웨어	-	버전 8.0.1
이미지J  소프트웨어	-	-	버전 1.52e
영상 문서 시스템	바이오-래드	모델:  케미닥 MP 영상 시스템 일련번호: 734BR2249
층류 후드	베코 두 브라질	모델: VLFS-09
L-글루타민 200 mM (100X)	라이프 테크놀로지	25030-081
마이크로 튜브 0.5 mL	사르스테트	72,699
신생아 정상 인간 피부 섬유아세포(NHDF)	론자	CC-3132	브라질 피오크루즈 파란 & 아케트의 실라 나르델리 박사가 관대하게 제공해 주셨습니다.
노이바우어 챔버 0.100 mm 0.0025 mm²	새로운 광학 장치	7301-1
pH미터	미크론	모델: B374 일련번호: 30/37
피펫 20-200 및 마이크로; L	Kasvi 기본	22032893
피펫 2-20 및 마이크로; L	랩메이트 프로	656630226
피펫  0.2-2 & 마이크로; L	랩메이트 프로	556610114
피펫  1000-5,000 & 마이크로; L	유니사이언스	YM4A021482
피펫  100-1000 및 마이크로; L	에펜도르프 리서치 플러스	Q34354C
인산칼륨 단염기성   (KH2PO4) P.A	신스	01F2002.01.AF
RPMI-1640 미디엄	시그마-올드리치	R0883
염화나트륨(NaCl) P.A.	크로몰린 퀴아큐트; 마이카 피나	-
인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4) P.A.	CRQ 프로듀토스 키미코스 에이렐리	R2715920500
팁 1.000 & 마이크로; L	사르스테트	7,01,186
팁 10 & 마이크로; L	사르스테트	7,03,010
팁 5,000 & 마이크로; L	사르스테트	70,11,83,001
팁  200 & 마이크로; L	사르스테트	7,03,030
이송 피펫   (3.5 mL) & nbsp;	사르스테트	86,11,71,001
튜브 15 mL	사르스테트	6,25,54,502
바이올렛 크리스탈	머크	101408
보텍스 믹서	피닉스	모델: AP56 일련번호: 6633
워터 배스	브라질 헤모키미카	모델: HM1003 일련번호: 700001556