마우스의 근육 및 말단 슈반 세포에서 미토콘드리아 형태의 현장 정량화 방법

Summary

미토콘드리아 염료 표지 말단 미토콘드리아의 국소 주입 시 생 체 내 공초점 현미경 검사. 이 방법은 건강한 근육을 가진 쥐와 병든 쥐의 골격근 조직에서 입증된 개념 증명을 활용하여 고해상도 미토콘드리아 시각화를 제공합니다.

Abstract

미토콘드리아 네트워크 형태는 세포 건강을 나타내는 지표로 널리 사용됩니다; 그러나 온전한 조직 내에서 미토콘드리아 구조를 정량화하는 것은 여전히 기술적으로 어려운 과제입니다. 신경근 접합부의 유지와 재생에 필수적인 말단 슈반 세포(tSC)는 해부학적 위치와 조직 파괴에 대한 민감성 때문에 현장에서 분석하기가 특히 어렵습니다. 이 프로토콜은 표준 공초점 현미경을 사용하여 전체 골격근과 쥐의 tSC에서 3차원 미토콘드리아 네트워크 형태를 표지하고 정량화하는 재현 가능한 접근법을 설명합니다. 이 방법은 막 전위 민감 미토콘드리아 염료를 생체 내에서 전달한 후 빠른 조직 처리 및 고해상도 공초점 이미징을 사용합니다. 이미지 스택은 미토콘드리아 네트워크 연결성, 면적, 단편화를 정량화하기 위해 분석됩니다. 이 프로토콜은 미성화 및 건강한 골격근에서 미토콘드리아 형태의 예상 차이를 확인하기 위해 먼저 검증되었으며, 이후 S100β 리포터 마우스를 이용해 확인된 tSCs의 미토콘드리아 네트워크를 시각화하고 정량화하는 데 적용되었습니다. 이 접근법은 형질전환 미토콘드리아 리포터나 특수 영상 플랫폼 없이도 온전한 신경근 조직 내 미토콘드리아 형태를 분석할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 대학 핵심 시설에서 일반적으로 구할 수 있는 장비만 필요하며, 다른 얇거나 표면적으로 접근 가능한 조직에도 적용할 수 있습니다.

Introduction

미토콘드리아는 세포의 폐 역할을 하는 매우 가소성 소기관으로, 대사 요구에 반응하여 세포 호흡 중 산소를 소비하여 아데노신 삼인산(ATP) 생성을 지원합니다^1. 과거에는 분리된 소기관으로 여겨졌으나, 현재는 미토콘드리아가 ^2,3,4로^{고도로 통합}되어 있으며, 국소적 요구에 따라 네트워크 전반에 걸쳐 에너지 기질을 공유한다는 점이 이해되고 있습니다. 통합은 분리에 비해 뚜렷한 이점을 제공합니다: 연결된 미토콘드리아는 에너지 결핍을 지원하며, 대사 요구가 높아질 때 산화적 인산화를 위한 전기화학적 구배를 유지합니다. 실제로 미토콘드리아의 분포, 부피, 형태는 그 주변의 에너지 요구에 잘 맞습니다. 건강 분야에서는 미토콘드리아 네트워크의 규칙적인 교체가 미토콘드리아 생합성, 융합 및 핵분열 사건, 그리고 미토포지 ^2,3을 통해 유지됩니다. 건강한 미토콘드리아를 유지하고 확장하기 위해서는 미토콘드리아 생합성이 필요합니다. 신체 운동과 같은 대사 요구는 과산화체γ 활성화된 수용체 1α(PGC-1α^)의 발현을 증가시킵니다. 이 과정은 1차 지구력 신호, 특히 운동 유발 AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK), 칼슘, 활성산소 종 ^6,7의 증가를 통해 일어납니다. 융합은 네트워크를 확장하여 생존 가능성을 높이고 결핍을 보완하며, 핵분열은 기능 장애 영역 ^2,3,8을 우선적으로 배제함으로써 추가적인 미토콘드리아 손상을 완화합니다. 제거 후에는 미토파지(mitophagy)를 거쳐 기능 장애가 있는 소기관과 단백질의 축적을 방지해야 합니다 ^6,9.

골격근은 체중의 약 40%를 차지하며, 유산소 대사와 세포 신호 전달을 위해 미토콘드리아에 의존하여 항상성을 유지합니다¹⁰. 전체적으로, 골격근 기능 장애 상태에서는 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘이 손상됩니다¹⁰. 근육 기능 장애 연구는 일반적으로 미토콘드리아 호흡, 용피, 형태, 활성 산소종(ROS) 생성을 측정하여 미토콘드리아의 질을 평가합니다 ^3,10. 이와 관련해, 장기간 근육 기능 장애 동안 미토콘드리아 호흡은 감소하고, ROS는 증가하며, 네트워크는 ^{3,10 3.10}으로 분열됩니다. 미토콘드리아 형태의 교란은 주로 미토콘드리아 핵분열 단백질인 다이나민 관련 단백질 1(DRP1)과 미토콘드리아 핵분열 1(FIS1^)2,8,11의 활성화에서 발생합니다. 근육 위축에 대응하여, 외미토콘드리아 막 표면에 위치한 FIS1은 DRP1을 여러 개의 DRP1 이머와 올리고머화하여 미토콘드리아 주위에 필라멘트를 형성하고, 크기가 줄어들어 특정 미토콘드리아 조각이 '집혀' 나가면서 단편화를 촉진합니다 ^3,11. 미토콘드리아 핵분열의 과활동, 새로 형성된 미토콘드리아의 융합 감소, 그리고 기능 장애가 결합되어 비활성 또는 병든 근육에서 설명되는 기능장애 미토콘드리아 네트워크의 단편화된 외관을 초래한다 ^2,12.

신경근 접합부(NMJ)는 근육 흥분이 일어나는 부위입니다. 체세포에서 시작된 활동전위는 축삭을 따라 전파되며, 축삭은 척수로 덮여 수초화된 슈반 세포(SC)에 의해 봉쇄되며, NMJs는 말단 슈반 세포(tSC)에 의해 캡슐화됩니다. NMJ는 부상 후에도 재생될 수 있습니다. 그러나 손상 부위와 뇌동맥 사이의 거리가 증가함에 따라 재생 가능성과 속도가 감소합니다^13,14. 절단, 압박, 늘어남에 의한 신경 손상 후, SCs는 탈수초화된 전구체 유사 상태로 탈분화한다^15,16. 탈수초화된 척삭세포는 증식하며 대식세포와 협력하여 손상 부위와 근위 축삭 절단기 사이의 잔해를 제거함으로써 재생을 위한 국소 환경을 재형성하는데, 이는 월러식 퇴행을 거치는 과정입니다^17,18. 이동하는 SC는 염증 반응을 신호로 보내 성공적인 신경 재생을 위해 환경을 재구성합니다¹⁸. 신경 재생은 전구세포 유사 SC에 의해 형성된 신경 껍질 내부에서 일어나며, 이 SC는 분저 띠를 형성하고, 이를 통해 축삭이¹⁹번 다시 자라납니다. 축삭 절단부는 다시 신경 신경¹⁴를 시작하기 위해 섬유지부를 확장합니다. 재신경 후, tSC가 NMJ²⁰에서 재투자하는 조건으로 시냅스 전부는 완전히 재생될 수 있습니다.

미토콘드리아 형태는 세포 유형마다 현저히 다르며, 조직 기능²¹에 부합합니다. 간 조직 보고에 따르면 미토콘드리아는 더 조밀하고 구형인 반면, 뇌의 백질은 더 길고^{관 모양입니다}. 노화나 산화 스트레스 조건과 같은 도전 상황에서 이 조직의 미토콘드리아는 도넛 형태의 표현형을 보입니다. 그러나 골세포에서는 미토콘드리아 도넛 형성과 파편화가 미토콘드리아 및 미토콘드리아 유래 소포의 분비 증가, 그리고 골세포 성숙과 연관되어 있었다²³. 골격근 미토콘드리아 네트워크는 여러 종에 걸쳐 광범위하게 연구되었지만, 말초 신경계의 tSCs에서 미토콘드리아 네트워크를 영상화하는 데는 여전히 한계가 남아 있습니다. 이들은 세포 초구조가 분리 후 크게 변하기 때문에 원래 환경에서는 포착하기 어렵고, 생 체 내에서 염료로 표적화하기 어렵기 때문에 골격근에 부하가 더해지기 때문입니다.

생명체 내 미토콘드리아 형태를 포착하는 데 사용되는 영상 기술은 광현경 또는 전자현미경으로 분류할 수 있습니다^. 전통적인 광 포획 현미경에서는 염료가 살아있는 세포를 표지하고, 고정 세포를 면역 표지하며, 미토콘드리아를 유전적으로 표지할 수 있습니다 ^5,24. 생세포 영상은 일반적으로 형광 분석 전에 세포를 20–60분 정도 배양해야 합니다. 염료는 막 전위를 통해 미토콘드리아로 유도되므로, 변화된 막 전위 조건에서 변형될 수 있습니다^. 염료 부하를 이용해 골격근 내에서 tSC의 미토콘드리아 형태를 포착하는 것이 이론적으로 가능하며; 하지만 전체 조직의 영상 촬영과 상세한 라벨링 기술이 필요합니다. 특히, 골격근 표지에 방해받지 않고 미토콘드리아를 온전한 구조 내에 포착합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 미토콘드리아 형광 염색을 사용해 건강한 마우스와 이영양증 마우스의 살아있는 골격근을 표지하고, 이어서 tSC 미토콘드리아를 체내 및 현장 영상 촬영을 위해 표지하였습니다. 경골근(TA) 근육은 피상적 해부학적 위치, 잘 특성화된 주입량과 근막 분산^25,26,27, 그리고 동시 기능 측정 적합성 때문에 골격근 영상 최적화를 위해 선정되었습니다. 대둔근(GM) 근육은 확립된 주입 절차^28,29, 배경 형광을 최소화하는 얇은 구조, 그리고 GM과 중둔근 사이의 신경근 접합부의 표면 복측 위치를 바탕으로 tSC 영상 촬영에 선정되어 골격근 섬유보다 먼저 tSC를 우선적으로 표지할 수 있게 되었습니다.

Protocol

6개월 된 수컷(n=3) [야생형(WT)] (RRID: IMSR_JAX:000671) 및 D2.B10-DMD [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), 3개월에서 5개월 된 성체 수컷 수컷과 암컷 B6; D2-Tg(S100-EGFP)^1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [DBA와 차이가 없으므로 WT와 함께 공유함]은 연구자가 관리하는 마우스 집단에서 사용되었습니다. TA 및 GM 주입, 조직 처리 및 영상 촬영의 전체 실험 워크플로우는 그림 1에 요약되어 있습니다. 추가로 D2 한 명. mdx 마우스는 mdx 내 tSC 영상 촬영을 위해 연구자 기증을 받았다(N=1). 모든 동물 시술은 텍사스 A&M 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(AUP 2022-0215)의 승인을 받았으며, 국가 연구위원회의 실험동물 관리 및 사용 가이드(8^판)에 따라 수행되었습니다. 안락사는 이소플루란 과다복용 마취 하에 경추 탈구로 이루어졌습니다.

1. 2 μM 형광 미토콘드리아 염색 작업 용액 준비

1. 제조사 지침에 따라 미토콘드리아 염색(50 μg)을 322 μL 디메틸 설폭화물(DMSO)에 현탁하여 200 μM 스톡 용액을 준비합니다.
2. 2 μM 작업 용액 300 mL를 200 μM 스톡 용액 300 μL를 멸균 식염수 29.7 mL에 옮기세요. 충분히 섞으세요.
3. 2 μM 작업 용액 250 μL을 마이크로 원심분리관에 넣어 -80 °C에서 보관하다가 사용한다.
   참고: -80°C에서 3년간 보관한 후에도 감지 가능한 신호 저하가 관찰되지 않았습니다.

2. 염료 및 동물 준비

1. 실험 15분 전에 냉동 알리코트 하나를 해동하세요. 용액을 30G, 1cc 인슐린 주사기에 담으세요.
2. 동물에게 이소플루란으로 마취하세요. 안과 연고를 바르고, 주사 부위를 면도하며, 동물과 열원 사이에 온도 측정기가 있는 온열 램프를 사용해 체온을 유지하세요.
3. 면도된 주사 부위를 70% 이소프로필 알코올로 깨끗이 닦아주세요.

3. 전경골근(Ta) 근육 미토콘드리아 염료 투여 및 기능

1. TA 염료 투여
   1. 마취된 WT 및 D2.mdx 마우스의 오른쪽 귀 근육에 2 μM 미토콘드리아 염색 50 μL을 주입합니다.
   2. 바늘을 무릎 쪽 힘줄 말단 쪽에 꽂고, 플런저를 누르면서 주사 경로를 따라 바늘을 빼세요.
   3. 해부 전 1시간 동안 생체 내에서 염료를 배양하세요.
2. TA 근육 기능 측정
   1. 염료 배양 45분 후, 이소플루란(유도 2%–3%, 산소 유지 1.5%–2%)으로 마취합니다.
   2. 왼쪽 TA 근육을 외과적으로 노출시키면서 주변 조직은 보존하세요. 원위 힘줄을 근육 테스트 시스템의 하중 빔에 연결하세요.
   3. 노출된 근육을 실험실 티슈로 감싸고, 0.9% 멸균 생리식염수를 40°C로 데운 상태로 3 mL min⁻¹ 에서 관개합니다. 히트 램프를 사용해 근육 온도를 32°C로 유지하세요.
   4. 직접적인 자극을 위해 백금/이리듐 와이어 전극을 근육 복부 위에 배치하세요.
   5. 하중 빔을 마이크로미터에 연결하고 1 Hz의 트위치 수축(T_w)을 이용해 최적의 길이(L₀)를 조정합니다. 디지털 캘리퍼스로 L₀을 기록합니다.
   6. 최대 파상성 수축(P₀)을 140Hz에서 세 번 유도하고, 수축 사이에는 60초의 휴식을 두세요. 가장 높은 힘 값(g)을 기록하세요. 근기능 시스템과 분석 소프트웨어를 사용해 데이터를 수집하세요.
3. TA 조직 처리
   1. 배양 후에는 안락사 전에 TA 근육을 분리하여 해부합니다.
   2. 분리된 근섬유 다발을 4% 파라포름알데히드에 실온에서 15분간 넣고, 입체현미경으로 부드럽게 자극합니다.
      주의: 파라포름알데히드는 독성이 있으므로 적절한 개인 보호 장비(실험실 가운, 장갑, 안구 보호구)를 착용한 채 화학 연기 후드에서 다루어야 합니다.
   3. 세포 과속 핵산 염색을 최종 농도인 5–10 μg/mL로 첨가하여 핵을 표지합니다.
   4. 샘플을 인산염 완충 식염수(PBS)에 3차례 5분씩 세척하여 과도한 염료를 제거합니다.
   5. 50%, 75%, 100% 에탄올에 차례로 5분씩 탈수 샘플을 추출합니다.
   6. 샘플을 조직 정화 용액 I과 II에 각각 30분씩 실온에서 순차적으로 배양하여 조직이 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 부피를 확보합니다.
   7. 투명한 TA 다발을 커버 슬립에 올려놓고 유리 블록(2.5cm ×× 1cm; 무게 7.8g^)으로 부드럽게 납작하게 펴세요.

4. TA 근육 샘플의 영상

1. 공초점 현미경으로 근육 샘플을 영상화하여 고해상도 3차원(3D) 광학 단면을 얻습니다.
2. 근육 촬영 시 63배 배율 대물렌즈(N.A. 1.40)를 사용해 약 100 μm 깊이에서 Z-스택 이미지를 획득합니다.
3. 646 nm의 여기 파장을 가진 영상 시스템의 공초점 소프트웨어를 사용하여 가장 적은 배경으로 최고의 선명도를 제공합니다.
4. 디컨볼루션 모드를 사용하여 1 μm 스텝 크기의 "시스템 최적화" 매개변수를 사용하여 이미지를 획득합니다.
   참고: 탈수와 광표백을 방지하기 위해 조직을 조직 제거 용액 II로 옮겨 커버 슬립에 올려두세요. 영상 촬영 전에 클리어링 솔루션 2를 조직에 직접 두 방울 떨어뜨립니다.

5. GM 근육 tSC 염료 로딩 및 영상

1. TSCs의 특이적 형광 식별을 위해 S100β 마우스를 사용하세요.
2. GM 근육 위에 작은 피부 절개를 하세요. 상처 봉합 전에 GM 아래에 2 μM 원적색 형광 미토콘드리아 염색 75 μL를 주입^합니다.
3. 상처를 봉합하고 조영제를 45분간 배큐하여 근섬유에 큰 표지 없이 tSC를 선택적으로 표지합니다.
4. GM 근육을 해부한 후 즉시 냉장 0.9% 멸균 식염수에 넣으세요. 과도한 지방과 결합 조직을 빠르게 다듬으세요.
5. 해부된 GM을 이미징용 커버 슬립에 옮기세요.
6. D2.mdx 마우스를 사용할 때만 형광 아세틸콜린 수용체(AChR) 염료를 1:500 희석으로 미세해부 욕조에 첨가합니다. 신경근 접합부(NMJ)의 시냅스 후 구성 요소를 시각화하기 위해 조직을 30분간 인큐베이팅하세요.
7. 이 이중 표지 접근법을 사용하여 시냅스 후 미토콘드리아와 tSC 특이적 미토콘드리아를 구별합니다.
   주의: 해부 후 형태학적 변화를 최소화하기 위해 GM 해부 및 세척은 영상 촬영을 위해 커버슬립에 올려놓기 10분 이내로 제한하세요. 이 시간 제한은 해리 후 형태학적 변화와 미토콘드리아 분해를 최소화하는 데 매우 중요합니다.
8. 공초점 현미경을 수행하여 고해상도 3차원(3D) 광학 단면을 얻습니다.
9. 20배 배율 대물렌즈(N.A. 0.75)를 사용하여 tSC의 경우 약 16 μm 깊이에서 Z-스택 이미지를 획득할 수 있습니다. 63배 배율 대물렌즈를 사용해 개별 tSC의 고해상도 대표 이미지를 획득하세요.
10. 영상 촬영 중 조직 탈수와 광표백을 최소화하기 위한 마운팅 절차를 시행하세요.
    주의: 식염수 조직을 커버슬립에 옮기고, 복측 면이 아래로 향하도록 하여 역현미경 검사를 하세요.
11. GM의 등쪽 표면에 일반 마운팅 매체 2 μL을 바릅니다.
12. 교정된 유리 블록(2.5cm × 2cm × 1cm; 질량 7.8g)을 사용해 조직을 부드럽게 평평하게 만들어 균일한 영상면을 확보하세요.

6. 집중 이온 빔 현미경

1. 이전에^정해진 프로토콜에 따라 집중 이온 빔 주사 전자현미경(FIB-SEM)을 수행하세요.
   1. 공초점 영상 중 확인된 새로운 형태학적 특징을 확인하고 시각화하기 위해 FIB-SEM을 적용합니다.

7. 이미지 분석

1. TA 근육 샘플
   1. AI 기반 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 TA 스캔의 공초점 광학 단면(약 75–112 μm 두께)을 정량적으로 분석합니다.
      참고: 알고리즘 적응을 높이기 위해 자동 분할 전에 여러 차례 감독 하에 훈련을 수행하세요.
   2. 단일 광학 단면(Z-슬라이스)을 불러와, 검은 배경은 제외하고 흰색 미토콘드리아 염료를 나타내는 픽셀화된 정보를 소프트웨어에 보존하도록 학습합니다.
   3. 조사관이 검토할 수 있도록 고품질 분석과 정확성을 보장하기 위한 이미지 마스크를 개발합니다.
   4. 알고리즘 최적화 후 3D 이미지 스택을 단일 광학 섹션으로 분리합니다.
   5. 각 3D 이미지에서 다섯 번째 Z-슬라이스를 선택해 분석하며, 각 데이터 포인트는 샘플당 개별 단면들의 평균을 나타냅니다.
   6. 미토콘드리아 형태를 정량화하여 공간적 분포와 네트워크 연결성 지표를 도출합니다.
   7. 모든 샘플에서 강도 임계값, 엣지 검출 설정, 복셀 크기 보정을 표준화하여 실험적 변동성을 최소화합니다.
2. GM 샘플에 대한 tSC
   1. 1 μm 광학 단면을 Z-스택(약 6–25 μm 두께)으로 조립하고, 2D 이미지 분석 소프트웨어를 사용해 이미지를 개별 색상 채널로 분리합니다.
   2. 스케일 바를 사용해 소프트웨어를 보정하고 임계값을 적용하여 배경 간섭을 최소화하면서 tSC 미토콘드리아 시각화를 최적화합니다.
   3. 이분화를 수행하고 배경 잡음을 제거하여 tSC 미토콘드리아 또는 tSC를 분리하여 면적과 입자 수를 측정합니다.
   4. 이진 이미지를 저장하여 일관된 처리를 보장하고, 모든 영상 실험을 동일한 조건에서 수행하여 생물학적 복제 전반에 걸쳐 재현성을 보장합니다.

8. 면역조직화학

1. 왼쪽 TA 근육 샘플을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 삽입하여 단면적(CSA)을 평가합니다.
   1. 10 μm 두께의 절제기를 -17°C로 설정하여 샘플을 제거하고 현미경 슬라이드에 수집합니다.
   2. 토끼 항라미닌 1차 항체(1:400)와 염소 항토끼 로다민 2차 항체(1:400)를 사용하여 라미닌의 근육 단면을 염색하여 근섬유 경계를 식별합니다.
   3. 영상 촬영 전에 적절한 마운팅 매체를 사용해 슬라이드를 장착하세요.
2. 공초점 현미경을 이용해 20배(N.A. 0.75) 대물렌즈로 샘플당 2–3개의 관심 영역(580 x 580 μm)을 무작위로 선택하여 이미지 슬라이드를 촬영합니다.
3. 근육당 영역별 평균 값을 분석하고, TA 근육 단면당 약 400개의 근섬유를 분석합니다.
4. 반자동 근육 분할 소프트웨어를 사용해 근섬유를 가린 채 CSA(μm²)를 측정하세요.

9. 통계 분석

1. 요약 데이터를 평균± 표준오차(S.E.M.)로 보고합니다.
2. 전용 통계 소프트웨어를 사용하여 매개변수적이고 쌍이 없는 학생 t-검정을 사용하여 그룹 평균 차이 간의 유의성을 판단합니다.
3. TA 근육의 CSA와 근력에 대한 간단한 선형 회귀를 수행하며, 이를 DMD 병리학의 지표로 활용하여 TA 근육과 GM tSC의 미토콘드리아 형태를 비교합니다.
4. DMD 병리와 미토콘드리아 병리 간의 상관관계를 파악하기 위해 피어슨 r 상관계수를 평가합니다. 통계적 유의성을 P ≤ 0.05로 정의하라.

Results

미토콘드리아 네트워크는 연결 능력이 감소하는 것으로 예상되었습니다
두 그룹인 WT와 mdx의 TA 근육 공초점 스캔의 대표적인 3D 형광 이미지를 제시합니다(그림 2). WT 그룹과 비교할 때, mdx 마우스의 미토콘드리아 연결성은 WT에 비해 감소한 것으로 보입니다(그림 2A–D). mdx 마우스에서 더 많은 수의 작은 미토콘드리아 조각이 관찰되었습니다 [<100 μm²](WT, 17.3 ± 3.5%; mdx, 36.3 ± 4.9%; P = 0.015) 그리고 WT 마우스에 비해 대형 상호 연결된 미토콘드리아 네트워크 [1000 μm²]의 수가 감소했습니다(WT, 23.5 ± 0.26%; mdx, 16.8 ± 1.02%; P ...

Discussion

미토콘드리아의 세포 구조 내 위치와 형태는 미토콘드리아 건강과 대사 요구와 상관관계가 있습니다²¹. 미토콘드리아 건강의 임상적 중요성과 다양한 세포 유형의 호흡 동역학 및 형태학이 결합된 점을 고려하여, 골격근에서 미토콘드리아 형태를 평가한 후 tSCs의 미토콘드리아 형태를 평가하는 쉽고 적용 가능한 공초점 현미경 기반 방법이 개발되었으며, 이는 생체 내에서 유지하기 어려운 조직 유형에서 형태학적 지표로 미토콘드리아 건강 정보를 제공합니다 격리 시 구조. 이와 관련해, 형광 미토콘드리아 염료를 체 내에서 조절하여 미토콘드리아를 골격근과 tSC 모두에 표지하여 건강과 질병의 기본 형태학적 지표를 정량화할 수 있게 합니다.

골격근은 체중의 40%를 차지하며 호흡, 미오킨 분비, 이동에 필수적이다 ^3...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-in-1 Whole Animal System	Aurora Scientific, Ontario, Canada	1300A	Muscle funciton system with analysis software
AIVIA	Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA	15	AI 구동 이미지 분석 소프트웨어
anti-laminin	MilliporeSigma	L9393-.2mL	myofiber boarder label
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:005621	S100β
Cryostar NX50 Cryostat	Epredia, Kalamazoo, MI, USA	https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50	Cryostat
D2.B10-DMDD2.mdx/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:13141	D2.mdx
DBA/2J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:00671	WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	BP231-100	미토콘드리아 염색 재구성 시약
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	세포 투과성 핵산 염색
ImageJ/Fiji	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	SCR_002285	2D 분석 소프트웨어
Invitrogen ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Fisher Scientific, Hampton, NJ, USA	P36941	실장 매체
KimWipe	Kimberly-Clark, Irving, TX, USA	06-666A	실험실 물티슈
Leica LAS_X software	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	SCR_013673	공초점 소프트웨어
MitoView Fix 640	Biotium	70075-50ug	Far-red 형광 미토콘드리아 염색
NIS-Elements Advanced Research software	Nikon, Melville, NY, USA	SCR_014329	단면적 분석 소프트웨어
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA	#SP15-100	일반 실장 매체
Prism 9 software	GraphPad Software, La Jolla, CA, USA	RRID: SCR_002798	통계 분석 소프트웨어
Rhodamine (TRITC)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	AP132RMI	2차 항체
Stellaris 5 White Light Confocal Microscope and corresponding deconvolution software	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	158301313:158201310:158004752: 158301312:158301314:158401100: 158209011:158301130:158204510: 158301120:158401140:158204511: 15500332:15506428:15506517:155 13859:15521522:15525226:155252 32:15525314:15555009:15555017: 15555046:27100022:155933660: 155933666:155933668:158000640 :158002407:158003150:158004141 :158004201:158004421:158004423 :158200681:158202140:158203114: 158203200:158203220:158204201: 158204510:158204709:158301200: 9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP _CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_ LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C	공초점 현미경
SZ61	Olympus, Breinigsville, PA, USA	sz61	입체 현미경
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA	23-730-571	최적 절단 온도 화합물
Visikol I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1-30	조직 클리어링 용액 1
Visikol II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H2-30	조직 클리어링 용액 2
α-bungarotoxin 552	Biotrend, Koln, Germany	00014	아세틸콜린 수용체 염료