방법 논문

기능과 구조가 보존된 체 외 인간 낙액 조직을 이용한 전임상 접속 모델

DOI:

10.3791/69734

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2026년 3월 20일

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1Department of Emergency Medicine, University of Iowa Health Care, 2Interdisciplinary Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 3Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Iowa Health Care, 4Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Office of Research and Development, Iowa City Veterans Affairs Health Care System, 6Department of Internal Medicine, University of Iowa Health Care, 7Iowa State University, 8Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 활막의 급성 염증, 감염, 구조적 변화를 평가할 수 있는 인간 체외 트랜스웰 시스템을 개발했습니다.

초록

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관절염은 관절 내에서 염증성 상태로 연골 손상, 통증, 운동성 상실을 초래합니다. 최근 관절염 연구의 진전은 관절낭(예: 활막)이 이 염증의 중요한 원인임을 구체적으로 보여주지만, 필수적인 활막 구조를 재현하는 인간 모델은 없습니다. 이를 해결하기 위해 합동 우주 분석 시스템(JSAS)이 만들어졌습니다. 전방 활막은 전무릎 관절 성형술(TKA)을 받은 환자들로부터 수술 중 채취되었습니다. 설막을 해부하여 3mm 생검 코어로 절단하였습니다. 코어는 5 μm 또는 0.4 μm 트랜스웰의 상부 웰에 300 μl DMEM과 10% FBS가 포함된 상태로 배치되었습니다. 하단 웰에는 600μL의 매체가 추가되어 2-3일마다 교환했습니다. 생존 가능성은 고산소(50%), 대기/표준(~21%), 생리적(5%) 잠복 조건에서 최대 7일까지 평가하였다. 하단 웰의 자극에는 단핵구 화학유인체 단백질 1(MCP-1/CCL2), 지질다당류(LPS), N-아세틸 시스테인, S. aureus, B. burgdorferi가 포함되었습니다. 배지는 ELISA를 위해 저장되었고, 조직은 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 분석을 위해 보관되었습니다. 표준 조건에서는 3일간 활막이 완전히 생존할 수 있었다. 자극은 내막 내막 및 아막 내막 세포의 구조와 기능을 변형시켰으며, 여기에는 상주 대식세포 경계의 상실, 서브라이닝 확장, 병원성 섬유아세포의 상향 조절, 그리고 사이토카인 IL-1β와 TNFα의 생성이 포함됩니다. 유세포 분석 결과, 면역 세포와 섬유아세포는 하단 챔버(5 μm 구멍)로 이동했습니다. 이동성 B. burgdorferi 는 0.4 μm 공당 크기에서 조직 내로 이동했으나, 운동성이 없는 S. aureus 는 그렇지 않았습니다. 관련 사이토카인은 ELISA에 충분한 양으로 발현되었습니다. JSAS는 인간 상막의 급성 변화를 연구할 수 있는 모듈형 시스템으로, 생물학적으로 중요한 구조와 기능을 유지하면서도 3D 구조의 복잡성을 전임상 모델에서 연구할 수 있습니다.

서론

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관절염은 미국 성인의 20% 이상, 65세 이상 인구의 50%가 만성 질환을 앓고 있습니다. 1. 또한 전 세계적으로 장애의 주요 원인 중하나입니다. 관절염은 연골 손상뿐만 아니라 관절낭 또는 활막의 염증(예: 활막염)도 포함합니다. 만성 활막염은 골관절염과 류마티스 관절염에서 뼈와 연골 손상을 강화하는 염증성 사이토카인의 주요 원인일 가능성이 높습니다 3,4. 따라서 활막 내 면역 매개 변화를 이해하는 것은 관절염 환자에 대한 새로운 치료 및 예방적 방안을 개발하는 데 매우 중요할 가능성이 큽니다.

설막은 두 개의 주요 층으로 구성된 조직된 구조입니다: 세포 내막(IntL)과 서브라이닝(SubL). IntL은 활액(SF)과 접촉하며, SubL은 SF 구성 요소를 만들고 혈관 구조를 포함합니다. IntL 내에는 대식세포와 섬유아세포 유사 시노비오사이트(FLS)가 모두 존재합니다. IntL의 대식세포는 상주 세포로, SubL6 내 간질성 대식세포에 의해 국소적으로 갱신됩니다. 이 상주 접활 대식세포(RSMs)는 CD206과 TREM2의 발현에 의해 M2 편향되어 상피화되고 타이트 접합 마커를 발현합니다. 이 IntL의 하위 구조는 기능적·물리적으로 관절 공간 항상성 유지에 핵심적일 수 있습니다 5,6. 이는 류마티스 관절염(RA)에서 관찰된 바 있습니다. 예를 들어, IntL이 붕괴되면 류마티스 관절염 환자가 악화 증상을 겪으며, 내막이 재구성되면 증상이 사라집니다 6,7. 자발성 RA 관해는 특히 MerTK +CD206+ 유활 대식세포와 관련이 있습니다7. 급성 관절통 환자의 SF에서도 감염성 또는 염증성 질환의 심각도가 RSMs와 염증성 사이토카인의 양과 상관관계가 있음을 발견했습니다8. 안타깝게도, IntL과 SubL 구조, RSM과 FLS의 기능적 변화, 그리고 연골 및/또는 뼈를 손상시킬 수 있는 염증 매개체 생성 간의 관계는 특히 인간에서 조사하기 어렵습니다.

여러 임상적으로 관련된 환경에서 활막염의 기전을 조사하기 위해, Joint Space Analysis System(JSAS)이라는 인간 체외 모델이 개발되었습니다. 이 시스템은 모듈식 요소를 통해 염증성 및 감염성 관절염에 대한 폭넓은 평가를 가능하게 하여 재현 가능한 결과를 제공합니다. 이 글은 전관절 치환술, JSAS 설계, 활막의 급성 구조 변화를 정량화하기 위한 조직형태계측, 면역형광(IF), RNAscope, 효소 연관 면역흡착 분석법(ELISA) 등 조직의 기능적 반응과 같은 일반적인 개복 관절 수술에서 조직 획득 과정을 설명합니다. JSAS는 IntL 및 SubL 구조를 유지함으로써 일반적인 인간 in vitro 모델과 차별화되어, 연골 손상을 유발하는 급성 또는 급성 만성 활막염에 대한 근 생체 내 통찰을 가능하게 합니다. 상막의 원래 구조를 유지함으로써 염증을 억제하거나 지속시키는 RSM과 FLS의 내재적 능력을 해부할 수 있습니다. 외부 체외 모델로서, 말초 면역 세포를 유활 대식세포로 분화하거나 1-2개의 개별 세포 유형으로 과도하게 단순화할 필요도 없습니다. 이 방법은 자연적으로 병든 인간 조직을 사용하여 병원체 특이적 평가를 가능하게 한다는 점에서 콜라겐 유발 관절염(CIA)과 같은 동물 모델과 차별화됩니다. 마지막으로, 여러 감염을 시뮬레이션하여 골관절염과 염증성 관절염 외에도 패혈성 관절염 모델을 만들 수 있습니다. 주요 제한은 세포자멸사 시작 전 표준 조건에서 3일간 배양하는 것입니다.

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프로토콜

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환자 동의 및 조직 처리 프로토콜은 지역 기관심의위원회(IRB)에서 승인되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 조직 채취 및 생검

  1. 외과의사의 일정에 따라 수술 전 환자를 식별하세요. 전신 면역조절 약물을 복용하지 않은 18세에서 65세 사이의 환자를 모집합니다. 예를 들어 전무릎 관절 성형술(TKA) 또는 경골결절 절골술(TTO, 일명 풀커슨 병)과 같은 개방 관절 수술을 받고 있으며, 전신 면역조절 약물을 복용하지 않은 환자들입니다.
    참고: 이상적으로는 섬유증으로 인해 다른 집단보다 수술 중 조직 획득 실패가 더 높았던 환자들 중 관절경 검사 또는 글루코코르티코이드 주사를 한 환자는 제외해야 합니다. 감염 전이 위험성을 고려할 때, C형 간염 또는 인간면역결핍바이러스(HIV) 병력이 있는 환자의 모집은 결과와 관련이 없는 한 연기해야 합니다. 감염병 상태와 관계없이 신선한 인간 조직을 항상 안전하게 취급하세요.
  2. 정형외과 의사들은 표준 수술 절차의 일환으로 관절 절개술과 해리술을 수행합니다. 업차골 바로 근처의 전방 활막을 확인하고, 전기소작술로 절제하여 관절근이나 내측 및 외측 상과근 박리를 피하세요. 유골절제술은 TKA 결과에 비교적 중립적이며, 염증성 상태에서는 유익할 수 있습니다 9,10. 활막을 멸균하여 연구팀원에게 전달하고, 냉랭한 Dulbecco's 인산염염수(DPBS)와 함께 얼음 위에 멸균 표본에 넣습니다.
    참고: 수술팀이 이상을 발견하거나 유골절제술이 폐쇄나 수술 결과를 저해할 경우 조직 획득을 중단하십시오. 특히 후자는 TKA에서 매우 드문 경우인데, 슬로비움 절제술은 팽팽한 관절을 풀기 위한 확장 시술로 사용될 수 있기 때문입니다. 절제 양은 실험 크기에 따라 달라집니다. 조직 1 cm2 당 약 4개의 3mm 생검 코어를 얻을 수 있습니다. 많은 경우 24cm2 이상의 조직을 얻을 수 있습니다. 조직 중량은 외과적 해부에 크게 의존하기 때문에, 실험의 적절성을 판단하는 데 표면적만큼 신뢰할 수 없습니다. 그림 1 은 1.2-1.7단계를 보여줍니다.
  3. 시노브를 실험실로 돌려보내고, 플레이트 로커 위에서 차가운 DPBS로 10분간 두 번 세척하세요.
  4. 활막을 멸균 조건 하에 10cm 이상의 멸균 페트리 접시로 옮기고, 생물안전 등급 2(BSL2) 인증 생물안전 캐비닛 내에서 보관합니다. 차갑고 멸균된 저포도당 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지를 나트륨 피루베이트와 L-글루타민을 넣어 접시의 절반만 채우세요. 활막 내막은 진주빛 IntL 층(그림 2A)으로 식별하며, 지진 쪽(그림 2B)을 구분합니다.
    참고: 국제연합은 취약하다. 벗겨내지 않도록 주의하세요. 그렇지 않으면 서브라이닝에서 분리될 수 있습니다(그림 2A, 혈전고정기로 잡아줌). 진주는 혈증(헤모시데린으로 인해 노란-주황색으로 보임), 높은 BMI(지방으로 덮임), 염증(붉고 부서지기 쉬우며 융모)의 병력에 의해 변화할 수 있습니다. 진행 전에 IntL을 정확히 식별하는 것이 절대적으로 중요합니다. 수술 절제, 소작, 출혈, 응고 징후가 있는지 주의 깊게 관찰하여 다음 단계들이 IntL에서 이루어지지 않고 있는지 확인하세요.
  5. 지진 쪽의 불필요한 지방 조직과 기질 조직을 제거하여 상막을 분리하고, 모든 부위에 약 4-5mm 두께의 조직 깊이를 유지합니다. 아이리스 가위나 메스는 개인 취향에 따라 사용할 수 있습니다. 시야를 유지하기 위해 페트리 접시 매체를 필요에 따라 변경하세요.
    참고: 후방 기질 또는 지방 조직은 쉽게 절제할 수 있습니다. 그러나 해리 장애나 강한 저항감은 인대 보유, 부적절한 연골 침착과 같은 조직 화생, 또는 IntL을 절단하는 것을 나타냅니다.
  6. 적절한 깊이로 해부된 후에는 최소 2회의 기술 복제를 위해 필요한 3mm 생검 코어를 확보합니다. 활막 내면이 페트리 접시 표면에 닿지 않고 코어링 도구를 향하도록 하여 작업하세요. 고품질 생검 펀치는 둔탁한 생검 펀치는 내부 내막 구조에 손상을 일으킬 수 있기 때문에 약 10-15번 사용될 수 있습니다.
    1. 강한 수직 하중과 부드러운 비틀림으로 코어 채굴을 수행하세요. 만약 조직이 비틀리면 생검 도구가 무뎌져 교체가 필요합니다. 비우세 손으로 겸자나 지혈 고정기를 사용해 안정화하세요.
      참고: 3mm 코어는 조직 관류를 극대화하고 환자당 코어 수를 늘리고 이 실험에 충분한 기술적 복제를 보장하기 위해 사용되었습니다. 다른 크기의 코어도 사용할 수 있으나, 이 프로토콜에서는 3mm만 테스트되었습니다.
      참고: 해부 부족으로 인한 과잉 보존 지방은 핵이 JSAS에 떠 있을 수 있어 최적이 아닌 상태입니다. 코어가 잠긴 채로 남아 있지 않고 표면으로 떠오른다면 다시 해부하거나 잠긴 코어를 선택하세요.
  7. 두 번째 페트리 접시를 열고 10% FBS를 넣은 37°C의 데운 배지 5-10mL를 채웁니다. 납작하거나 이빨이 없는 겸자로 코어를 이 접시에 옮겨 1-2초의 부드러운 기계적 저어주기로 이물질을 씻어내세요. 코어를 꽉 꼬집지 마세요. 그렇지 않으면 내막이 손상될 수 있습니다.
    참고: 37°C, 5%CO2 표준 설정에서 조직 코어를 인큐베이터에 넣어 ≤24시간 동안 잠시 멈출 수 있습니다.

2. 합동 우주 분석 시스템(JSAS) 구축

  1. JSAS 하단 웰에 10% FBS가 포함된 600 μL 가열(37 °C) 저포도당 DMEM을 준비합니다. 1% 페니실린-스트렙토마이신은 이 시스템에서 눈에 띄는 부정적 영향 없이 시험되었으나, 불임이 충분히 유지되면 보통 배지에 항생제를 첨가하지 않습니다.
    참고: 박테리아와 공동 배양하거나 다른 배지가 필요한 세포주와 함께 배양할 경우, 하단 우물은 다른 배지일 수 있습니다. 박테리아와 함께 배양할 경우 항생제 배지를 피하세요.
  2. 하단 우물에는 선택한 처리를 추가하세요. 예를 들어, 지다당류(LPS)가 있습니다. 삼투압 차이를 피하기 위해 처리 부피는 전체 부피의 2.5%를 넘지 않는 것이 권장됩니다(예: 600 μL에 대해 ≤15 μL). 처리로 인한 pH 변화는 완충하여 pH 7.0-7.4를 유지하세요. 그렇지 않다면 차량 조작 장치를 활용하세요.
  3. 원하는 실험 결과에 따라 트랜스웰 기공 크기를 선택하세요(그림 3).
  4. 트랜스웰에 10% FBS를 포함한 저포도당 DMEM 300 μL를 추가합니다.
  5. 멸균 겸자로 개별 코어를 조심스럽게 트랜스웰 배지에 옮기세요. 조직의 방향은 제어할 수 없으며; 그러나 기질 조직의 지방 형성과 자연스러운 부력 때문에 대부분의 조직 코어에서 내막 내막이 아래쪽으로 향하게 됩니다.
    1. 코어 채취 과정이 내부 내막을 방해할 수 있으니 코어를 신중히 시각화하고, 실험 초기에 해진 듯한 코어는 사용하지 마세요. 코어가 떠 있다면 해부를 개선하고 대체 코어를 선택하세요.
      참고: 조직 배열이 중요하다면 콜라겐 매트릭스를 고려하세요; 하지만 이로 인해 바닥 우물과 화학적 구배가 형성되는 데 영향을 줄 수 있습니다.
  6. 인큐베이터에 37°C,CO2 5% 온도에서 원하는 일정 시간 동안 보관합니다.
    참고: 생물학적 변화를 위한 가장 이른 권장 시점은 8시간입니다. 생물학적 활성 현상의 최신 검증된 시점은 3일입니다.

3. 실험적 해체 및 분석

  1. 조직학 검사에서는 멸균된 비이빨 겸자를 사용해 조직을 3-5mL 10% 중성 완충 포르말린(NBF)으로 옮겨 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 분석을 수행하세요. 삽입과 단면 작업 전에 NBF에서 3-7일 동안 보관하세요.
    1. 조직을 오랜 시간 방치하지 마세요. 이는 자가형광을 악화시킵니다. 표준 방법에 따라 IF13을 이용한 조직형량 측정, 면역형광(IF)12 및/또는 RNAscope를 위한 조직학적 분석을 수행합니다.
      참고: 조직을 제거할 때 겸자로 트랜스웰을 찔리지 않도록 주의하세요. 코어를 옮길 때 매우 부드럽게 해야 하며, 그렇지 않으면 내막이 해리될 수 있습니다. 심부를 부드럽게 고정제에 넣고 자극하지 마세요. NBF는 인증된 화학 연기 후드 내부에서 사용해야 하며, 지역 환경 보건 및 안전(EHS) 지침에 따라 폐기되어야 하며, 싱크대에 부어 넣어서는 안 됩니다. 실험에서 사용되지 않은 인간 조직은 10% 표백제 과도에 30분간 방치된 후, 지역 환경안전보건(EHS) 기준에 따라 2차 격리실에 넣고, 라벨이 붙은 생물학적 위험 용지함에 담아 소각됩니다. 지역 환경보건국(EHS)의 승인이 있으면 표백제 용액을 싱크대에 부을 수 있습니다. 기관에 따라 다를 수 있는 지역 지침을 따르세요.
  2. 동일한 FFPE 블록에 기술적 복제 데이터를 삽입합니다. 샘플 손실을 피하려면 선별된 카세트를 사용하세요. 5 μm 두께의 종축 단면. 한 슬라이드에 세 개의 직렬 섹션을 배치합니다(보조 그림 1).
  3. 밝시야 현미경을 이용한 10배 및 40배 슬라이드의 H&E 이미지. IntL을 조직과 빈 공간 사이의 경계점에 있는 조직화된 세포층으로 식별하세요.
    1. 각 처리 조건당 최소 2회의 기술 복제에 걸쳐 3개의 대표 10배 절면과 10개의 대표적인 40배 절면을 확보하여 IntL을 시야에 유지합니다. 고해상도 TIFF로 이미지를 캡처하세요. 조직형태측정 분석 수행:
    2. ImageJ/FIJI에서 측정을 수행하세요. 먼저, 분석 메뉴→ 척도 설정 메뉴를 사용해 척도를 설정하세요. 세트 스케일은 각 현미경에서 각 대물렌즈에서 영상화한 교정 슬라이드를 사용해야 합니다. 먼저, 보정 슬라이드 이미지를 기반으로 길이가 알려진 직선 도구를 사용해 선을 생성합니다. 스케일을 전역적으로 할당하세요.
      참고: 10배 기준으로 스케일은 3 px/μm입니다. 40배 시에는 12 px/μm이 됩니다.
    3. 직선 도구를 사용해 10배 이미지를 사용해 서브L 두께를 측정하세요. 두께를 IntL 표면에서 SubL 바닥까지의 수직 깊이(μm)로 측정합니다. 각 선을 그린 후에는 키보드 단축키인 m 을 사용해 선의 길이를 측정하세요.
      1. 10배 이미지당 최소 5번의 측정값을 평균화하세요(그림 4A, B). SubL과 기질 조직 사이의 전이는 덜 조직화되고 세포가 덜 조직화된 콜라겐과 지방 부위로의 전이로 구분됩니다(그림 4B). 조직 구획 사이의 전이 지점을 반으로 가라앉히세요.
    4. IntL 두께, IntL 세포성, IntL 무결성, SubL 세포성의 40배 측정을 위해서는 Adobe Photoshop(또는 유사한 이미지 편집기)에서 40배 TIFF를 열어 시작하세요. IntL은 1~5세포 두께의 층으로, 조직과 빈 공간(예: 활액) 사이의 경계면에서 뚜렷한 세포층으로 조직되어 있습니다(그림 4C).
    5. 새로운 레이어를 생성하세요. 폴리곤 올가미 도구를 선택하세요. 마우스 클릭으로 올가미를 시작하고 선에 앵커 굴곡을 설정하여 이미지 전체에 걸쳐 IntL과 SubL 사이의 전환을 이등분시킵니다. 그 다음 빈 공간에서 IntL 바로 바깥쪽에서 올가미를 계속 사용하세요.
      1. 올가미를 더블 클릭으로 닫아. 선택한 영역을 뒤집고(역방향 선택→), 페인트 버킷 도구를 사용해 검은색으로 공간을 채우세요. 이렇게 하면 IntL이 아닌 모든 영역을 커버합니다. 이 이미지를 IntL을 나타내는 고해상도 JPG로 저장한 후 레이어를 숨기세요.
    6. 새로운 레이어를 생성하세요. 폴리곤 라쏘 설정에서 교차 기능을 선택하면, 새 라쏘 영역과 이전 라쏘 영역이 만나는 지점만 선택됩니다. 서브라이닝 레이어를 IntL의 중앙을 클릭해 감고, 이미지의 좌우 가장자리를 배경 캔버스로 연결한 뒤, SubL과 그 뒤의 무세포 조직 사이의 전이 부분을 반으로 가릅니다.
      1. SubL 하단이 40x 이미지 크기를 초과하면, 남은 가장자리 주변의 배경 캔버스를 선택하면 됩니다. 다시 말하지만, 위와 같이 이 영역의 역을 선택한 후, 페인트 버킷 도구를 사용해 검은색으로 채우세요. 이 이미지를 SubL을 나타내는 고해상도 JPG로 저장하세요. 이 레이어드 이미지를 PSD로 저장해 두세요.
        참고: 적혈구는 이 슬라이드에서 흔히 나타나며, 향후 세포 수 측정에 방해가 될 수 있습니다. 혈관 영역이 넓다면, 다각형 올가미 도구, 페인트브러시 도구 또는 기타 도구를 사용해 이 영역을 덮는 별도의 레이어에 마스크를 생성하세요.
    7. FIJI에서는 IntL 마스크 이미지를 엽니다. 3.3.2-3.3.3 단계에 따라 직선 도구를 사용해 40배 이미지 전체에서 최소 5번의 측정 평균으로 IntL 두께(μm)를 측정합니다.
    8. 분할선 도구를 사용하여 IntL의 총 길이(μm)를 측정합니다. 그 다음 분할선 도구(Figure 4D, E)를 사용해 온전한 영역의 길이만 측정합니다. 온전하지 않은 IntL 절편은 세포 사이의 틈, 나방에 먹힌 모습, 조직에서 IntL이 부서지거나 벗겨지는 것으로 구분됩니다.
      1. (온전한 IntL/총 IntL)*100으로 계산합니다. 이 부분은 섹션 아티팩트를 보정하기 위해 동일한 시간점 제어와 비교해야 합니다.
    9. IntL 마스크 이미지를 사용하여 IntL의 셀룰레이도를 측정합니다. 먼저, 8비트로 변환합니다(이미지 → 타입 → 8비트). 그 다음 임계값(이미지 → 임계값)을 사용하여 잡음을 최소화하고 셀 식별을 극대화합니다. 임계값 메뉴에서 어두운 배경 을 선택 해제하고 하단 토글을 사용해 조정하세요.
      1. 원본 핵체 수를 유지하면서 노이즈(예: 배경 아티팩트)가 사라지는 것을 통해 이미지별 임계값을 수동으로 결정합니다. 원본 이미지를 자주 비교해 충실도를 유지하세요. 잡음이 최소화되면서(거짓 양성) 헤마톡실린 신호가 최대화되면(진짜 핵 양성), 임계값 설정이 적절합니다(보완 그림 2).
        참고: 임계값은 단일 슬라이드 스캔 간에 일관되지만, 슬라이드 스캔 간뿐만 아니라 개별 10배 또는 40배 이미지 간에도 다릅니다. 또한 H&E 배치마다 색상 깊이가 일정하지 않아 차이가 있을 수 있습니다. 따라서 단순 매크로는 환자, H&E 배치, 단면 두께, 조명 조건(방 또는 현미경 밝기/색온도), 이미지 획득에 사용되는 소프트웨어, 이미지 획득에 사용되는 현미경, 화이트 밸런스 또는 색상 밸런싱 알고리즘 사용 등 이미지 간 차이가 있을 경우 부적절합니다. 이 목록은 전부가 아닙니다. AmScope T390B-3M 현미경과 호환 가능한 카메라, 소프트웨어, 어두운 방에서 최대 현미경 조명, 자동 화이트 밸런스 설정을 사용하고, 3명의 환자를 포함하는 10장의 무작위 40배 이미지를 사용하면, 임계값은 96-182 범위, 평균 137이었습니다. 이 넓은 범위는 사용자 불일치가 아니라 기본 8비트 히스토그램의 차이를 반영합니다. 따라서 원본 이미지와 임계값 이미지 간의 시각적 충실도를 보장하는 것이 필수이며, 임계값의 정확한 수치는 아닙니다. 이 과정을 자동화하는 것은 일반적인 벤치 과학자의 범위를 벗어나 이미지 분석 전문가의 프로그래밍이 필요합니다.
    10. 세포 크기 8-150 μm2의 입자 분석(Analyze Particles, 분석 → 분석)을 사용하여 세포 수의 대리 원자핵을 식별하고 계수하세요. 설정에서 오버레이 마스크를 선택하여 식별된 셀을 시각화하고, 다시 원본 이미지와 비교하세요. IntL은 주로 선형 구조이기 때문에, 이 100 μm 길이의 IntL 길이를 정규화하세요(예: #cells/100 μm). 이는 신선히 채취된 활막 조직에서 100 μm당 약 13.19(범위 5.4-21.9, SD 3.9)의 세포를 평균 수치한 결과입니다.
      참고: 8-150 μm2 범위는 Set Scale과 임계값 이미지와 원본 이미지의 반복 시각적 비교를 바탕으로 결정되었습니다. 데이터셋을 통해 경험적으로 결정된 한계는 대식세포 직경이 약 8-20μm 범위일 수 있다는 형태 가정에 해당합니다. 더 큰 크기는 여러 개의 이산 핵이 하나의 세포로 읽히는 경우가 많아 제외되었습니다.
      참고: 유사한 워크플로우가 예를 들어 QuPath에서도 구축될 수 있습니다.
    11. 적혈구를 제외한 SubL 마스크를 열어(그림 4G). 3.3.9-10 단계에서 언급한 8비트 변환, 임계값, 그리고 입자 분석을 수행합니다. SubL은 체적층이므로, 세어진 셀 수를 100 μm2 의 SubL 면적(예: 마스크가 없는 영역 측정)으로 정규화합니다(그림 4H).
  4. 하단 웰에서 이동 세포의 유동 세포 분석을 위해, 300 x g 원심분리기에서 4 °C 10분간 원심분리하고 세포 펠릿을 얼음 위에 보관합니다. 3mm 생검 코어당 24시간에 ~20,000개의 살아있는 이동 세포가 나타날 것으로 예상됩니다. 유세포검사 방법은 이전에 발표된 바있습니다.
  5. ELISA의 경우, 최대 속도(>5000 x g)로 4°C에서 5분간 원심분리하여 세포나 세포 이물질을 펠릿으로 제거합니다. 원하는 온도로 보관하세요. ELISA 방법은 이전에 발표된 바있습니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

산소 배양 조건 최적화

생리학적 조직 관류는 약 6%-8%의 산소이며, 세포 배양의 표준 배양 조건은 대기 중 산소 수준(~21%)입니다16. 비교하자면, 과산소 공급은 세포 배양 생존율을 높이거나 독성이 있을 수 있습니다. JSAS의 적절한 활용은 활막 조직의 생존 가능성을 조기에 판단하는 것을 필요로 했으며; 따라서 세포자살사는 0일, 1, 2일, 3일, 5일, 7일에 생리적 산소(5% O2), 대기/표준 산소(21% O2), 고산소(50% 산소2) 3일차에서 카스파제-3 면역조직화학 또는 면역형광 검사로 평가되었습니다. 아폽토시스는 표준 잠복 조건에서 3일째에 시작되어 5일째에 정점을 찍었습니다. 고산소 및 저산소 상태 모두에서 세포자국 세포 사멸은 1-2일에 시각화되었으며, 5일째에 정점에 달했습니다...

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토론

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이 연구는 JSAS 능력, 특히 온전하고 기능적으로 반응하는 낙막 구조를 가진 살아있는 滑막 조직의 유지 능력을 입증했습니다. 대부분의 인큐베이션 조건에서 72시간 배양 동안 세포 사멸이 최소한이었습니다. 활막 구조의 미세한 변화를 평가하기 위해, IntL과 SubL의 구조적 변화를 정량화하는 독특한 조직학적 측정 시스템이 기술되었다. 이러한 변화는 급성 또는 급성 만성 시활염을 나타냅니다. 이 정량화는 전통적인 분류 체계가 림프구 침윤과 장기 경로에 의존하기 때문에 세포 기전적 분석과 결합될 때 특히 유용할 수 있습니다. 조직 간 조직형태측정과 ELISA 결과는 일관성이 있었으며, 거의 50명의 환자를 비교하기 위해 결과를 정규화할 필요가 없었습니다. 재현 가능한 조직형태측정 외에도 JSAS는 면역조직화학, 유세포분석, ELISA를 수행할 수 있습니다. 여기서 시험하지는 않았지만, 분명히 유용한 방법은 대량 qPCR, 단세포...

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공개 사항

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이해 상충은 없습니다.

감사의 글

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이 프로토콜은 조직을 기증해 주신 환자분들의 관대함과, 안전하게 조직을 확보하려는 정형외과 동료들의 기술 없이는 불가능했을 것입니다. K.I.C.는 NIAMS K08 AR084605의 지원을 받으며, C.P.P.는 재향군인 경력 개발 프로그램[IK2BX004532]의 지원을 받고 있습니다. 이 그룹은 아이오와 대학교 연구 부총장이 지원하는 핵심 자원인 아이오와 대학교 중앙 현미경 연구 시설과 카버 의과대학의 사용을 인정합니다. 유세포검사 데이터는 아이오와 대학교 카버 의과대학/홀덴 종합암센터의 핵심 연구 시설인 유세포검사 시설에서 수집되었습니다. 이 시설은 이용료와 카버 의과대학, 홀든 종합 암 센터, 아이오와 시티 재향군인 의료 센터의 관대한 재정 지원을 통해 운영됩니다. 본 출판물에 보고된 연구는 다음과 같은 지원을 받았습니다: 국립보건원(NIH) 국립연구자원센터(National Center for Research Resources)의 지원 제1 S10 OD034193-01; 국립보건원(NIH) 산하 국립암연구소(National Cancer Institute)에서 수여 번호 P30CA086862.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 cm Petri dishesCorningCLS430167
23srRNA RNAscope probeACD/Biotechne468211
24 well platesLife Sciences3524
3 mm biopsy punchesIntegra12460406
50 mL conicalsN/A
70% ethanol (for sterilization)N/A
Borrelia burgdorferiATCC35210 최대 병원성을 위해 만기 지수 단계에서 사용되어야 함
BSK-HSigma-AldrichB8291
CD68 항체Invitrogen14-0688-821:1000
CO2 tank (standard conditions)N/A
Dulbecco's Phosphate buffered saline (Ca-/Mg-)Thermofisher14190144
fetal bovine serumBiotechneS11150열 활성화 로트: F22100
forceps (non-toothed)N/A
hemostatN/A
Humidified cell incubator (standard conditions)N/A
Hypoxia incubatorN/A
hypoxia tank (5% O2, 5% CO2, remainder N2, physiologic conditions)N/A
IL-4 항체ThermofisherMA5-424701:100
iNOS 항체ThermofisherPA1-0361:100
Iris scissorsN/A
LipopolysaccharideSigma-AldrichL2630
low glucose DMEM (+Sodium pyruvate, +L-glutamine)Life Technologies11885084
MMP9 항체ThermofisherMA5-327051:1000
Modular incubator chamber (hyperoxic conditions)Emrbient, IncMIC-101
Monocyte chemoattractant protein 1Peptrotech300-04-20UG
N-acetyl cysteineSigma-AldrichA9165각 실험마다 신선하게 제조해야 하며 7-7.4 pH의 등몰성 나트륨 탄산염으로 완충
OPG ELISAMilliporeRAB04841:1 희석
Oxygen tank with liter per minute flow regulatorN/A
PDPN 항체Invitrogen14-9381-821:100
Propidium IodideThermofisherJ66764.MC
RNAscope multiplex fluorescent V2 assayACD/Biotechne323100
sRANKL ELISAMyBioSourceMBS2626241:1 희석
Staphylococcus aureus USA 300 MRSAATCCBAA-1717
SYBR GreenThermofisherS756310,000X 스톡
TNF 항체ThermofisherPA5-198101:100
transwell inserts - 0.4 um sizeMillicellPICM01250
transwell inserts - 5 um sizeCorningCLS3421

참고문헌

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