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방법 논문

신생아 마우스 새끼의 구강 개비지와 사용 챔버를 이용한 장 장벽 무결성 기능 평가

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/69751

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2026년 1월 9일

 ,  ,  , 
1INSERM U1149, Center of Research on Inflammation, Université Paris Cité, 2CHRU Nancy, IHU Infiny

이 논문에서

요약

이 논문은 다음을 설명합니다: (1) 신생아 마우스에게 DOL 6 초기부터 경구 개베지 분자를 전달하는 것; 그리고 (2) DOL 10부터 이유기(DOL 20) 새끼 생검에서 Ussing 챔버를 이용한 세포 간 및 세포 간 투과성을 평가하여 대장실 상피 장벽 기능을 체 외 평가.

초록

점점 더 많은 증거는 생후 첫 1,000일이 장내 미생물군 축을 형성하는 데 얼마나 중요한지 강조하고 있습니다. 이 초기 생애 시기는 장기적인 생리적 궤적과 면역학적 적응을 확립하는 데 매우 중요하며, 이는 불생물 및 장벽 기능 장애와 관련된 질병에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있습니다. 기전의 기전을 더 깊이 이해하려면 신생아 장의 세포 간 및 세포 간 투과성을 포함한 주요 생리학적 매개변수를 포괄적으로 평가해야 합니다. 이러한 지표를 평가하는 것은 조기 외부 분자 노출이 장의 완전성과 장기 건강 결과에 어떤 영향을 미치는지 밝히는 데 필수적입니다. 따라서 이 글의 첫 부분에서는 생애 당일부터 관심 있는 분자를 경구 투여하는 방법을 설명하며, 스트레스, 부상 위험, 식인 행위를 최소화합니다. 윤활되고 둥근 끝의 24G 급식 바늘은 최소 2.5g 이상의 새끼를 게이깅하는 데 사용됩니다. 두 번째 부분은 DOL-10부터 이유 시기까지 새끼의 대장 샘플에 대해 Ussing 챔버 분석을 이용한 외부 세포 및 세포 간 투과 성 평가를 개괄합니다. 핀리스 슬라이더는 소규모 생검에 적합하며, 신생아 대장 샘플을 장착하기 위해 Ussing 챔버와 함께 사용됩니다. 세포 측 프로브 FITC-Dextran 4 kDa와 세포 간 마커인 고추냉이 과산화효소 44 kDa 타입 VI가 검사 시작 시 시스템의 최첨단 구획에 추가됩니다. 샘플은 0분, 30분, 60분, 90분, 120분에 기저외측 구획에서 채취되어 프로브 통과 속도를 정량화합니다. 두 마커의 통과는 플레이트 리더에 의해 직접(FITC)와 간접(HRP)으로 정량화되며, 표준 곡선을 사용해 플럭스로 표현합니다.

서론

장 장벽의 완전성은 점막 면역 반응을 조정하고 장 상피의 선택적 투과성을 조절함으로써 전반적인 건강 유지에 근본적인 역할을 합니다. 이 장벽 시스템은 영양분의 통과를 조절하면서 병원체, 항원, 독소가 전신 순환으로 이동하는 것을 방지합니다. 이 경계면의 만성적인 장애, 즉 장 투과성 증가와 관련된 '장누수'는 이제 결과일 뿐만 아니라 만성 염증 상태와 다양한 장외 병리의 원인으로 확인되고 있습니다2.

예를 들어, 장 장벽 기능 저하가 염증성 장질환(IBD), 소아 특발성 관절염(JIA), 제1형 당뇨병(T1D)과 같은 자가면역 및 대사 질환의 핵심 요소임이 밝혀졌습니다. 이는 장 장벽 상태를 주요 생체지표로 강조할 뿐만 아니라, 병태생리학적 과정의 시작을 가능한 한 조기에 예방하고 급성 염증이 만성 상태로 진행되는 것을 막는 치료 표적임을 강조합니다. 3,4,5,6.

이 맥락에서 신생아기는 장-미생물 인터페이스의 형성과 성숙이 평생 장내 및 전신 건강에 깊은 영향을 미치는 독특하고 매우 민감한 발달 시기를 의미합니다. 이 초기 단계에서 장 상피와 면역계는 내인성 및 외인성 인자 모두에 대해 민감도가 높아지며, 빠른 성장과 분화를 겪는 동시에 미생물 정착과 식이 변화에 적응합니다. 이 중요한 발달 시기에 장 장벽의 무결성을 손상시키는 장애는 이후 급성 및 만성 질환의 다양한 발병에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 이러한 질환에는 음식 알레르기와 같은 면역 매개 질환과 IBD, JIA, T1D같은 더 심각한 만성 질환이 포함됩니다. 이러한 질병들은 병태생리학적 과정이 종종 조기에 기원한다는 점을 강조하며, 주요 발병은 일반적으로 어린 시절과 초기 성인기 사이에 발생한다10,11. 따라서 신생아의 장 장벽 기능을 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 많은 만성 질환의 부담을 줄이기 위한 예방 및 치료 전략을 개발하는 데 필수적입니다.

이러한 맥락에서 장벽의 무결성, 만성 질환 기전, 염증을 신생아 환경에서 연구할 신뢰할 수 있고 생리학적으로 적합한 도구가 시급히 필요합니다. 이러한 도구들은 이미 성인 환경에서 입증된 실험적 분석법을 정확도와 효능을 희생하지 않으면서 재현할 수 있어야 합니다. 또한, 신생아 환경에서 장 항상성에 유익하거나 해로운 영향을 미칠 것으로 예상되는 관심 분자 후보의 단기 및 장기 효과를 조사하는 것이 점점 더 시급해지고 있습니다. 사용 가능한 도구 중 신생아 마우스 새끼에 대한 경구 개베지 투여는 정의된 발달 단계에서 관심 있는 분자를 전달하는 매우 신뢰할 만한 방법입니다. 이 연구는 다양한 생리활성 화합물, 약물 또는 미생물 대사산물이 장내 성숙과 장벽 기능에 미치는 영향을 통제된 연구를 가능하게 합니다.

이 글의 첫 부분에서는 생명의 날 6부터 쥐 새끼를 개깅하는 방법을 설명하여, 먹이 다양화로 인해 장내 미생물군 종이 급격히 증가하기 전후의 개입을 연구할 수 있게 합니다. 따라서 이 기술은 새끼가 성장하고 발달함에 따라 장 건강에 미치는 치료 효과에 대한 종단적 분석을 가능하게 합니다.

이 글의 두 번째 부분에서는 Ussing 챔버를 이용한 대장 상피 장벽 기능의 체외 평가를 통해 투과성 특성에 대한 민감하고 정량적인 측정을 제공합니다. 신생아 마우스(예: DOL 10 새끼)의 대장 생검에서 세포 간 및 세포 간 투과성을 평가함으로써 여러 주요 후보가 상피 장벽의 완전성과 기능에 미치는 영향을 정확히 결정할 수 있습니다. 세포 간 수송은 상피층의 세포 간 공간을 통해 발생하는 본질적으로 수동적 메커니즘입니다. 이 방법은 전기화학적 및 삼투압적 구배에 의해 구동되는 작은 용질이 내면에서 기저외측으로 통과할 수 있게 합니다. 이 메커니즘은 주로 클로딘(claudins)과 옥클루딘(occludin)과 같은 타이트 조결 단백질 계열에 의해 조절됩니다. 반면 세포 간 수송은 능동적 메커니즘으로, 더 큰 용질을 흡수하고 특정 채널, 운반체, 펌프 를 통해 상피세포를 통해 일어납니다.

플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란(4 kDa)은 크기 때문에 주로 세포 측 수송을 하는 반면, 고추냉이 과산화효소(HRP; 44 kDa)는 세포 간 경로를 통해 기저외측으로 선택적으로 전달됩니다. 따라서 이러한 비내인성 마커의 정량화는 각각 세포 간 및 세포 간 투과성을 구분하여 평가할 수 있게 합니다. FITC와 HRP를 이용한 Ussing 챔버 분석은 조직 구조를 보존하고, 장의 모든 구간에서 각각 세포 간 및 세포 간 투과성을 실시간으로 측정할 수 있게 합니다. 신생아 게베지와 우싱 챔버 분석의 결합은 특정 분자가 장벽 기능에 즉각적이거나 장기간 동안 미치는 영향을 연구하는 강력한 전략을 제공하며, 염증을 완화하고 만성 질환을 초기 단계부터 예방하는 전략을 제시합니다.

요약하면, 이 프로토콜은 다음을 가능하게 하는 두 가지 보완적인 실험 절차를 설명합니다: (1) 초기 신생아 시기에 관심 있는 분자를 쥐 새끼에게 투여하는 (1단계); (2) 신생아부터 이유 새끼까지 장관 구간에서 Ussing 챔버를 이용한 para 및 transcellular 투과성 평가(단계 2-6).

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프로토콜

모든 동물 시술은 관련 국가 규정에 따라 수행되었으며, 프랑스 고등교육연구혁신부의 승인을 받 아 APAFIS 플랫폼(승인 번호: APAFIS#23855)과 국립연구청(ANR)의 보조금을 받았습니다: 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152, 18-IDEX-0001. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 신생아 쥐 새끼의 개비지

참고: 다음 방법은 Francis 등12편에서 차용한 것입니다. 원래 프로토콜은 DOL 2부터 쥐 새끼를 개개하는 것을 허용했으나, 이 경우 DOL 6 이전에는 개개가 시행되지 않았는데, 이는 이른 나이의 기술적 요구로 인해 절차가 훨씬 더 어렵기 때문입니다. 또한, 어린 새끼를 사용하면 치료 초기 며칠 동안 동물 손실 위험이 높아져 연구가 복잡해져 더 큰 집단이 필요합니다.

  1. 개비지 솔루션 준비 및 설치
    1. 강아지 개별로 무게를 재세요.
    2. 가비지 용액의 농도와 부피를 조절하여 투여하는 총 부피가 체중 1그램당 20 μL을 넘지 않도록 하세요.
      참고: 표준 조건에서 쥐 새끼는 DOL 6에서 2.5g 미만인 경우가 드뭅니다.
    3. 24G 둥근 팁 급식 바늘은 탈이온수로 깨끗이 세척한 후 주사기로 70% 에탄올을 붓고 오토클레이브로 세척하세요.
      참고: 교차 오염을 방지하기 위해 각 치료 그룹별로 별도의 급식 바늘을 사용하는 것이 권장됩니다.
    4. 깨끗한 종이 타월을 ~38 °C로 맞춘 소독된 온열 패드 위에 올려놓으세요.
    5. 동물 우리를 열기 전에 장갑을 70% 에탄올로 세척하여 새끼에게 냄새가 전달되는 것을 줄이고 식인 위험을 줄이세요.
    6. 암컷을 다른 방의 별도의 우리로 옮겨 강아지들의 울음소리로 인한 스트레스를 줄이세요.
    7. 세척된 장갑에 둥지 재료로 문질러 외부 악취가 새끼에게 전달되는 위험을 줄이세요.
    8. 새끼의 흉골 하단(흉골 하단)과 사이의 길이를 측정하여 먹이 바늘의 최대 삽입 길이를 표시합니다(그림 1A, B).
  2. 쥐 새끼의 식도 내 관도 개귀
    1. 바늘 머리를 멸균된 방식으로 주사기에 연결하고, 필요한 양보다 더 많은 양의 개비지 용액을 뽑아 공기 방울이 생길 위험 없이 필요한 양을 모두 투여하세요. 공기 방울은 흡인 위험을 극적으로 증가시킵니다.
    2. 비우세 손의 엄지와 검지를 사용해 견갑골 사이 피부를 부드럽게 집어 강아지를 들어 올립니다.
      참고: 강아지 등에서 너무 많은 피부를 벗기면 질식할 수 있습니다.
    3. 새끼를 거의 수평에 가까운 자세로 유지한 후 영양 바늘을 구강 안에 부드럽게 삽입하여 인두에 수직으로 밀어 넣어 목구멍 뒤쪽에 도달하게 합니다(그림 1C).
    4. 각도와 깊이를 유지하면서 혀를 피하기 위해 바늘을 구강의 오른쪽이나 왼쪽으로 밀어 넣으세요.
    5. 바늘 각도를 천천히 조절하면서 강아지의 머리를 부드럽게 뒤로 기울여 주사기, 머리, 등이 정렬되고, 머리가 약간 뒤쪽으로 기울어질 때까지 합니다(그림 1D).
    6. 압력을 가하지 않고 주사기가 자신의 무게로 천천히 내려가도록 하여 최대 삽입 지점이 높이에 가까워지거나 도달할 때까지 허용합니다(그림 1E).
      참고: 저항이 있을 경우, 주사기를 손가락 사이에서 앞뒤로 굴려 부드럽게 회전시켜 하강을 원활하게 하세요. 주사기가 여전히 진행되지 않으면 삽입 각도를 조정하거나 가베지 용액이 윤활된 급식 바늘을 사용해 시술을 다시 시작하세요. 질식을 방지하기 위해 바늘은 20초 이상 꽂혀 있지 않아야 합니다.
    7. 최대 삽입 지점에 도달하거나 가까워지면 원하는 양을 빠르게 분배하세요. 용량을 분사할 때 저항이 발생하면 주사기-헤드-백 정렬을 확인하고 삽입 깊이를 약간 조절하세요.
      참고: 바늘을 장시간 삽입하면 질식, 몸부림, 동물 부상 위험이 크게 증가하므로 빠른 투여가 권장됩니다.
    8. 적절한 양을 투여하면, 삽입 시 사용하는 각도로 바늘을 부드럽게 빼세요.
    9. 강아지를 이전에 올려둔 종이 타월 위에 올려놓고 회복 상태를 관찰하세요. 정상적인 호흡 패턴은 20초 이내에 돌아올 것입니다.
      참고: 동물의 코 또는 입에서 거품이 나오는 것은 흡인을 의미하며, DOL 14 미만의 새끼는 즉각적인 안락사가 필요합니다. 구인두와 식도 사이에 병변이 생겨 동물 입 안에 아주 적은 양의 혈액이 존재하면 동물의 모니터링이 필요하지만, 체계적인 안락사는 필요 없습니다. 강아지 회복이 불확실하다면 옆으로 눕히세요. 스스로 바로잡으려 하지 않으면 즉시 안락사하세요.
    10. 동물의 회복이 확인되면 새끼를 다시 둥지에 넣고 어미와 함께 다시 모이세요.
      참고: DOL 10까지는 강아지들이 움직임이 적어 케이지 안의 모든 강아지가 배정될 때까지 온열 패드 위에 머물 수 있습니다. 나이가 많은 강아지는 패드에 혼자 두면 안 되며, 탈출을 시도할 수 있습니다.

그림 1
그림 1: DOL 10에서 신생아 쥐 새끼의 개베이지. 주둥이와 외측돌기(xyphoid process) 사이의 거리를 측정하여 먹이 바늘에 최대 삽입 길이를 표시할 수 있게 합니다(B). 급식 바늘은 구강의 왼쪽 또는 오른쪽 부위(C)에 삽입됩니다. 목 뒤쪽에 도달하면 주사기, 머리, 동물의 등(D)이 정렬될 때까지 바늘의 각도를 조절합니다. 바늘은 저항 없이 부드럽게 아래로 미끄러지도록 허용하며, 최대 삽입 지점에 거의 도달하거나 (E)에 도달합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 신생아 쥐 새끼 안락사 및 대장 채취

  1. 국가 법률이 요구하는 적절한 방법으로 안락사를 수행하십시오.
    참고: DOL 10 이하의 새끼는 참수하고, DOL 10보다 높은 연령의 새끼는 경추 탈구를 권장합니다. CO2나 마취제를 사용한 안락사는 권장되지 않으며, 강아지들은 이러한 방법에 대한 내성이 매우 강합니다.
  2. 안락사된 동물을 쌍안경 현미경 아래에 놓으세요.
  3. 동물의 복부에 70% 에탄올을 바르세요.
  4. 겸자를 사용해 복부 피부와 그 아래 복막을 꼬집고, 장을 절단하지 않고 앞尾축에 수직인 가위로 큰 횡복부 절개를 합니다.
  5. 가위를 부드럽게 절개 부위에 넣고 양쪽 복막을 따라 측면으로 상처를 확장합니다.
  6. 겸자와 가위를 사용해 흉부 부위에서 하부 골반까지 복막의 상부와 하부 부위를 모두 절단합니다(그림 2A).
  7. 대장의 원위 부분을 확인하고 축과 평행하게 직장 쪽으로 절개를 하세요.
  8. 대장의 말단/직장 부위에 절개를 해서 움직이세요.
  9. 대장을 부드럽게 당기고 맹장 쪽으로 진행하면서 결합 조직이나 지방 조직의 일부를 제거하세요.
  10. 장장을 복부에서 분리하여 맹장 위 회미골 접합부를 절단합니다(그림 2B).
  11. 맹장과 근위 결장의 초기 몇 밀리미터를 버리고, Ussing 슬라이더의 개구 크기보다 큰 근위 결장에서 1에서 2개의 샘플을 수집합니다(그림 2C).
    참고: 신생아 대장은 매우 약해 세척 및 장착 중에 쉽게 찢어지거나 찢어지거나 관통될 수 있으므로 과도한 크기의 생검 두 개를 확보하는 것이 권장됩니다.
  12. 가위를 닫은 상태에서 가볍게 압박하고 근위부에서 원위 쪽으로 미끄러지듯 대변 물질을 부드럽게 제거합니다.
  13. 비워진 대장 조각을 얼음처럼 차가운 KRB 버퍼에 넣습니다.

그림 2
그림 2: DOL 10 새끼의 대장 해리. 강아지의 표피와 복막은 결장이 비자발적으로 절개되는 것을 방지하기 위해 두 단계로 절단 및 열어, 복강 전체가 노출될 때까지 진행됩니다(A). 대장은 원위/직장 부위의 첫 번째 절개를 통해 복부에서 분리되고, 그 후 맹장(B) 위쪽에서 두 번째 절개를 합니다. 근위 대장의 초기 밀리미터는 버려지고, Ussing 슬라이더의 개구 크기보다 큰 대장 샘플 1개에서 2개를 수집합니다(C). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 마우스 생검을 이용한 대장 투과성 검사

  1. 분석 준비
    1. 우싱 실험 전날. 최적의 분석 조건을 보장하기 위해 실험 전날 여러 용액을 준비하는 것이 권장됩니다. 이 해법들은 표 1에 지시된 대로 준비됩니다.
      참고: 다음 표는 12개의 Ussing 챔버에 필요한 양을 나타내며, KRB는 10배 초과하여 분할 청구를 가능하게 합니다.
      참고: KRB 10x 용액은 4°C에서 최대 6-12개월 동안 보관할 수 있습니다.
    2. 실험 당일, 동물 안락사 30분 전:
      1. 표 2에 따라 KRB 완충액 400mL를 준비합니다.
        참고: KRB 10x, 탈이온수, 중탄산염은 CaCl2를 추가하기 전에 CaCl2를 넣기 전에 미리 혼합하고 15분간 기포를 만들어야 합니다.
      2. 탄수화물 시스템(95%O2; 5%CO2)을 사용해 신선한 KRB 버퍼를 15분간 버블링합니다.
      3. KRB 버퍼 400 mL를 두 개로 나누어 200 mL의 크렙스-포도당, 200 mL의 크렙스-만니톨, 그리고 표 3에 설명된 HRP 용액을 준비합니다.
    3. 시스템 설정
      1. 유싱 시스템을 37 °C로 예열하세요.
      2. 챔버를 다음과 같이 미리 조립하세요:
        1. 각 슬롯의 걸쇠를 들어 올려.
        2. 시스템을 조이지 않고 챔버를 슬롯에 넣으세요.
        3. 두 개의 가스 공급 튜브를 각 구역에 삽입하세요.
        4. 앞쪽 구멍에 네 개의 전극을 삽입하거나(가능하다면, 여기서는 다루지 않음) 실험 전에 접착제를 채운 200 μL 콘으로 네 개의 구멍을 밀봉하세요.
        5. 잠재적 누수를 대비해 챔버 아래에 트레이를 놓으세요.
      3. 조직 마운팅
        1. 이전에 세척한 대장 샘플을 종이 타월로 가볍게 말려 과도한 수분을 제거하세요.
        2. 대장 조각을 돋보기 아래에 놓고, 아주 조심스럽게 가위 날을 루내기 부분에 삽입해 칼을 열어 열어줍니다(그림 3A).
          참고: 가위가 완전히 삽입되면 한 번에 절단할 수 있습니다. 사용되는 대장 절편은 비틀림을 피하면서도 최대한 곧게 펴야 합니다.
        3. 가는 겸자를 사용해 조직을 슬라이더의 흰색 부분에 고정시키고, 하루내르 부분은 조작자 쪽으로 위로 유지합니다. 조직에는 지방, 배설물, 주름, 천공, 열상이 전혀 없어야 하며, 구멍을 넓게 덮어야 합니다(그림 3B).
        4. 쌍안현미경 아래 슬라이더를 닫고 조직의 잠재적 위치 이동 여부를 확인하세요. 슬라이더에 압력을 가할 때 조직의 약간의 변형이 보여야 하며, 이는 슬라이더가 단단히 닫혀 있음을 나타냅니다.
          참고: 샘플 탈수를 방지하기 위해 슬라이더를 Ussing 챔버에 설치하고(그림 4), 준비가 되면 즉시 개별 평형 단계를 시작하세요.
        5. 슬라이더를 닫아두기 위해 가볍게 압력을 유지한 상태에서, 슬라이더를 우싱 챔버에 삽입하여 루멘(투명한 슬라이더 부분)이 왼쪽을 향하도록 합니다.
        6. 두 걸쇠를 모두 닫고 오른쪽에 있는 나사를 챔버가 밀폐되어 슬라이더가 움직이지 않을 때까지 조이세요.
      4. 최종 설정 및 밸런싱
        1. 방의 왼쪽(끝부분) 구획에 크렙스-만니톨 4mL를 추가하세요.
        2. 방의 오른쪽(기저측) 구획에 4mL의 크렙스-포도당을 추가하세요.
        3. 교차 오염을 방지하기 위해 두 구획 사이에 작은 파라필름 조각을 놓으세요.
        4. 가스 흡입구(95% 산소2 / 5%CO2)를 열고 출력을 1-2 버블/초 사이로 설정하세요.
        5. 조직이나 시스템 내에 있는 큰 기포는 파스퇴르 피펫을 사용해 제거하세요.
        6. 시스템을 최대 20-30분 정도 밸런스팅하세요.
        7. 표 4에 설명된 FITC 4kDa + HRP + 만니톨 용액을 준비합니다.
  2. 대장 투과성 분석 시작
    1. 시스템이 평형에 도달하면, 왼쪽 끝 구획에서 200 μL 크렙스-만니톨을 FITC 4Kd + HRP + 만니톨 용액 200 μL로 교체하고 즉시 타이머를 시작합니다. 구획 안에서 부드럽게 위아래로 움직이며 끝부분을 세척하고, 각 챔버 사이에 끝을 버리세요.
    2. 각 챔버별로 기저(오른쪽) 구획에서 2개의 100 μL(중복)를 수집하여 검은색 96웰 플레이트에 부피를 보관합니다. 플레이트 내에 존재하는 FITC의 광열화를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 덮으세요.
    3. 즉시 이전에 채취한 200 μL를 200 μL 신선한 크렙스-포도당으로 교체하세요.
    4. 2단계와 3단계를 30분마다 반복하여 2시간 시간 지점에 도달하면 시간점: T0, T30, T60, T90 , T120을 얻습니다.
    5. 판을 알루미늄 호일로 밀봉하여 FITC의 광열화를 방지하고 FITC 정량화를 진행하세요.
MgCl2 1M
MW (g/mol)최종 부피 = 20 mL최종 집중
밀리-Q H2O최종 권으로 가져갑니다
MgCl2, 6H2O203.34.066 g1 M
KRB 10X
MW (g/mol)최종 권 = 1L최종 집중
밀리-Q H20최종 권으로 가져갑니다
나클58.4470g1.198 M
KCl74.553.4g45.6 mM
Na2HPO4 , 2H2O177.991 g5.62 mM
NaH2PO4 , 2H2O156.012.3g14.7 mM
MgCl2 1M5 mL5 mM
중탄산염 750 mM
MW (g/mol)최종 부피 = 250 mL최종 집중
밀리-Q H2O최종 권으로 가져갑니다
NaHCO38415.75 g750 mM
CaCl2 2M
MW (g/mol)최종 부피 = 50 mL최종 집중
밀리-Q H2O최종 권으로 가져갑니다
CaCl211111.098 g2 M

표 1: Ussing 실험 전날의 용액 준비.

KRB 버퍼 (400 mL)
볼륨최종 집중
KRB 10X40 mL1배
H2O (밀리-Q)352 mL
중탄산염 750 mM8 mL15 mM
CaCl2 2M240 μL1.2 mM

표 2: Ussing 실험 당일의 KRB 완충 준비 과정.

크렙스-포도당/만니톨 (각각 200 mL)
최종 부피 = 200 mL최종 집중
KRB 버퍼최종 권으로 가져갑니다
포도당360mg10 mM
또는
만니톨364mg10 mM
HRP 솔루션
최종 부피 = 1480 μL최종 집중
크렙스-만니톨최종 권으로 가져갑니다
HRP13mg8.8 mg/mL

표 3: 우싱 실험 당일 크렙스-포도당/만니톨 및 HRP 용액 준비 결과.

FITC 4kDa + HRP + 만니톨 솔루션
12개의 챔버볼륨최종 집중
HRP (8.8mg/ml)1345 μL
크렙스-만니톨1155 μL
FITC 4Kd166.6 mg16.66 mM

표 4: 유싱 실험 당일 FITC 4 kDa + HRP + 만니톨 용액 준비 과정.

그림 3
그림 3: DOL 9 새끼의 대장 샘플 장착 모습. 가늘한 가위 한 쌍의 한 날을 시료의 하루날(luminal segment)에 삽입하여 한 번의 움직임(A)으로 절단합니다. 개봉된 샘플은 루미날 면이 조작자(B)를 향하도록 Ussing 슬라이더 조리개에 장착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4
그림 4: 완전히 준비된 우싱 챔버 사진. 이 도표의 확대판을 보려면 여기를 클릭하세요.

4. FITC 정량화를 통한 대장 세포 준투과성 평가

  1. FITC 표준 준비
    1. 표 5와 그림 5에 설명된 표준 희석액을 만들기 위해 FITC 4Kd + HRP + 만니톨 용액을 크렙스-포도당에 희석합니다.
    2. n°1부터 n°7까지 각 표준 희석액을 2x100μL(복제)를 판에 증착합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 밀봉해 빛으로부터 보호하세요.
  2. 데이터 수집: 플레이트 리더기를 사용해 여기 파장을 485nm, 방출 파장을 535nm로 설정한 후 가능한 한 빨리 플레이트를 읽습니다.
    참고: 플레이트를 최적 이득과 수동 설정 게인 모두에서 읽는 것이 판 간 값 비교를 용이하게 하고, 표준 희석 중 오류가 발생했을 때 데이터 보간을 가능하게 하는 것이 권장됩니다.
  3. 플레이트 보관: FITC 정량화 데이터가 저장된 후, HRP 정량화를 다음 날에 실시할 경우 알루미늄 호일로 4°C에 하룻밤 동안 밀봉한 채 보관하거나, 장기간 보관을 위해 -80°C에서 냉동하세요.

그림 5
그림 5: FITC 표준 희석 준비의 시각적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

FTIC 표준 희석
번호1234567
희석FITC 스톡 해의 1:10000희석 1:1의 1:2희석 2번의 1:2희석 1:10희석 n°4의 1:2희석 5번의 1:2
크렙스-포도당
FITC (μM)1.660.830.4150.1660.0830.04150

표 5: Ussing 실험 당일 FITC 표준 희석액 준비 결과.

5. HRP 정량화를 통한 대장 간 투과성 평가

  1. HRP 정량 분석일 전날:
    1. 분석 당일에 최적의 조건을 확보하고; 실험 전날에는 여러 용액을 준비해야 합니다. 이 해법들은 표 6에 설명된 대로 준비됩니다.
      참고: 다음 표는 96웰 플레이트 한 장에 필요한 양을 나타냅니다. HRP 표준은 -20°C 또는 -80°C에서 최대 수개월간 보관할 수 있습니다. 불안정성 때문에 신선한 탄산염/중탄산염 완충제만 사용하세요.
    2. 항HRP 항체 용액을 준비하면 즉시 Clear 96-웰 Clear Flat Bottom High Binding 마이크로플레이트에 웰당 100 μL을 코팅합니다. 알루미늄 호일로 감싸고 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
  2. HRP 정량 분석일 당일:
    1. 표 7에 설명된 5% BSA 차단 버퍼를 준비합니다.
    2. 접시의 내용을 버리고 280 μL PBS 트윈으로 4회 세척하며, 각 세척 사이에 350rpm으로 1분간 흔듭니다.
    3. 각 웰에 200 μL BSA 차단 버퍼를 추가하세요.
    4. 알루미늄 호일로 플레이트를 밀봉하고 셰이커에서 500rpm 최소 1시간 동안 인큐베이팅하세요. 그동안 샘플을 해동하고 희석(1:10 또는 1:50)한 뒤, 표 8에 설명된 표준 희석액을 준비합니다.
    5. 접시의 내용을 버리고 280 μL PBS 트윈으로 4회 세척하며, 각 세척 사이에 350rpm으로 1분간 흔듭니다.
    6. 표준 또는 희석된 샘플 50 μL을 추가하고 플레이트를 밀봉한 후 300rpm에서 1시간 동안 RT 배양합니다.
    7. 배양 중에는 QuantaBlu 시약을 RT로 가져가 표 9에 설명된 작동 용액을 준비합니다.
    8. 접시의 내용을 버리고 280 μL PBS 트윈으로 4회 세척하며, 각 세척 사이에 350rpm으로 1분간 흔듭니다.
    9. 각 우물에 100μL QuantaBlu 작업 용액을 RT 또는 37 °C(평균 1.5-90분, 30분)에서 추가합니다.
      참고: 분석 진행 상황 후에는 자외선 아래에서 강한 파란색 형광이 나타날 수 있습니다.
    10. 각 웰에 100 μL QuantaBlu Stop Solution을 첨가하여 과산화효소 활성을 차단합니다. 플레이트를 밀봉하고 RT에서 350rpm 교반 상태로 10분간 배양합니다.
    11. 플레이트 리더기를 사용해 여기 파장을 315 nm, 방출 파장을 470 nm로 설정합니다. 가능한 빨리 판을 읽어.
      참고: 플레이트를 최적 이득과 수동 설정 게인 모두에서 읽는 것이 판 간 값 비교를 용이하게 하고, 표준 희석 중 오류가 발생했을 때 데이터 보간을 가능하게 하는 것이 권장됩니다. QuantaBlu 플루오로생성 과산화효소 기질(Fluorogenic Peroxidase substrate) 키트 대신 테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidinine)과 같은 다른 과산화효소 기질을 사용할 수 있으나(각각 450 nm 또는 650 nm에서 스톱 솔루션 사용 여부 사용 여부 적용), 이 대안을 사용할 경우 감도가 낮아집니다.
BSA 솔루션
MW (g/mol)최종 부피 = 12.7 mL최종 집중
밀리-Q H2O최종 권으로 가져갑니다
BSA664301.27 g100 mg/mL
크렙스-포도당 + BSA
MW (g/mol)최종 부피 = 30 mL최종 집중
크렙스-포도당최종 권으로 가져갑니다
BSA 솔루션60 μL0.2 mg/mL
PBS 트윈
MW (g/mol)최종 부피 = 500 mL최종 집중
PBS 1X최종 권으로 가져갑니다
트윈-20500 μL0.1%
탄산나트륨 솔.
MW (g/mol)최종 부피 = 3.22 mL최종 집중
밀리-Q H2O최종 권으로 가져갑니다
나,2, CO3105.9934.13 mg0.1 M
탄산수소나트륨 솔.
MW (g/mol)최종 부피 = 12.7 mL최종 집중
밀리-Q H2O최종 권으로 가져갑니다
NaHCO384106.68mg0.1 M
코팅 버퍼 pH 9.6
최종 용량 ≈ 11 mL
탄산나트륨 솔.2.58 mL
탄산수소나트륨 솔.pH = 9.6 (~8.4 mL) 때까지 첨가합니다.
10 μM HRP 표준
초기 집중최종 부피 = 5 mL최종 집중
크렙스-포도당최종 권으로 가져갑니다
HRP 솔루션8.8 mg/mL50 μL0.088 mg/mL
BSA 솔루션100 mg/mL10 μL0.2 mg/mL
1.5 nM HRP 표준
초기 집중최종 부피 = 15 mL최종 집중
크렙스-포도당최종 권으로 가져갑니다
2.0 μM HRP 표준0.088 mg/mL2.25 μL13.2 ng/mL
BSA 솔루션0.2 mg/mL3 μL40 ng/mL
항HRP 항체 용액
초기 집중최종 부피 = 10 mL최종 집중
코팅 버퍼최종 권으로 가져갑니다
항HRP 항체5.6 mg/mL8.93 μL5 μg/mL

표 6: HRP 실험 전날의 용액 준비.

BSA 차단 버퍼
초기 집중최종 부피 = 25 mL최종 집중
PBS 1X12.5 mL
BSA 솔루션100 mg/mL12.5 mL50 mg/mL

표 7: HRP 실험 당일 BSA 차단 완충 준비.

표준크렙스-포도당 + BSA1.5 nM HRP 표준Fmol HRP/50 μL
공백1000 μL0 μL0
1993.75 μL6.25 μL0.09375
2987.5 μL12.5 μL0.1875
3975 μL25 μL0.375
4950 μL50 μL0.75
5900 μL100 μL1.5
6850 μL150 μL2.25
7800 μL200 μL3
8700 μL300 μL4.5
9600 μL400 μL6
10400 μL600 μL9
11200 μL800 μL12

표 8: HRP 실험 당일의 HRP 표준 준비 상태.

퀀타블루 작동 솔루션
최종 부피 = 12 mL
QuantaBlu 기판 솔루션10.8 mL
퀀타블루 안정 과산화물 용액1.2 mL

표 9: HRP 실험 당일의 QuantaBlu 작업 용액 준비.

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결과

표준 곡선 및 우물 농도 정량화
판의 모든 웰에서 빈 칼의 평균 값이 차감되었습니다. 흡광도는 Y축에, 농도는 X축에 표시하여, GraphPad Prism의 "표준 곡선 보간" 기능을 사용해 표준 곡선을 만들었습니다. 모든 표준 점이 정렬되어 있을 경우, "선" 모델이 가장 좋은 결과를 제공합니다. 또는 "시그모이드, 4 PL, X는 집중" 모델은 비선형 표준 곡선 보간법으로 매우 유연하고 정확합니다(그림 6). Y축에 있는 샘플의 흡광도는 표준 값 아래에 붙여넣어, 결과 탭(그림 6)의 "보간된 X 평균값"에서 농도를 복원했습니다.

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토론

경구 개비지는 개별 신생아 쥐에게 정확하고 정의된 루미날 용량을 반복적으로 투여할 수 있게 합니다. 반면, 자발적 급식은 실용적인 대안이긴 하지만, 동물당 투여 시간이 더 길어지면서 복합물 양을 줄이고, 투여 정밀도가 낮아집니다. 더불어, 경구 가비지는 주사 경로보다 더 많은 용량을 수용할 수 있어, 낮은 농도에서 더 높은 총 용량을 투여할 수 있고, 투여 시 잠재적 독성을 최소화합니다. 소화관을 통한 통과는 화합물의 분포 부피를 더욱 제한하여, 장 투과성 및 장벽 기능을 표적으로 하는 연구에 유리합니다. 하지만 독성은 발달 시기와 분자 클래스에 따라 크게 달라집니다; 따라서 신생아 환자에게 처음 치료를 시행할 때는 주의가 필요합니다. 신생아 새끼의 개비지는 특히 DOL 10 미만의 강아지에게는 훈련이 필요한 섬세한 절차입니다. 진한 식용 색소가 포함된 PBS 훈련이 ...

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 ANR-11-IDEX-0005-02 우수 연구소 INFLAMEX의 재정 지원, Fondation de l'avenir(2025, AP-RM-24-012), ANR 보조금인 Diab1GUT(ANR-24-CE15-7152)의 재정 지원을 받아 수행되었습니다. 이 연구는 INFIBREX 컨소시엄의 맥락 내에서 수행되었으며, 프랑스 정부가 시작하고 파리 시티 대학교가 "우수성 이니셔티브" IdEx 프로그램(ANR-18-IDEX-0001)에 따라 시행한 "프랑스 2030" 투자 계획의 지원을 받았습니다. 염증 연구 센터의 우싱 챔버 기술 플랫폼의 귀중한 지원에 감사드리며, 전문적인 도움을 준 알렉산드라 윌렘츠와 모드 르 갤에게 특별한 감사를 전합니다. 염증 연구 센터의 동물 시설 플랫폼에도 진심으로 감사의 뜻을 전하며, 특히 이자벨 르노와 기욤 앙셀메에게 특별한 감사를 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10편의 DPBS 무첨가 MG덜베코스14200091
항HRP 항체노르딕 바이오사이트GTX10183단클론 마우스 고추냉이 과산화효소 IgG [2H11]
쌍안경 루페올림푸스 SZ61사양은 필요 없습니다.
검은색 96웰 플레이트 평면 바닥서모피셔 사이언티픽137101플레이트는 반드시 검은색이어야 하며 형광 측정에 맞게 조정되어야 합니다. 읽을 때는 뚜껑을 열어야 합니다.
BSA머크A4503
C57BL/6J 마우스찰스 강632C57BL/6J 
CaCl2머크2382
클리어 96웰 클리어 플랫 바텀 하이 바인딩코닝9018
D-(+)-포도당머크G8270 
증류된 수<서브>2O
D-만니톨머크M4125
미세 겸자FST11445-12
파인 가위FST14058-09
FITC-덱터른 4KdFD4TdB 연구소광분해에 민감합니다.
온열 패드미네르브20 031 01
HRP머크P8375
MgCl2, 6H2O머크M2670 
밀리-Q H2O
P2300 이지마운트 유싱 시스템 및 회의실생리학적 기구EM6-C-CE시스템, 챔버, 슬라이더가 모두 호환되어야 합니다.
P2306 우싱 챔버 슬라이더생리학적 기구PI-P2306크기와 형태에 따라 다양한 슬라이더 모델이 제공됩니다.
QuantaBlu 플루오로생성 과산화효소 기질 키트서모피셔 사이언티픽15169
원형 팁 재사용 공급 바늘FST18061-2424 게이지, 팁 직경 1.25mm, 둥근 팁. 사용 전에 멸균수, 에탄올 70%로 세척하고 오토클레이션을 해야 합니다.
중탄산나트륨머크S6297
탄산나트륨머크S7795
분광광도계테칸 스파크 10M137101 검은색 판을 사용할 경우 상단 획득 기능이 있는 판 독자가 필요합니다.
트윈-20머크P7949

참고문헌

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